專利名稱：：一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種植株和塊莖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種植株和塊莖的方法。
背景技術(shù)：
：菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜，鬼子姜，姜不辣，原產(chǎn)北美，在我國各地均有栽培，是菊科向日葵屬多年生草本植物。菊芋喜溫，耐鹽，耐瘠，抗逆高產(chǎn)，是高密度能源植物以及新型經(jīng)濟作物、飼料作物。菊芋為頭狀花序，花序小，花數(shù)量多?；ㄐ虻慕Y(jié)構(gòu)如圖1所示(A表示頭狀花序的部分縱切，B管狀花，C舌狀花。1花序托、2總苞、3管狀花、4舌狀花、5苞片、6子房、7冠毛、8花冠管膨大部分、9花瓣、10聚藥雄蕊、11柱頭)，花成簇狀排列?；ò?枚，互相連合成管狀或舌狀，舌狀花呈無性，淡黃色，著生于花序邊緣；管狀花為兩性花，著生于花序中間。雄蕊5枚，花絲互相分離而花藥邊緣互相連合形成空筒形，即聚藥雄蕊。同一朵管狀花上雄蕊早于雌蕊成熟，每當花藥成熟時，將花粉粒撒在聚藥雄蕊的“筒”中，待雌蕊花柱生長時，將它們“推”出筒外。雌蕊子房下位，二心皮構(gòu)成，一室，一枚倒生胚珠，基底著生?；ㄖ粭l，伸于花藥管中，頂端柱頭2裂，但在雌蕊尚未成熟時，柱頭不張開。在花柱上部，常生有一圈毛，叫“掃粉毛”，每當花柱發(fā)育而伸長的過程中，此“掃粉毛”即可將雄蕊花藥“撒”在花藥管中的花粉?！巴啤背?，便于來訪的昆蟲傳粉。菊科植物花一般都是雄蕊先熟，花柱伸長過程中將花粉?！巴啤背龊?，頂端的柱頭再張開來接受其它花傳來的花粉，接受花粉完成受精。菊芋花期為8-9月，其同一頭狀花序上的管狀花的開放時間不一致，隨著花序生長，舌狀花最先開放，隨后四周的管狀花開放，依次由外向中央開放，并伴隨柱頭的生長和花粉散粉。雄蕊雌蕊未成熟的管狀花如圖2所示，雄蕊頂端封閉，未見黑色花藥絲。四周雌蕊雄蕊先開始成熟的花朵如圖3所示，可見雄蕊黑色花藥絲，頂端可見黃色花粉散出。頭狀花序中間雌蕊雄蕊開始成熟花朵如圖4所示。菊芋塊莖富含菊糖，占其塊莖干重的70-80%，是目前我國工業(yè)化提取菊糖的主要原料之一。菊糖作為一種純天然的功能性配料，具有可溶性膳食纖維、低聚糖的雙重特性和功能，同時也是雙歧桿菌增殖因子、優(yōu)異的脂肪替代物，是對糖尿病人安全的食品，已被世界20多個國家批準為營養(yǎng)增補劑，廣泛應用于乳制品、飲料、低脂低熱量食品、烘培食品、保健食品中，我國衛(wèi)生部已批準菊粉、多聚果糖作為新資源食品。因此菊芋產(chǎn)業(yè)在我國具有良好的發(fā)展空間；同時菊芋還是良好的能源植物，以菊芋塊莖作為原料生產(chǎn)生物乙醇的亦見于報道。菊芋的抗旱抗寒，耐瘠，耐鹽堿的特性使其在我國北方具有廣闊的推廣空間，可充分利用北方大面積的鹽堿地、貧瘠地、邊坡地、荒地等邊際地資源和豐富的光熱資源，同時具有良好的生態(tài)效益。目前我國菊芋產(chǎn)業(yè)尚處于起步階段，已在青海、寧夏、甘肅、湖北等地形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模。目前國內(nèi)對菊芋的研究主要集中在引種、栽培、生理、生態(tài)、下游產(chǎn)品加工及利用等方面。相對菊芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展菊芋雜交品種選育工作嚴重滯后，尚未見菊芋雜交品種選育的相關(guān)報道。為保證應菊芋產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須開展系統(tǒng)的品種選育工作，尤其是雜交品種的選育，為菊芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供良好的品種保證。生產(chǎn)中，菊芋以無性繁殖為主，自然開放授粉結(jié)實率極低，雜交結(jié)實率更低；菊芋種子直播或者發(fā)芽播種大部分不能正常發(fā)芽或者發(fā)芽率極低。菊芋的這些特性使其利用自然變異選育新品種的可能性極低，更無法滿足品種選育工作的需求，因此必須通過人工雜交的手段人工創(chuàng)造更多的變異，而菊芋極低的結(jié)實率和種子較低的發(fā)芽率使雜交種子的獲得、繁殖都極其困難，限制了通過人工雜交的方式創(chuàng)造、保存、禾I傭變異的可能；同時菊芋雜交種子繁殖植株長勢弱，易受病害、環(huán)境等影響而死亡，使人工雜交得到的變異喪失；并且由于受菊芋生育期和雜交種子繁殖植株塊莖產(chǎn)量低的限制由單粒菊芋雜交種子擴繁成大田鑒定群體最少需2-3年以上的時間，周期長；因此必須尋找合適的方法盡最大可能保留雜交種子并使其在最短的時間內(nèi)擴繁得到較大的群體，應用于雜交育種中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋實生苗的方法。