專利名稱：東方百合種質(zhì)資源離體保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組培快繁與種質(zhì)資源保存技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種延長(zhǎng)東方百合 種質(zhì)的離體保存方法。
背景技術(shù)：
東方百合(Oriental hybrid lily)為多年生觀賞植物，主要用于切花栽培，近年 我國(guó)百合切花生產(chǎn)量年增長(zhǎng)達(dá)20%以上。由于東方百合植株形態(tài)優(yōu)美，切花品質(zhì)優(yōu)良，較抗 灰霉病，對(duì)光周期不敏感，鱗莖耐冷貯性良好等特性，在我國(guó)又可以利用不同緯度和海拔的 氣候差異，結(jié)合設(shè)施栽培實(shí)現(xiàn)百合切花的周年生產(chǎn)，生產(chǎn)效益較高，故具有很好的市場(chǎng)開發(fā) 前景。目前我國(guó)的東方百合種球主要依賴國(guó)外進(jìn)口，限制國(guó)內(nèi)百合種球生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸因 子是缺乏優(yōu)良新品種的培育，其中種質(zhì)資源的收集、保存和利用工作滯后，使育種原始資源 材料潰泛，是目前影響我國(guó)百合新品種選育進(jìn)程的重要因素之一。百合的傳統(tǒng)繁殖和保存 方法是采用鱗片扦插繁育，每年進(jìn)行田間種植，需消耗大量的人力、物力和財(cái)力，而且鱗莖 本身很容易感染鐮刀菌、絲核菌和腐霉菌等真菌性病害，且易傳播包括百合無(wú)癥病毒在內(nèi) 的數(shù)種病毒病，通過多年的無(wú)性繁殖很容易造成真菌、病毒等病蟲害蔓延，造成資源的丟失 與退化，這給百合種質(zhì)資源的利用和保存帶來(lái)巨大損失。當(dāng)前，植物種質(zhì)資源的保存方法主要有田間種植保存，離體低溫或超低溫保存，組 織培養(yǎng)離體保存等方法。其中，離體保存因不受外界環(huán)境條件的影響，具有田間生長(zhǎng)保存 無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。有關(guān)植物離體保存技術(shù)已有不少報(bào)導(dǎo)，如專利ZL200710164732.4報(bào)導(dǎo) 了一種通過減少培養(yǎng)基中大量元素，添加甘露醇和青霉素進(jìn)行彩色馬蹄蓮種質(zhì)離體保存方 法，CN200710019345. 1和CN200710019346. 6分別報(bào)導(dǎo)了通過添加脫落酸和減少培養(yǎng)基中 大量元素進(jìn)行菊花離體保存的方法，發(fā)明名稱為“石斛屬培養(yǎng)物的離體保存方法”(申請(qǐng)?zhí)?200810058045. 9)報(bào)道了通過降低MS濃度，在15 20°C條件下進(jìn)行石斛試管苗離體保存 的方法。發(fā)明名稱為“一種營(yíng)養(yǎng)繁殖花卉石蒜的超低溫保存方法”介紹了超低溫方式對(duì)植 物進(jìn)行離體保存的方法，如彩色馬蹄蓮種質(zhì)離體保存期可達(dá)12個(gè)月，菊花離體保存期達(dá)10 個(gè)月。上述專利涉及的彩色馬蹄蓮、菊花和石斛均采用具有葉片的組培苗進(jìn)行保存，但 簡(jiǎn)單的運(yùn)用以上方法并不適用于東方百合的種質(zhì)保存；而石蒜的超低溫保存方法具有需要 嚴(yán)格的保存設(shè)備條件和保存后的恢復(fù)培養(yǎng)難度較大等缺陷。因?yàn)闁|方百合的鱗莖生長(zhǎng)有其 特殊性，如其鱗莖底盤切口部位易產(chǎn)生愈傷組織，如方法不當(dāng)極易造成鱗莖組織的壞死而 影響長(zhǎng)期培養(yǎng)的保存效果；且普通的離體保存方法均在20士2°C和光照條件下進(jìn)行，會(huì)導(dǎo) 致百合鱗莖芽的外層鱗片分化出葉片，生長(zhǎng)一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)老化和枯死的現(xiàn)象，但如采 用13 15°C或5 10°C更低的溫度培養(yǎng)時(shí)，則又會(huì)使試管鱗莖解除休眠而誘導(dǎo)頂芽的分 化和出葉，造成試管鱗莖瓶?jī)?nèi)抽莖和葉片再次發(fā)生的現(xiàn)象，上述現(xiàn)象均不利于鱗莖養(yǎng)分的 積累和長(zhǎng)期保存的目的。