專利名稱：香石竹莖尖超低溫保存及植株再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物種質(zhì)資源保存的方法，尤其是香石竹莖尖玻璃化超低溫保存的方法，屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香石竹(Dianthus caryophyllus)，又名康乃馨，為石竹科石竹屬的多年生宿根性 草本植物，是世界著名的鮮切花之一，也是云南省最主要的大宗出口花卉之一。目前對(duì)香石竹種質(zhì)資源的保存主要采用田間保存法和組織培養(yǎng)保存法，田間保存 法易受病蟲害的侵襲和惡劣環(huán)境的威脅，組織培養(yǎng)保存法因長(zhǎng)期離體培養(yǎng)需多次繼代，不 可避免地引起某些遺傳性狀的改變。超低溫保存是植物種質(zhì)保存的理想途徑，自從1973年Nag和Street首次成功地 用液氮超低溫保存了胡蘿卜懸浮細(xì)胞后，迄今進(jìn)行超低溫保存的植物材料已達(dá)兩百余種。 兩步法和預(yù)凍法等多種超低溫保存技術(shù)也逐步發(fā)展起來，但這些傳統(tǒng)的超低溫保存方法操 作繁瑣耗時(shí)，并且需要程序降溫儀等設(shè)備，因此這些方法的普遍推廣使用仍存在不少困難。近年來，發(fā)展較快的玻璃化法超低溫保存具有設(shè)備要求簡(jiǎn)單、材料處理步驟簡(jiǎn)便、 效果和重演性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想的植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存方法，尤其適合 組培物和莖尖培養(yǎng)物的保存，已經(jīng)成功應(yīng)用于幾十種植物的莖尖保存。

發(fā)明內(nèi)容
為解決田間保存法易受病蟲害的侵襲、組織培養(yǎng)保存法易引起某些遺傳性狀的改 變及傳統(tǒng)超低溫保存方法操作繁瑣耗時(shí)等問題，本發(fā)明提供一種香石竹莖尖超低溫保存及 植株再生的方法。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種香石竹莖尖超低溫保存及植株再生的方法， 其特征在于經(jīng)過下列步驟A.將香石竹組培苗莖段置于下列預(yù)培養(yǎng)基上MS+0. 3 0. 5mol/L的蔗糖+體積 百分比為5%的DMS0+7g/L的瓊脂，在光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照時(shí)間為8 12小 時(shí)/天，溫度為22 28°C條件下，培養(yǎng)1 3天；B.取出A中預(yù)培養(yǎng)后的莖段，切取莖尖，放入下列裝載液中MS+2mol/L的甘油 +0. 4mol/L的蔗糖，裝載30 40分鐘；C.將莖尖從裝載液中轉(zhuǎn)移到下列玻璃化液PVS2中MS+0. 4mol/L的蔗糖+體積百 分比為30 %的甘油+體積百分比為15 %的乙二醇+體積百分比為15 %的DMS0，于0°C脫水 處理40 60分鐘；D.將C中的莖尖轉(zhuǎn)移至與上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；E.將莖尖從液氮中取出于38 42 °C水浴中迅速化凍，用下列去裝載溶液 MS+1. 2mol/L的蔗糖，洗滌2-3次；F.將洗滌后的莖尖接種在下列繼代培養(yǎng)基上MS+0. 05 0. 3mg/L的ΒΑ+0. 05 0. 5mg/L的NAA，在光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照時(shí)間為8 12小時(shí)/天，溫度為22 280C的條件下，培養(yǎng)20 40天，至芽成活后，再轉(zhuǎn)入上述相同的繼代培養(yǎng)基上，在相同培養(yǎng) 條件下，培養(yǎng)20 40天，即獲得恢復(fù)生長(zhǎng)的再生香石竹植株。所述步驟A中香石竹組培苗是經(jīng)過下列步驟獲得取香石竹1-2個(gè)芽的莖段，用體積濃度為70%酒精消毒30-60s，再用質(zhì)量濃度為0. 05%-0. 2%的升汞消毒15-25min，無菌 水沖洗3-4次，將莖段接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS+0. 5 2. Omg/L的ΒΑ+0. 1 0. 5mol/ L的NAA，在光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照時(shí)間為8 12小時(shí)/天，溫度為22_28°C 條件下，培養(yǎng)20 30天，待芽成活后，轉(zhuǎn)入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 30天，再轉(zhuǎn)入下列 繼代培養(yǎng)基上MS+0. 05 0. 3mg/L的ΒΑ+0. 05 0. 