本發(fā)明所提供的培育菊芋雜交種子獲得菊芋實生幼苗的方法，包括如下步驟組織培養(yǎng)菊芋雜交種子獲得菊芋實生苗。上述方法中，所述組織培養(yǎng)的方法包括如下步驟1)將所述菊芋雜交種子消毒，獲得消毒的菊芋雜交種子；2)將所述消毒的菊芋雜交種子接種于MS培養(yǎng)基中，4°C處理12_36h，然后在溫度為20°C_23°C且避光的條件下培養(yǎng)10-30天，得到菊芋雜交種實生苗。上述方法中，在所述步驟2)后，包括如下擴繁的步驟將所述菊芋實生幼苗切成具芽的莖段，將具芽的莖段轉(zhuǎn)接于添加α-萘乙酸的1/2MS培養(yǎng)基中，在溫度為200C_25°C、光強2500-30001uX且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)，得到菊芋實生苗；所述生添加萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基由1/2MS培養(yǎng)基和α-萘乙酸NAA組成，1/2MS培養(yǎng)基和NAA的配比為IL(0.05mg-0.15mg)，具體為IL0.Img0上述方法中，所述消毒包括如下步驟將所述菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液中浸泡l_2h，流水沖洗l-3h，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡10-30s，無菌水沖洗，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉水溶液消毒3-6min，無菌水沖洗，再用0.(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌l-4min，無菌水沖洗；所述洗滌劑和水的混合溶液中洗滌劑和水的體積比為(0.5-4)100。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋植株的方法。本發(fā)明所提供的培育菊芋雜交種子獲得菊芋植株的方法，包括如下步驟a)按照上述方法培養(yǎng)菊芋雜交種子，獲得菊芋雜交種實生苗；b)將所述菊芋雜交種實生苗進行煉苗和移栽，得到菊芋雜交種植株。上述方法中，在所述步驟b)后，包括將所述菊芋植株進行田間栽培的步驟。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種塊莖的方法。本發(fā)明所提供的培育菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種塊莖的方法，包括如下步驟按照上述任一所述的方法獲得田間生長的菊芋植株，繼續(xù)田間栽培至收獲菊芋塊莖。上述培育菊芋雜交種子獲得菊芋實生幼苗、上述培育菊芋雜交種子獲得菊芋植株的方法、上述培育菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種塊莖的方法在菊芋品種選育中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明方法成功的將菊芋雜交種子培育成完整植株，移栽于田間栽培并收獲了塊莖。實驗證明，本發(fā)明方法在培養(yǎng)基上進行雜交種子繁殖，種子污染率低，種子發(fā)芽率高，種子到大田植株繁殖系數(shù)高；周期短，從開始培養(yǎng)雜交種子至田間收獲較多塊莖，僅需8-12個月，實現(xiàn)了菊芋雜交種子的高效繁殖。本發(fā)明方法克服了菊芋雜交種子結(jié)實率低、常規(guī)條件下不易發(fā)芽、難以獲得有效植株個體、且由于受生育期的影響從種子到獲得雜交種塊莖應用于大田鑒定周期長的缺陷。本發(fā)明方法可有效的保留菊芋雜交變異，極大縮短變異進入大田鑒定的周期，可為菊芋雜交育種提供較多的可供選擇的變異來源，加速雜交育種的選育進程，在菊芋雜交育種中具有良好的應用前景。圖1為菊芋花序的解剖結(jié)構(gòu)圖。圖2為雄蕊雌蕊未成熟花朵，雄蕊頂端封閉，未見黑色花藥絲。圖3為四周雌蕊雄蕊開始成熟的花朵，可見雄蕊黑色花藥絲，頂端可見黃色花粉散出。圖4為頭狀花序中間雌蕊雄蕊開始成熟花朵。圖5為剪掉中間管狀花后涂上膠水的花序。圖6為最適授粉花粉。圖7為最適授粉柱頭。圖8為菊芋雜交種子。圖9為無菌條件下發(fā)芽的菊芋種子。圖10為快繁階段菊芋幼苗的根及幼苗。圖11培養(yǎng)間菊芋組培苗。圖12為移栽于營養(yǎng)缽種的菊芋組培苗。圖13為大田種的菊芋苗。圖14為菊芋雜交種塊莖。