專利名稱：：防治辣椒青枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能防治辣椒青枯病的拮抗菌及用其制成的微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，專用于克服和消除辣椒青枯病問題。
背景技術(shù)：
：辣椒青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種土傳病害，一旦發(fā)生，通常造成20%-30%的辣椒死亡，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50%以上，甚至絕收。目前，對辣椒青枯病的防治主要有作物輪作、化學(xué)防治和選育抗病品種等不同的方法，但防治效果較低。隨著綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，對辣椒青枯病的防治重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向以生物防治為主的綜合防治，篩選高效拮抗菌株是進(jìn)行生物防治的核心，同時(shí)將拮抗菌株和有機(jī)肥復(fù)配開發(fā)成既能夠抗病又可以改善土壤結(jié)構(gòu)的微生物有機(jī)肥料越來越受到人們的重視。
發(fā)明內(nèi)容1.技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于研制一種能防治辣椒青枯病的拮抗微生物有機(jī)肥料，防治效率達(dá)到70%，使大量辣椒連作障礙土壤得到生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案用于防治辣椒青枯病的拮抗菌a45，屬于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),2009年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3480，主要生物學(xué)特性為；革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，芽孢中生或近中生，橢圓形，孢囊不膨大，沒有伴孢晶體；發(fā)酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇產(chǎn)酸，能水解淀粉和液化明膠，接觸酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P(Voges-Proskauer)反應(yīng)均為陽性，而甲基紅反應(yīng)、丙二酸利用、酒石酸鹽利用均為陰性；在LB平板上30°C培養(yǎng)24h后，菌落周邊不規(guī)則，不透明，具運(yùn)動(dòng)性。用上述拮抗菌a45所生產(chǎn)的防治辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料，其特征在于該肥料中含有2.OX109個(gè)/g以上的拮抗菌a45、全氮含量為33.lgkg—1，全磷含量為13.3gkg—1、全鉀含量為21.3gkg—1。上述防治辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1)將菌株a45接種到PDA培養(yǎng)液中進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為初始pH范圍為7.0-7.2，培養(yǎng)溫度30°C，170轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵的a45拮抗菌液含菌或芽孢量>5X109個(gè)/ml；所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制1L培養(yǎng)基為例用200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml,pH值調(diào)至7.2-7.4，121°C滅菌20min。2)有機(jī)肥的制備以腐熟的豬糞堆肥、腐熟的牛糞堆肥、氨基酸有機(jī)肥以體積比3:3:4混合制成；所用腐熟的豬糞、牛糞堆肥發(fā)芽指數(shù)均為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量彡35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2%，含水量25-30%。3)將a45拮抗菌液按20%(V/ff)的比例接種到步驟2)所述有機(jī)肥中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30-50°C，發(fā)酵過程中每天翻堆1次，發(fā)酵周期5-7天，使拮抗菌含量達(dá)到2.0XIO9個(gè)/g以上，最后在溫度不超過60°C的條件下將其含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為防治辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料。所述微生物有機(jī)肥料可專用于防治辣椒青枯病。3.有益效果本發(fā)明涉及一種能克服或消除連作辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料及其生產(chǎn)方法，利用豬糞堆肥、牛糞堆肥和氨基酸有機(jī)肥混合物，再與拮抗菌液混合后制成微生物有機(jī)肥料，其產(chǎn)品與目前市場上的產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1)該肥料產(chǎn)品中含有抑制辣椒青枯病病原細(xì)菌生長的專一性高效菌株(枯草芽孢桿菌a45)，其抑制效果非常顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，在含有辣椒青枯病的土壤上施用本產(chǎn)品后，辣椒青枯病的生物防治率高達(dá)70%以上。2)該肥料為有機(jī)肥，含有豐富的有機(jī)質(zhì)，而且大部分為氨基酸和小分子多肽。