目前，尚未見有關(guān)于東方百合種質(zhì)資源離體保存方面的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)現(xiàn)有百合種質(zhì)資源離體保存方法中所存在的鱗莖組織易壞 死，和外層鱗片易分化出葉、老化、枯死及不利于鱗莖養(yǎng)分積累、保存期限短等的缺陷，提出 一種保存種性質(zhì)量好，保存期長(zhǎng)、且可自行調(diào)節(jié)、延長(zhǎng)，成本低廉，操作簡(jiǎn)便，適于東方百合 種質(zhì)資源離體保存的方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)東方百合種質(zhì)資源離體保存方法，該方法按如下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制包括基本培養(yǎng)基和離體保存各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在 每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量為a)基本培養(yǎng)基其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為蔗糖30 50g/L，瓊脂粉4 5g/L，pH5. 6 5. 8的MS培養(yǎng)基；
增殖培養(yǎng)基為蔗糖50 60g/L，瓊脂粉4 5g/L，pH5. 6 5. 8的3/5MS培養(yǎng)基；離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基為蔗糖60 75g/L，瓊脂粉4. 0 5. Og/L, pH5. 6 6. 0的1/2MS培養(yǎng)基；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 I :MS+6-BA 1. 0 2. Omg/L+IBA 0. 1 0. 5mg/L+ACl. 0 3. Omg/ L；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 II :MS+6-BA 0. 5 1. Omg/L+IBA 0. 1 0. 5mg/L ；d) ±曾殖培養(yǎng)基:3/5MS+6-BA0. 2 1. Omg/L+IBA 0. 1 0. 5mg/L ；e)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基d/^MS+NAA 0. 1 0. 5mg/L+PP333 1 10mg/L+ 甘露醇 1. 0 5. 0g/L+AC 1. 0 5. 0mg/L ；(2)種源鱗莖處理與滅菌將種源鱗莖以5°C低溫處理3 4個(gè)月打破其休眠； 再用透氣塑料薄膜包裹該鱗莖置于含水量為60 70%的潮濕泥炭中，置50°C培養(yǎng)箱內(nèi)熱 處理70 90min ；剝離外層鱗片，取其內(nèi)4 6cm長(zhǎng)的種源鱗莖芽，用1 %洗潔精液浸泡 IOmin,經(jīng)清水沖洗后進(jìn)行種源鱗莖芽滅菌處理后，備用；(3)鱗莖芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)取滅菌后種源鱗莖芽剝?nèi)∑鋬?nèi)0. 2 0. 3mm的莖尖作為 外植體，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20 士 1°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000 3000Lx的環(huán) 境條件下培養(yǎng)50 60d至誘導(dǎo)出鱗莖芽；將該鱗莖芽切去頂部葉片并縱向切成2塊后轉(zhuǎn)接 至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在同上環(huán)境條件下培養(yǎng)60 90d至誘導(dǎo)形成叢生狀鱗莖芽；放入光照培 養(yǎng)箱內(nèi)按30°C、35°C、38°C的順序，每3d變換一檔進(jìn)行循環(huán)熱處理50 60d后，剝?nèi)∑鋬?nèi) 0. 2 0. 3mm的莖尖為外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基II進(jìn)行二次誘導(dǎo)培養(yǎng)，在同上環(huán)境條件下 培養(yǎng)60 90d至誘導(dǎo)形成鱗莖芽后，置6°C低溫處理45 60d，以恢復(fù)該鱗莖芽的生長(zhǎng)活 性；(4)鱗莖芽的增殖培養(yǎng)將低溫處理后的鱗莖芽，切去葉片和部分基部組織后縱 切成4 6塊接種在增殖培養(yǎng)基上，在20 士 1°C、黑暗條件下培養(yǎng)60 90d至形成健壯的鱗