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、菊芋人工雜交種子的獲得本實施例中選擇紫色塊莖的菊芋進行人工雜交。一、雜交方法(一)菊芋母本的去雄1、待去雄的花序的選擇菊芋花序中的管狀花成簇狀排列，其開花特點是由四周往中間依次開放。早晨氣溫上升以前，菊芋花序中同一朵管狀花上的雌蕊花柱和雄蕊花藥絲會迅速生長且兩者生長速度存在差異，雄蕊花藥絲伸長較快并先于雌蕊成熟；雌蕊花柱生長速度慢，從而雌蕊柱頭與雄蕊頂端之間形成一定距離。根據(jù)此特點選擇花盤周邊邊緣的管狀小花雄蕊即將成熟但未散粉、雌蕊花柱尚未伸長，中間管狀花尚未成熟的花序作為母本，去雄。去雄時選擇的花序是介于圖2之后而在圖3的之前的發(fā)育狀態(tài)的花序。具體選擇花期處于如下階段的菊芋花序進行去雄，該時期花序的結(jié)構(gòu)如下述(1)和(2)將菊芋花序中花盤周邊邊緣先開放的管狀花記作四周管狀花，將除四周管狀花之外的所有管狀花記作中間管狀花；在四周管狀花具有下述(1)中所述的結(jié)構(gòu)時，花序中的中間管狀花自然就有下述(2)中所述結(jié)構(gòu)。(1)四周管狀花的結(jié)構(gòu)雄蕊為聚藥雄蕊，由花絲、花藥構(gòu)成，花絲分離，花藥互相連合成管狀，花藥未散粉；雌蕊由柱頭、花柱和子房構(gòu)成，花柱和柱頭位于花藥內(nèi)底部中央處且花柱未伸長，柱頭與所述花藥的頂端相距2mm-3mm；所述花藥的頂端為花藥中遠離花盤的一端。此時，四周管狀花的雄蕊已經(jīng)伸長，可以看見黑色的花絲長出而且較中間未發(fā)育的小花長約2-3mm，但其頂端尚是封閉狀態(tài)，未見黃色的花粉散出，也就是花藥尚未完全成熟；此時與其同一朵小花上的雌蕊柱頭還未伸長，雌蕊柱頭頂端離雄蕊花藥管頂端有一定距離(2-3mm)。花藥就是被膜包的花粉團，去雄時花粉未成熟(即花藥未散粉)，所以花藥并不會破裂散出花粉。而花粉附著于花藥管內(nèi)壁，直接去除花藥管即可去除所有的花粉；只有這一時期，柱頭與花藥的頂端才相距2mm-3mm，隨著雌蕊花柱的發(fā)育柱頭會越來越接近雄蕊頂端，最后頂破雄蕊花藥頂端，伸出柱頭同時推出花粉。(2)中間管狀花雄蕊為聚藥雄蕊，雄蕊由花絲和花藥構(gòu)成，花絲分離，管狀花藥是由單獨的花藥互相連合成管狀，但是管狀花花藥、花絲尚在發(fā)育中，未見伸長；雌蕊中的子房、花柱和柱頭處于發(fā)育過程中，還沒有分化完全。2、去雄(1)四周管狀花的去雄用鑷子夾住花藥的1/3處，垂直于所述管狀花的花盤的方向?qū)⑺鲂廴镒У?，留有雌蕊且露出柱頭；所述花藥的1/3處自花藥遠離花盤的一端向花盤方向計。這一時期雌蕊花柱還未伸長，伸長的只是雄蕊花絲，兩者之間有一定距離，因此不會傷及雌蕊，去掉雄蕊后露出的是雌蕊的柱頭。(2)中間管狀花的去雄用剪刀在中間管狀花的1/2至1/4處剪掉中間管狀花；所述中間管狀花的1/2至1/4處自中間管狀花與花盤連接端計起。此步驟要注意掌握剪除部位，剪除過多易造成花序死亡，過少易造成花粉污染。實際操作中，有的自1/2處、有的自1/4處、有的介于兩者之間，統(tǒng)計結(jié)果表明在1/2至1/4的范圍內(nèi)，均無顯著差異。用小毛筆蘸取膠水涂抹在刀口部位，以抑制其花藥再生長和抑制散粉(圖5)；在操作過程中避免膠水接觸到待授粉的柱頭。此方法可有效防止生長遲緩的管狀花散粉，減少去雄次數(shù)，避免了去雄后暴露的柱頭受同一花序的花粉的污染。上述步驟(1)和(2)將雄蕊徹底去除，防止自交，產(chǎn)生自交種子，也就是防止自己的花粉給自己授粉。至此，獲得去雄的花序，將其作為母本。3、套袋為了防止去雄后的花序與其它花粉雜交，隨后將去雄后的花序套上硫酸紙袋，并讓雌蕊繼續(xù)發(fā)育。(二)父本的選擇選取未開花且與母本花期相遇的花序，套上硫酸紙雜交袋，作為父本花序。花期相遇具體是指父本的管狀花散粉時間與母本去雄后柱頭展開時間相遇。只要是父本花開花時間與母本去雄后的花的開花時間一致即可，無所謂父本的四周花序或中間花序，因為父本只是提供花粉。(三)授粉選擇如下時期和狀態(tài)的母本與父本進行人工授粉父本父本的管狀花中柱頭剛露出雄蕊花藥管頂端且花粉剛被頂出花藥(圖6)。母本母本去雄后，花柱伸長，當柱頭前端分裂且裂片展平的時候為最佳接受花粉時間(圖7)；此時授粉面裸露，頂端乳突充分篷展，內(nèi)容物充盈透明，柱頭可授性最好，更易結(jié)實。一般是去雄當天下午4點左右至第二天上午就可以進行授粉，此時柱頭可授性最好。使用小毛筆粘住花粉，在選好的柱頭上進行授粉，授粉完畢后套上硫酸紙袋，標上標牌。(四)授粉后的培育授粉完畢4-7天后，去掉硫酸紙袋，正常田間管理，獲得雜交種子。菊芋雜交種子的形態(tài)如圖8所示。MS培養(yǎng)基產(chǎn)品編號HB8469生產(chǎn)商青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。