有機(jī)肥料中含有的豐富營養(yǎng)也為其中的拮抗菌提供了生長繁殖的條件，使其在土壤中存活下來并形成優(yōu)勢種群，從而發(fā)揮防病作用。3)由于是生物菌株制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于辣椒的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少防治青枯病的化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于農(nóng)產(chǎn)品的出口。同時(shí)，該微生物有機(jī)肥料還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。四圖1施用拮抗菌a45和微生物有機(jī)肥對辣椒根系病原菌的影響五具體實(shí)施例方式(一)菌株的分離和鑒定以辣椒青枯病病原菌青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)(德國的菌種保藏中心(DSMZ)，Ralstoniasolanacearum(DSMNo.9544)，辣椒青枯病拮抗菌株的篩選及田間防效的測定，《中國生物防治》2001年，第17卷，第03期，郭堅(jiān)華等)為指示菌從來自于辣椒青枯病發(fā)病田塊中的健康辣椒植株根際土壤中分離拮抗菌。再通過盆栽試驗(yàn)最終篩選出高效拮抗菌株a45，鑒定到屬種，菌種于30%甘油中-70°C保存。拮抗菌a45，屬于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，芽孢中生或近中生，橢圓形，孢囊不膨大，沒有伴孢晶體；發(fā)酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇產(chǎn)酸，能水解淀粉和液化明膠，接觸酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P(Voges-Proskauer)反應(yīng)均為陽性，而甲基紅反應(yīng)、丙二酸利用、酒石酸鹽利用均為陰性；在LB平板上30°C培養(yǎng)24h后，菌落周邊不規(guī)則，不透明，具有運(yùn)動(dòng)性。(二)菌劑生產(chǎn)1)菌株接種到PDA培養(yǎng)液中進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為初始pH范圍為7.0-7.2，培養(yǎng)溫度30°C，170轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，獲得a45拮抗菌液(LC)含菌或芽孢量彡5XIO9個(gè)/ml;所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制1L培養(yǎng)基為例用200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調(diào)至7.2-7.4，121°C滅菌20min。2)有機(jī)肥(OF)的制備以腐熟的豬糞堆肥、牛糞堆肥和氨基酸有機(jī)肥(江蘇新天地氨基酸肥料有限公司，肥料名稱氨基酸有機(jī)肥，登記證號(hào)蘇農(nóng)肥(2008)準(zhǔn)字0180號(hào)，肥料規(guī)格N+P205+K20≥6%有機(jī)質(zhì)≥30%氨基酸彡5%)以體積比33;4混合制成。所用腐熟的豬糞、牛糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2%,含水量25-30%。3)將a45拮抗菌液按20%(V/W)的比例接種到步驟2)所述有機(jī)肥中進(jìn)行二次固體發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30-50°C，發(fā)酵過程中每天翻堆1次，發(fā)酵發(fā)酵周期5-7天，使拮抗菌含量達(dá)到2.0X109f/g以上，獲得拮抗菌a45的固體菌劑。最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，獲得防治辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料(B0F)。用上述拮抗菌所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥(B0F)(防治辣椒青枯病的專用微生物有機(jī)肥料)，該肥料中含有2.OX109個(gè)/g的拮抗菌a45、全氮含量為33.lgkg_S全磷含量為13.3gkg—1、全鉀含量為21.3gkg—1。(三)溫室盆栽試驗(yàn)供試?yán)苯菲贩N中椒4號(hào)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，育苗45片真葉后移栽到裝有5kg土壤的盆缽中。盆缽設(shè)置5個(gè)處理1)健康土壤(cig；2)健康土壤+辣椒青枯病病原菌(CK2)；3)健康土壤+辣椒青枯病病原菌+有機(jī)肥(CK2+0F)；4)健康土壤+辣椒青枯病病原菌+a45拮抗菌液(CK2+LC)；5)健康土壤+辣椒青枯病病原菌+微生物有機(jī)肥(CK2+B0F)。每種處理設(shè)三個(gè)區(qū)組，每個(gè)區(qū)組十二個(gè)重復(fù)。其中有機(jī)肥(OF)和微生物有機(jī)肥施用量(B0F)為5%。，沒有添加有機(jī)肥的處理用氮、磷、鉀肥補(bǔ)齊養(yǎng)分。按照設(shè)置將病原菌和拮抗菌分別接種到土壤中，接種病原菌的土壤中病原菌含量為9.6X106個(gè)/g土，接種拮抗菌的土壤中拮抗菌的含量為1.0X107個(gè)/g土，具體做法是采用含菌量為2.0X109個(gè)/g的微生物有機(jī)肥，按照5%。施肥量(即5Kg土壤中使用25g)進(jìn)行施肥，使得土壤中拮抗菌的含量為1.0X107個(gè)。