5mg/L的NAA，在光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照時(shí)間為8 12小時(shí)/天，溫度為22-28°C條件下，培養(yǎng)20-40天，即獲得香石 竹無菌組培苗。所述步驟A中香石竹組培苗的莖段長(zhǎng)度為10 15mm。所述步驟B中切取的莖尖長(zhǎng)度為2 4mm。所述步驟D的液氮保存時(shí)間，視香石竹植株的再生需要而具體確定，需要再生時(shí)， 從液氮中取出莖尖，經(jīng)過步驟E、F即可得到再生的香石竹植株。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案，可實(shí)現(xiàn)香石竹莖尖玻璃化超低溫保 存，不僅方法簡(jiǎn)單、程序簡(jiǎn)化，易于操作，保存效果好，而且保存后的香石竹恢復(fù)生長(zhǎng)良好， 再生率可達(dá)52. 4%，遺傳變異機(jī)率極小，是香石竹種質(zhì)資源離體保存的有效途徑。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實(shí)施例1、香石竹組培苗的獲得取香石竹兩個(gè)芽的莖段，用體積濃度為70%的酒精消毒30s，再用質(zhì)量濃度為 0. 2%的升汞消毒25min，無菌水沖洗3次，將莖段接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS+2. Omg/L的 BA+0. 5mol/L的NAA，在光照強(qiáng)度20001x，光照時(shí)間12小時(shí)/天，溫度為25°C，培養(yǎng)20天， 待芽成活后，轉(zhuǎn)入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天后，再轉(zhuǎn)入MS+0. 3mg/LBA+0. 5mg/LNAA繼代 培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天即獲得香石竹無菌組培苗。實(shí)施例2、香石竹莖尖超低溫保存及植株再生A.切取實(shí)施例1的香石竹組培苗莖段10mm，置于下列預(yù)培養(yǎng)基上MS+0. 3mol/L 的蔗糖+體積百分比為5%的DMS0+7g/L的瓊脂，在光照強(qiáng)度為15001x，光照時(shí)間為12小 時(shí)/天，溫度為22°C條件下，培養(yǎng)3天；B.取出A中預(yù)培養(yǎng)后的莖段，切取2mm長(zhǎng)的莖尖，放入下列裝載液中MS+2mol/L 的甘油+0. 4mol/L的蔗糖，裝載40分鐘；C.將莖尖從裝載液中轉(zhuǎn)移到下列玻璃化液PVS2中MS+0. 4mol/L的蔗糖+體積百 分比為30 %的甘油+體積百分比為15 %的乙二醇+體積百分比為15 %的DMS0，于0°C脫水 處理40分鐘；D.將C中的莖尖轉(zhuǎn)移至與上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；E.將莖尖從液氮中取出于40°C水浴中迅速化凍，用下列去裝載溶液MS+1. 2mol/ L的蔗糖，洗滌2次；
F.將洗滌后的莖尖接種在下列繼代培養(yǎng)基上MS+0. 05mg/L的BA+0. 05mg/L的NAA，在光照強(qiáng)度為15001x，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，溫度為22°C的條件下，培養(yǎng)40天， 至芽成活后，再轉(zhuǎn)入上述相同的繼代培養(yǎng)基上，在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)40天，即獲得恢復(fù) 生長(zhǎng)的再生香石竹植株。實(shí)施例3、香石竹莖尖超低溫保存及植株再生A.切取實(shí)施例1的香石竹組培苗莖段15mm，置于下列預(yù)培養(yǎng)基上MS+0. 5mol/L 的蔗糖+體積百分比為5%的DMS0+7g/L的瓊脂，在光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為8小 時(shí)/天，溫度為28°C條件下，培養(yǎng)1天；B.取出A中預(yù)培養(yǎng)后的莖段，切取4mm長(zhǎng)的莖尖，放入下列裝載液中MS+2mol/L 的甘油+0. 4mol/L的蔗糖，裝載30分鐘；C.將莖尖從裝載液中轉(zhuǎn)移到下列玻璃化液PVS2中MS+0. 4mol/L的蔗糖+體積百 分比為30 %的甘油+體積百分比為15 %的乙二醇+體積百分比為15 %的DMS0，于0°C脫水 處理60分鐘；D.將C中的莖尖轉(zhuǎn)移至與上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；E.將莖尖從液氮中取出于38°C水浴中迅速化凍，用下列去裝載溶液MS+1.2mol/ L的蔗糖，洗滌3次；F.將洗滌后的莖尖接種在下列繼代培養(yǎng)基上MS+0. 3mg/L的BA+0. 5mg/L的NAA， 在光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為8小時(shí)/天，溫度為28°C的條件下，培養(yǎng)20天，至芽成 活后，再轉(zhuǎn)入上述相同的繼代培養(yǎng)基上，在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)20天，即獲得恢復(fù)生長(zhǎng)的 再生香石竹植株。