氯化汞分析純(AR)，氯化汞含量不少于99.5%，生產(chǎn)商天津市恒興化學試劑制造有限公司。次氯酸納溶液(有效氯含量為10.0%)，生產(chǎn)商天津市巴斯夫化工有限公司，許可證號津Q/AG3-333-2001。將購買的有效氯含量為10%的次氯酸鈉溶液用蒸餾水稀釋，得到有效氯含量為5%的次氯酸鈉溶液。用有效氯含量為5%的次氯酸鈉溶液進行實驗。洗滌劑為市售的普通雕牌洗潔精。下述每個實施例中均用200粒雜交種子進行實驗。實施例2、菊芋雜交種子的培養(yǎng)一、組織培養(yǎng)1、種子消毒將菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液(洗滌劑和水的體積比為2100)中浸泡1.5h，流水沖洗3h，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡20s，無菌水沖洗3次，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉溶液消毒4min，無菌水沖洗3次，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌2min，無菌水沖洗3次。將消毒后的種子用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基中，3天后，統(tǒng)計種子的污染率。長出菌斑的種子認為是污染的。污染率(％)=(出現(xiàn)污染種子數(shù)/接種的種子數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均污染率為7.5%。2、獲得完整幼苗將步驟1消毒后的種子用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基中，4°C處理24h，然后在溫度為22°C且避光的條件下培養(yǎng)20天，得到的菊芋雜交種子實生幼苗，并統(tǒng)計種子發(fā)芽率(圖9)；MS培養(yǎng)基組成如表1所示。種子直接發(fā)芽長下的就是實生幼苗。發(fā)芽率(％)=(發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均種子發(fā)芽率為75%。3、幼苗擴繁將步驟2得到的菊芋雜交種子實生幼苗切成具芽的莖段，接種于添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基中，在溫度為23°C、光強30001ux且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)20天，得到組培幼苗(圖10和圖11，圖IOA為根，圖IOB為組培幼苗)，并統(tǒng)計組培苗生根率。擴繁步驟中獲得的幼苗大部分都是具有根的，但是少量不帶根，本實驗統(tǒng)計帶根的幼苗的數(shù)量，計算組培苗生根率。添加α-萘乙酸(NAA)的V2MS培養(yǎng)基由α-萘乙酸和V2MS培養(yǎng)基組成，1/2MS培養(yǎng)基和NAA的配比為IL0.Img。組培苗生根率(％)=(生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均組培苗生根率為95%。在上述的各個階段中，階段2獲得的由種子直接發(fā)芽得到的幼苗為實生苗。階段3中通過對階段2實生幼苗切段，扦插到培養(yǎng)基上長成的植株是克隆植株；通過階段2，階段3兩個階段的組織培養(yǎng)可以將一粒種子發(fā)芽長成一株幼苗，并通過切斷轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基上，使其一個帶芽的莖段就可以發(fā)育成一個完整的植株，從而使一株植株在較短的時間內(nèi)繁殖成十幾株甚至幾十株植株。因為這十幾株或者是幾十株植株來自同一個實生苗，或者說來自于同一個種子，因此叫來自于同粒種子的克隆體。而對于傳統(tǒng)的種子繁殖一粒種子只能得到一個植株。表1、MS培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>__H3BO3__6^2___MnSO4·4H20__2^3___ZnSO4·7H20_____Na2MoO4·2H20__025___GuSO4·5H20__0.025___CoCl2·6H20__0.025_鐵鹽__Na2-EDTA__37.25_FeSO4·7H2027.85---有機成分煙酸__0^5___鹽酸吡哆醇(VB6)__05__煙酸硫胺素(VB;)0.4__甘氨酸_2^0_____100.0_蔗糖___30000_瓊脂7000PH=5.8_1/2MS培養(yǎng)基組成1/2MS培養(yǎng)基中的組成成分與MS培養(yǎng)基相同，其中，大量元素和微量元素濃度均為MS培養(yǎng)基的1/2，蔗糖、瓊脂、鐵鹽和有機成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，pH為5.8。