辣椒生長15天后每天調(diào)查青枯病發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果(病情指數(shù)=E(各級(jí)病株數(shù)X相應(yīng)級(jí)數(shù))/調(diào)查總植株數(shù)X100；防治效果=(對照區(qū)病情指數(shù)一處理區(qū)病情指數(shù))/對照區(qū)病情指數(shù)x100；病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)無病狀；I級(jí)1/4葉片發(fā)病；II級(jí)1/2葉片發(fā)病；III級(jí)整株死亡)。結(jié)果顯示，施用拮抗菌液體菌劑和微生物有機(jī)肥對辣椒青枯病的生物防治率分別為69.58%和76.09%(表1)。同時(shí)還能顯著減少根際病原菌的數(shù)量(圖1)，延緩a45的數(shù)量下降。試驗(yàn)結(jié)果表明，施用微生物有機(jī)肥不但可以起到防治辣椒青枯病，大大減少土壤中青枯病原菌數(shù)量的作用，還促進(jìn)辣椒根際微生物群落的變化，有益細(xì)菌、放線菌及真菌群落均顯著增加(表2)。表1拮抗菌a45及其與有機(jī)肥復(fù)合施用對防治辣椒青枯病的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2施用微生物有機(jī)肥對辣椒根際土壤中微生物區(qū)系的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求用于防治辣椒青枯病的拮抗菌a45，屬于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，2009年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3480，主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，芽孢中生或近中生，橢圓形，孢囊不膨大，沒有伴孢晶體；發(fā)酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇產(chǎn)酸，能水解淀粉和液化明膠，接觸酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P反應(yīng)均為陽性，而甲基紅反應(yīng)、丙二酸利用、酒石酸鹽利用均為陰性；在LB平板上30℃培養(yǎng)24h后，菌落周邊不規(guī)則，不透明，具有運(yùn)動(dòng)性。2.用權(quán)利要求1所述防治辣椒青枯病的拮抗菌a45所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料，其特征在于該肥料中含有2.OXIO9個(gè)/g以上的拮抗菌a45、全氮含量為33.Igkg—1，全磷含量為13.3gkg-1、全鉀含量為21.3gkg—1。4.權(quán)利要求2或3所述防治辣椒青枯病微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1)將權(quán)利要求1所述的菌株a45接種到PDA培養(yǎng)液中進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為初始PH范圍為7.0-7.2，培養(yǎng)溫度30°C，170轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵獲得的a45拮抗菌液含菌或芽孢量>5XIO9個(gè)/ml；2)有機(jī)肥的制備以腐熟的豬糞堆肥、腐熟的牛糞堆肥和氨基酸有機(jī)肥以體積比3:3:4比例混合制成；3)將a45拮抗菌液按體積質(zhì)量比20%的比例接種到步驟2)所述有機(jī)肥中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30-50°C，發(fā)酵過程中每天翻堆1次，發(fā)酵周期5-7天，使拮抗菌含量達(dá)到2.0XIO9個(gè)/g以上，最后在溫度不超過60°C的條件下將含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為獲得的防治辣椒青枯病的微生物有機(jī)肥料。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟1)所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例用200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調(diào)至7.2-7.4，121°C滅菌20min。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，所用腐熟的豬糞堆肥、腐熟的牛糞堆肥發(fā)芽指數(shù)均為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2%，含水量25-30%ο7.權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及用于防治辣椒青枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離到了對辣椒青枯病病原細(xì)菌有顯著拮抗作用的一株拮抗菌(枯草芽孢桿菌a45)，利用該拮抗菌與有機(jī)堆肥制成抗病微生物有機(jī)肥料，肥料中含有2.0×109個(gè)/g以上的a45，全氮含量為33.1gkg-1、全磷含量為13.3gkg-1、全鉀含量為21.3gkg-1。試驗(yàn)表明，這種微生物有機(jī)肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優(yōu)勢群，對辣椒青枯病防治率高達(dá)70％。文檔編號(hào)A01N63/02GK101805716SQ20101013822公開日2010年8月18日申請日期2010年4月2日優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日發(fā)明者冉煒,楊興明,江歡歡,沈其榮,沈標(biāo)申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)