莖芽；(5)種質(zhì)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽切去芽頂部和部 分基部組織并縱向切成4 6塊后接種在離體保存培養(yǎng)基中，在20士2°C和黑暗條件下培 養(yǎng)12-15個(gè)月至膨大形成直徑為0. 8 1. 2cm的試管鱗莖；即出苗或切除該試管鱗莖根系 并縱向切成4 6塊后接種在離體保存培養(yǎng)基中，在相同條件下可循環(huán)再進(jìn)行1-4次的保存與膨大培養(yǎng)；4次后則需經(jīng)田間種植恢復(fù)后再按上述步驟進(jìn)行離體再保存，直至滿足對(duì)該種質(zhì)離體保存期的需要；(6)試管鱗莖的出苗與冷藏將試管鱗莖用清水洗去瓊脂、包裹于消毒過的含水 量為60 70%的泥炭中，10 12°C預(yù)處理10 20d后，于3 6°C冷藏處理50 60d至 打破休眠期后，即定植或在1 ;TC 2 3個(gè)月的延長(zhǎng)貯藏期內(nèi)擇時(shí)定植；(7)定植選擇海拔1000 1900米具夏季冷涼氣候的山區(qū)，在避雨和防蟲隔離條 件下，將步驟(6)冷藏后的鱗莖于4月下旬至5月中旬定植在消毒過的基質(zhì)里，15 20d后 始萌芽出苗、生長(zhǎng)；(8)種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)選擇生長(zhǎng)正常，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，經(jīng)ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)為未 發(fā)生遺傳變異的植株，培育成合格的東方百合種球。所述的種源鱗莖芽滅菌處理為75%酒精浸泡0. 5 1. Omin,無(wú)菌水沖洗6次，再 用0. 1 %升汞溶液滅菌15 20min，無(wú)菌水沖洗6次，再用10 %的次氯酸鈉水溶液滅菌13 15min，無(wú)菌水沖洗6次。所述的定植基質(zhì)為泥炭珍珠巖按體積比7 3配制而成。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明采用V2MS培養(yǎng)基，添加蔗糖60 75g/L、NAA 0. 1 0. 5mg/L、PP333 1 10mg/L、甘露醇1. O 5. Og/L和AC 1. 0 5. Omg/L,與常規(guī)離體保存方法相比，培養(yǎng)基 中降低了 MS濃度，提高了蔗糖濃度和NAA濃度，免去了 6-BA，增添PP333、甘露醇和AC，達(dá)到 控制愈傷組織生長(zhǎng)、直接誘導(dǎo)出鱗莖芽；并將鱗莖芽的離體保存、試管鱗莖膨大培養(yǎng)二個(gè)步 驟合而為一，通過以上配方與方法的改進(jìn)，使轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的間隔時(shí)間由普通MS培養(yǎng)基保存的 6個(gè)月左右延長(zhǎng)至12-15個(gè)月，成活率達(dá)100%，大大節(jié)省了轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的用工，顯著提高了東 方百合試管鱗莖的離體保存效率，離休保存效率提高50 60%。(2)本發(fā)明在“離體保存培養(yǎng)”步驟中全程采用了暗培養(yǎng)，使鱗莖芽的出葉率為0， 而普通采用的光照培養(yǎng)其鱗莖芽出葉率可達(dá)90%以上，由于葉片生長(zhǎng)導(dǎo)致養(yǎng)分大量消耗， 既不利于試管鱗莖的膨大，又由于葉片生長(zhǎng)一定周期后會(huì)出現(xiàn)老化枯死的現(xiàn)象，導(dǎo)致每6 個(gè)月必須轉(zhuǎn)接1次，而暗培養(yǎng)12-15個(gè)月后因培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)耗完才需要轉(zhuǎn)接一次；另外，光照 培養(yǎng)明顯增加了能耗，因此本發(fā)明有利于控制鱗莖芽葉片生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了轉(zhuǎn)接周期，離體保存 的成本僅為普通光照培養(yǎng)方法的1/2。(3)本發(fā)明所保存的試管鱗莖根系發(fā)達(dá)，至一次保存期結(jié)束(12-15個(gè)月)試管鱗 莖重量可達(dá)0. 5g/粒以上，根數(shù)量在15條/粒以上，且便于低溫處理，經(jīng)3 6°C低溫處理 至打破休眠的試管鱗莖，既可立刻定植，也可在1 ；TC 2 3個(gè)月的延長(zhǎng)貯藏期內(nèi)，根據(jù)氣 候、土壤條件選擇適宜時(shí)期集中定植，便于栽培管理，從而克服了傳統(tǒng)的生根組培苗出瓶后 必須隨時(shí)定植不能延誤，導(dǎo)致成活率低下的難題，定植成活率可達(dá)95 %以上，而一般生根組 培苗的根數(shù)量在5條/株，定植成活率為70%左右。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。以下實(shí)施例所涉東方百合種源為Oriental Hybrid ‘Sibreia，品種周莖為14 16cm的鱗莖。