MS，1/2MS均是煮沸溶解后分裝至150ml三角瓶中，然后115°C，高壓蒸汽滅菌20mino二、煉苗和移栽(一)煉苗將步驟一獲得組培幼苗進行煉苗，具體煉苗步驟如下將培養(yǎng)瓶(三角瓶)封口膜揭開1/3，鍛煉3天，然后將三角瓶封口膜全部揭開，鍛煉5天。此煉苗過程是使組培苗逐步適應外界環(huán)境，提高組培苗的移栽成活率。(二)移栽1、將煉苗后的組培苗取出，洗凈根部殘余的培養(yǎng)基，移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在溫度為23°C、環(huán)境濕度為75%、光強30001uX且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)7天；此過程中在保證基質(zhì)濕潤的前提下少澆水但絕對避免干旱，并嚴禁營養(yǎng)缽內(nèi)積水和強光照射。2、再在溫度為23°C、環(huán)境濕度為70%且自然光照條件下培養(yǎng)20天，統(tǒng)計移栽植株成活率；得到的植株如圖12所示。上述過程中所用的基質(zhì)由草炭土和沙土組成，草炭土沙土=11.5(體積比)。上述過程中，煉苗是使植株逐漸適應外界環(huán)境，移栽于營養(yǎng)缽中是在培養(yǎng)室內(nèi)使植株得到適應性鍛煉。此煉苗和移栽可提高組培苗的移栽成活率。移栽植株成活率(％)=(移栽成活植株數(shù)/營養(yǎng)缽移栽植株數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均營養(yǎng)缽移栽成活率為87%。三、田間栽培將步驟二得到的菊芋植株帶培養(yǎng)土移栽于大田中，澆水，遮光(拿遮陽網(wǎng)遮住)5天。定植后，前期勤澆水保持土壤濕潤；植株完全成活長大后適當減少澆水。統(tǒng)計移栽植株成活率(％)；移栽當年十月份即可收獲大量雜交種子植株塊莖。田間種植的植株如圖13所示。收獲的塊莖如圖14所示。其中，澆水且適當遮光5天的處理能促進幼苗的成活。移栽植株成活率(％)=(大田成活植株數(shù)/大田移栽植株數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均大田移栽成活率為85%。實驗完畢后，統(tǒng)計繁殖系數(shù)和繁育周期。繁殖系數(shù)定義為每粒雜交種子通過實驗一、二和三的步驟后，獲得的能夠存活并能產(chǎn)生塊莖的植株數(shù)。繁育周期從將種子消毒至收獲塊莖的時間。3次重復的結(jié)果為繁殖系數(shù)為7，繁育周期為10個月。實施例3、菊芋雜交種子的培養(yǎng)一、組織培養(yǎng)1、種子消毒將菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液(洗滌劑和水的體積比為0.5100)中浸泡lh，流水沖洗lh，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用有效氯含量5%的次氯酸鈉水溶液消毒3min，無菌水沖洗3次，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌lmin，無菌水沖洗3次。將消毒后的種子用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基中，3天后，統(tǒng)計種子的污染率。污染率(％)=(出現(xiàn)污染種子數(shù)/接種的種子數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均污染率為12%。2、獲得完整幼苗將步驟1消毒后的種子用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基中，4°C處理12h，然后在溫度為20°C且避光的條件下培養(yǎng)10天，得到的菊芋雜交種子實生幼苗(具有根和子葉)，并統(tǒng)計種子發(fā)芽率；MS培養(yǎng)基組成如表1所示。發(fā)芽率(％)=(發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均種子發(fā)芽率為71%。3、幼苗擴繁將步驟2得到的菊芋雜交種子實生幼苗切成具芽的莖段，接種于添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基中，在溫度為20°C、光強25001ux且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)15天，得到組培幼苗，并統(tǒng)計組培苗生根率。