權(quán)利要求
一種香石竹莖尖超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟A.將香石竹組培苗莖段置于下列預(yù)培養(yǎng)基上MS+0.3～0.5mol/L的蔗糖+體積百分比為5％的DMSO+7g/L的瓊脂，在光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為8～12小時(shí)/天，溫度為22～28℃條件下，培養(yǎng)1～3天；B.取出A中預(yù)培養(yǎng)后的莖段，切取莖尖，放入下列裝載液中MS+2mol/L的甘油+0.4mol/L的蔗糖，裝載30～40分鐘；C.將莖尖從裝載液中轉(zhuǎn)移到下列玻璃化液PVS2中MS+0.4mol/L的蔗糖+體積百分比為30％的甘油+體積百分比為15％的乙二醇+體積百分比為15％的DMSO，于0℃脫水處理40～60分鐘；D.將C中的莖尖轉(zhuǎn)移至與上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；E.將莖尖從液氮中取出于38～42℃水浴中迅速化凍，用下列去裝載溶液MS+1.2mol/L的蔗糖，洗滌2-3次；F.將洗滌后的莖尖接種在下列繼代培養(yǎng)基上MS+0.05～0.3mg/L的BA+0.05～0.5mg/L的NAA，在光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為8～12小時(shí)/天，溫度為22～28℃的條件下，培養(yǎng)20～40天，至芽成活后，再轉(zhuǎn)入上述相同的繼代培養(yǎng)基上，在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)20～40天，即獲得恢復(fù)生長(zhǎng)的再生香石竹植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述A中香石竹組培苗經(jīng)過下列步驟 獲得取香石竹1-2個(gè)芽的莖段，用體積濃度為70%酒精消毒30-60s，再用質(zhì)量濃度為 0. 05% -0. 2%的升汞消毒15-25min，無菌水沖洗3-4次，將莖段接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 MS+0. 5 2. Omg/L 的 ΒΑ+0. 1 0. 5mol/L 的 NAA,在光照強(qiáng)度為1500 20001x,光照時(shí) 間為8 12小時(shí)/天，溫度為22-28°C條件下，培養(yǎng)20 30天，待芽成活后，轉(zhuǎn)入上述誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 30天，再轉(zhuǎn)入下列繼代培養(yǎng)基上MS+0. 05 0. 3mg/L的ΒΑ+0. 05 0. 5mg/L的NAA，在光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照時(shí)間為8 12小時(shí)/天，溫度為 22-28°C條件下，培養(yǎng)20-40天，即獲得香石竹無菌組培苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述A中香石竹組培苗的莖段長(zhǎng)度為10 15mm0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述B中切取的莖尖長(zhǎng)度為2 4mm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種香石竹莖尖超低溫保存及植株再生的方法，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、裝載、脫水、凍存、化凍、恢復(fù)培養(yǎng)等步驟，獲得恢復(fù)生長(zhǎng)的再生香石竹植株。采用本發(fā)明提供的方法，香石竹再生率可達(dá)52.4％，香石竹莖尖玻璃化超低溫保存方法設(shè)備簡(jiǎn)單、程序簡(jiǎn)化，易于操作，凍存效果好，保存后的香石竹恢復(fù)生長(zhǎng)良好，遺傳變異機(jī)率極小，是香石竹種質(zhì)資源離體保存的一條有效途徑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101836588SQ201010134048
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者何艷, 周旭紅, 張顥, 曹樺, 李紳崇, 李金澤, 桂敏, 歐陽德愛, 王繼華, 莫錫君 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所