實(shí)施例1 :(東方百合種質(zhì)資源離體保存1)具體方法按以下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制包括基本培養(yǎng)基和離體保存各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量為a)基本培養(yǎng)基其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為蔗糖40g/L，瓊脂粉4g/L，pH5. 8的MS培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)基為蔗糖50g/L，瓊脂粉5g/L，pH5. 6的3/5MS培養(yǎng)基；離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基為蔗糖60g/L，瓊脂粉5. Og/L，pH5. 6的 1/2MS培養(yǎng)基；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 I :MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+AC 2. Omg/L ；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 II :MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. 25mg/L ；d) ±曾殖培養(yǎng)基:3/5MS+6-BAl. Omg/L+IBAO. 5mg/L ；e)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0. lmg/L+PP333 lmg/L+甘 露醇 1. Og/L+AC 1. Omg/L ；(2)種源鱗莖處理與滅菌將種源鱗莖以5°C低溫處理3 4個(gè)月打破其休眠；再 用透氣塑料薄膜包裹該鱗莖置于含水量為60 70%的潮濕泥炭中，置50°C培養(yǎng)箱內(nèi)熱處 理70min ；剝離外層鱗片，取其內(nèi)4 6cm長(zhǎng)的種源鱗莖芽，用洗潔精液浸泡lOmin，用 水清洗后，再經(jīng)75%酒精浸泡0. 5min，無(wú)菌水沖洗6次，再用0. 1 %升汞溶液滅菌15min，無(wú) 菌水沖洗6次，用10%次氯酸鈉水溶液滅菌15min，用無(wú)菌水沖洗6次進(jìn)行滅菌處理后，備 用；(3)鱗莖芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)取滅菌后種源鱗莖芽剝?nèi)∑鋬?nèi)0. 2 0. 3mm的莖尖作為 外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20 士 1°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下 培養(yǎng)55d至誘導(dǎo)出鱗莖芽；將該鱗莖芽切去頂部葉片并縱向切成2塊后轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基 I，在同上環(huán)境條件下培養(yǎng)60d至誘導(dǎo)形成叢生狀鱗莖芽；放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30°C、35°C、 38°C的順序，每3d變換一檔進(jìn)行循環(huán)熱處理60d后，剝?nèi)∑鋬?nèi)0. 2 0. 3mm的莖尖為外植 體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基II進(jìn)行二次誘導(dǎo)培養(yǎng)，在同上環(huán)境條件下培養(yǎng)80d至誘導(dǎo)形成鱗莖芽 后，置6°C低溫處理45d，以恢復(fù)該鱗莖芽的生長(zhǎng)活性；(4)鱗莖芽的增殖培養(yǎng)將低溫處理后的鱗莖芽，切去葉片和部分基部組織后縱 切成4 6塊接種在增殖培養(yǎng)基上，在20 士 1 °C、黑暗條件下培養(yǎng)90d至形成健壯的鱗莖芽；(5)種質(zhì)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽切去芽頂部和部 分基部組織并縱向切成4 6塊后接種在離體保存培養(yǎng)基中，在20士2°C和黑暗條件下培 養(yǎng)12個(gè)月至膨大形成直徑為0. 8 1. 2cm的試管鱗莖；為延長(zhǎng)保存期，切除該試管鱗莖根 系并縱向切成4 6塊后接種在離體保存培養(yǎng)基中，在相同條件下又進(jìn)行1次再保存與膨 大培養(yǎng)后，即已滿足對(duì)該種質(zhì)離體保存期的需要；(6)試管鱗莖出苗與冷藏將試管鱗莖用清水洗去瓊脂、包裹于消毒過的含水量 為60 70%的泥炭中，10°C預(yù)處理20d后，于6°C冷藏處理50d至打破休眠期后，即可定植 或在1 ；TC 2 3個(gè)月的延長(zhǎng)貯藏期內(nèi)擇時(shí)定植；(7)定植選擇海拔1000 1900米具夏季冷涼氣候的山區(qū)，在避雨和防蟲隔離條 件下，將步驟(6)冷藏后的鱗莖于4月下旬至5月中旬定植在消毒過的基質(zhì)里，15 20d后始萌芽出苗、生長(zhǎng)；(8)種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)選擇生長(zhǎng)正常，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，經(jīng)ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)(具體見實(shí)施例4)為未發(fā)生遺傳變異的植株，培育成合格的東方百合種球。