添加α-萘乙酸(NAA)的V2MS培養(yǎng)基由α-萘乙酸和V2MS培養(yǎng)基組成，1/2MS培養(yǎng)基和NAA的配比為IL0.05mg。組培苗生根率(％)=(生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均組培苗生根率為89%。MS培養(yǎng)基組成、1/2MS培養(yǎng)基組成均與實施例1中所述相同。二、煉苗和移栽(一)煉苗將步驟一獲得組培幼苗進行煉苗，具體煉苗步驟如下將培養(yǎng)瓶(三角瓶)封口膜揭開1/3，鍛煉1天，然后將三角瓶封口膜全部揭開，鍛煉3天。此煉苗過程是使組培苗逐步適應外界環(huán)境，提高組培苗的移栽成活率。(二)移栽1、將煉苗后的組培苗取出，洗凈根部殘余的培養(yǎng)基，移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在溫度為20°C、環(huán)境濕度為70%、光強20001uX且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)5天；此過程中在保證基質(zhì)濕潤的前提下少澆水但絕對避免干旱，并嚴禁營養(yǎng)缽內(nèi)積水和強光照射。。2、再在溫度為20°C、環(huán)境濕度為60%且自然光照條件下培養(yǎng)15天，統(tǒng)計移栽植株成活率。上述過程中所用的基質(zhì)由草炭土和沙土組成，草炭土沙土=11.5。上述過程中，煉苗是使植株逐漸適應外界環(huán)境，移栽于營養(yǎng)缽中是在培養(yǎng)室內(nèi)使植株得到適應性鍛煉。此煉苗和移栽可提高組培苗的移栽成活率。移栽植株成活率(％)=(成活植株數(shù)/營養(yǎng)缽移栽植株數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均營養(yǎng)缽移栽成活率為76%。三、田間栽培將步驟二得到的菊芋植株帶培養(yǎng)土移栽于大田中，澆水，遮光(拿遮陽網(wǎng)遮住)3天。定植后，前期勤澆水保持土壤濕潤；植株完全成活長大后適當減少澆水。統(tǒng)計移栽植株成活率(％)；移栽當年十月份即可收獲雜交種子植株塊莖。其中，澆水且適當遮光3天的處理能促進苗的成活。移栽植株成活率(％)=(大田成活植株數(shù)/大田移栽植株數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均大田移栽成活率為79%。實驗完畢后，統(tǒng)計繁殖系數(shù)和繁育周期。繁殖系數(shù)定義每粒雜交種子通過實驗一、二和三的步驟后，獲得的能夠存活并能產(chǎn)生塊莖的植株數(shù)目。繁育周期從將種子消毒至收獲塊莖的時間。3次重復的結(jié)果為繁殖系數(shù)為5，繁育周期為10個月。實施例4、菊芋雜交種子的培養(yǎng)一、組織培養(yǎng)1、種子消毒將菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液(洗滌劑和水的體積比為4100)中浸泡2h，流水沖洗3h，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉水溶液消毒6min，無菌水沖洗3次，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌4min，無菌水沖洗3次。將消毒后的種子用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基中，3天后，統(tǒng)計種子的污染率。污染率(％)=(出現(xiàn)污染種子數(shù)/消毒并接種的種子數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均污染率為3%。2、獲得完整幼苗將步驟1消毒后的種子用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基中，4°C處理36h，然后在溫度為23°C且避光的條件下培養(yǎng)30天，得到的菊芋雜交種子實生幼苗并統(tǒng)計種子發(fā)芽率；MS培養(yǎng)基組成如表1所示。發(fā)芽率(％)=(發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均種子發(fā)芽率為68%。3、幼苗擴繁將步驟2得到的菊芋雜交種子實生幼苗切成具芽的莖段，接種于添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、光強30001ux且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)25天，得到組培幼苗，并統(tǒng)計組培苗生根率。添加α-萘乙酸(NAA)的V2MS培養(yǎng)基由α-萘乙酸和V2MS培養(yǎng)基組成，1/2MS培養(yǎng)基和NAA的配比為IL0.15mg。組培苗生根率(％)=(生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均組培苗生根率為80%。MS培養(yǎng)基組成、1/2MS培養(yǎng)基組成均與實施例1中所述相同。二、煉苗和移栽(一)煉苗將步驟一獲得組培幼苗進行煉苗，具體煉苗步驟如下將培養(yǎng)瓶(三角瓶)封口膜揭開1/3，鍛煉5天，然后將三角瓶封口膜全部揭開，鍛煉5天。此煉苗過程是使組培苗逐步適應外界環(huán)境，提高組培苗的移栽成活率。(二)移栽1、將煉苗后的組培苗取出，洗凈根部殘余的培養(yǎng)基，移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在溫度為25°C、環(huán)境濕度為80%、光強30001uX且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)10天；此過程中在保證基質(zhì)濕潤的前提下少澆水但絕對避免干旱，并嚴禁營養(yǎng)缽內(nèi)積水和強光照射。2、再在溫度為25°C、環(huán)境濕度為75%且自然光照條件下培養(yǎng)25天，統(tǒng)計移栽植株成活率。上述過程中所用的基質(zhì)由草炭土和沙土組成，草炭土沙土=11.5。上述過程中，煉苗是使植株逐漸適應外界環(huán)境，移栽于營養(yǎng)缽中是在培養(yǎng)室內(nèi)使植株得到適應性鍛煉。此煉苗和移栽可提高組培苗的移栽成活率。移栽植株成活率(％)=(移栽成活植株數(shù)/營養(yǎng)缽移栽植株數(shù))X100%營養(yǎng)缽移栽成活率85%以上；3次重復的結(jié)果為平均營養(yǎng)缽移栽成活率為89%。三、田間栽培步驟二得到的菊芋植株帶培養(yǎng)土移栽于大田中，澆水，遮光(拿遮陽網(wǎng)遮住)5天。定植后，前期勤澆水保持土壤濕潤；植株完全成活長大后適當減少澆水。統(tǒng)計移栽植株成活率(％)；移栽當年十月份即可收獲大量雜交種子植株塊莖。其中，澆水且適當遮光7天的處理能促進幼苗的成活。移栽植株成活率(％)=(大田成活植株數(shù)/大田移栽植株數(shù))X100%3次重復的結(jié)果為平均大田移栽成活率為87%。實驗完畢后，統(tǒng)計繁殖系數(shù)和繁育周期。繁殖系數(shù)定義為每粒雜交種子通過實驗一、二和三的步驟后，獲得的能夠存活并能產(chǎn)生塊莖的植株數(shù)目。繁育周期從將種子消毒至收獲塊莖的時間。3次重復的結(jié)果為繁殖系數(shù)為5，繁育周期為11個月。權(quán)利要求一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋實生苗的方法，包括如下步驟組織培養(yǎng)菊芋雜交種子獲得菊芋實生苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述組織培養(yǎng)的方法包括如下步驟1)將所述菊芋雜交種子消毒，獲得消毒的菊芋雜交種子；2)將所述消毒的菊芋雜交種子接種于MS培養(yǎng)基中，4°C處理12-36h，然后在溫度為200C_23°C且避光的條件下培養(yǎng)10-30天，得到菊芋實生苗；所述4°C處理的時間具體為24h、12h或36h，所述溫度具體為22°C、20°C或23°C，所述培養(yǎng)的時間為20天、10天或30天。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟2)后，包括如下擴繁的步驟將所述菊芋實生苗切成具芽的莖段，將具芽的莖段轉(zhuǎn)接于添加α-萘乙酸的V2MS培養(yǎng)基中，在溫度為20°C-25°C、光強2500-30001ux且光照時間為14h/天的條件下培養(yǎng)，得到菊芋實生苗；所述溫度具體為23°C、20°C或25°C，所述光強具體為25001ux或30001ux；所述生添加α-萘乙酸的1/2MS培養(yǎng)基由1/2MS培養(yǎng)基和α-萘乙酸組成，1/2MS培養(yǎng)基和α-萘乙酸的配比為IL(0.05mg-0.15mg)，具體為IL0.lmg,IL0.05mg或IL0.15mg。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述消毒包括如下步驟將所述菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液中浸泡l_2h，流水沖洗l_3h，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡10-30s，無菌水沖洗，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉水溶液消毒3-6min，無菌水沖洗，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌l-4min，無菌水沖洗；所述洗滌劑和水的混合溶液中洗滌劑和水的體積比為(0.5-4)100；所述消毒具體為如下1)、2)或3)所示1)將所述菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液中浸泡1.5h，流水沖洗3h，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡20s，無菌水沖洗，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉水溶液消毒4min，無菌水沖洗，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌2min，無菌水沖洗；所述洗滌劑和水的混合溶液中洗滌劑和水的體積比為2100；2)將所述菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液中浸泡lh，流水沖洗lh，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡10s，無菌水沖洗，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉水溶液消毒3min，無菌水沖洗，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌lmin，無菌水沖洗；所述洗滌劑和水的混合溶液中洗滌劑和水的體積比為0.5100；3)將所述菊芋雜交種子去皮，置于洗滌劑和水的混合溶液中浸泡2h，流水沖洗3h，然后用75%(體積百分含量)的乙醇水溶液浸泡30s，無菌水沖洗，再用有效氯含量為5%的次氯酸鈉水溶液消毒6min，無菌水沖洗，再用0.1%(質(zhì)量百分含量)氯化汞水溶液滅菌4min，無菌水沖洗；所述洗滌劑和水的混合溶液中洗滌劑和水的體積比為4100。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述1/2MS培養(yǎng)基的組成成分與MS培養(yǎng)基相同，其中，大量元素在1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為其在MS培養(yǎng)基中濃度的1/2，微量元素在1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為其在MS培養(yǎng)基中濃度的1/2，其余組成成分在1/2MS培養(yǎng)基中的濃度與其在MS培養(yǎng)基中濃度相同。6.一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋植株的方法，包括如下步驟a)按照權(quán)利要求1-5中任一所述方法培養(yǎng)菊芋雜交種子，獲得菊芋實生苗；b)將所述菊芋實生苗進行煉苗和移栽，得到菊芋雜交種植株。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟b)后，包括將所述菊芋雜交種植株進行田間栽培的步驟。8.一種培育菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種塊莖的方法，包括如下步驟按照權(quán)利要求6或7所述的方法獲得菊芋雜交種植株，繼續(xù)田間栽培至收獲菊芋塊莖。9.權(quán)利要求1-8中任一所述的方法在菊芋品種選育中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種繁殖菊芋雜交種子獲得菊芋雜交種植株和塊莖的方法。該方法包括如下步驟組織培養(yǎng)菊芋雜交種子獲得菊芋實生苗。本發(fā)明方法克服了菊芋雜交種子結(jié)實率低、常規(guī)條件下不易發(fā)芽、難以獲得有效植株個體、且由于受生育期的影響從種子到獲得雜交種塊莖應用于大田鑒定周期長的缺陷。本發(fā)明方法可有效的保留菊芋雜交變異，極大縮短變異進入大田鑒定的周期，可為菊芋雜交育種提供較多的可供選擇的變異來源，加速雜交育種的選育進程，在菊芋雜交育種中具有良好的應用前景。文檔編號A01G1/00GK101803572SQ20101013727公開日2010年8月18日申請日期2010年3月31日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者劉建全,寇一翾,曾軍申請人:蘭州大學