實(shí)施例2 (東方百合種質(zhì)資源離體保存2)本例中，步驟(1)培養(yǎng)基的配制為a)基本培養(yǎng)基其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為蔗糖30g/L，瓊脂粉4. 5g/L，pH5. 6的MS培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)基為蔗糖55g/L，瓊脂粉4. 5g/L，pH5. 7的3/5MS培養(yǎng)基；離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基為蔗糖68g/L，瓊脂粉4. 5g/L，pH5. 8的 1/2MS培養(yǎng)基；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 I :MS+6-BA 2. Omg/L+IBA 0. 5mg/L+AC 1. Omg/L ；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 II :MS+6-BA 0. 75mg/L+IBA 0. lmg/L ；d) ±曾殖培養(yǎng)基:3/5MS+6-BA0. 2mg/L+IBA0. lmg/L ；e)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0. 5mg/L+PP333 5mg/L+甘 露醇 5. Og/L+AC 5. Omg/L ；步驟(2)種源鱗莖處理與滅菌置50°C培養(yǎng)箱內(nèi)熱處理SOmin ；其滅菌處理為 75%酒精浸泡lmin，0. 升汞溶液滅菌20min，10%次氯酸鈉水溶液滅菌13min ；步驟(3) 鱗莖芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20士 1°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度 IOOOLx的環(huán)境條件下培養(yǎng)60d ；在同上環(huán)境條件下再培養(yǎng)90d ；循環(huán)熱處理50d后，剝?nèi)∑?外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，培養(yǎng)60d后，置6°C低溫處理60d;步驟(4)鱗莖芽的增殖培 養(yǎng)在20士 1°C、黑暗條件下培養(yǎng)75d;步驟(5)種質(zhì)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)在 20士2°C和黑暗條件下培養(yǎng)13個(gè)月；為延長(zhǎng)保存期，在相同條件下又進(jìn)行3次再保存與試管 鱗莖膨大同步培養(yǎng)后，才滿足對(duì)該種質(zhì)離體保存期的需要；步驟(6)試管鱗莖出苗與冷藏 經(jīng)irC預(yù)處理15d后，于4°C冷藏處理55d后擇時(shí)定植；其余步驟、工藝同實(shí)施例1。實(shí)施例3 (東方百合種質(zhì)資源離體保存方法3)本例中，步驟(1)培養(yǎng)基的配制為a)基本培養(yǎng)基其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為蔗糖50g/L，瓊脂粉5. Og/L, pH5. 7的MS培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)基為蔗糖60g/L，瓊脂粉4. 0g/L, pH5. 8的3/5MS培養(yǎng)基；離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基為蔗糖75g/L，瓊脂粉4. 0g/L, pH6. 0的 1/2MS培養(yǎng)基；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 I :MS+6-BA 1. 5mg/L+IBA 0. 3mg/L+AC 3. 0mg/L ；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 II :MS+6-BA 0. 5mg/L+IBA 0. 5mg/L ；d) ±曾殖培養(yǎng)基:3/5MS+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 3mg/L ；e)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0. 3mg/L+PP333 10mg/L+甘 露醇 3. 0g/L+AC 3. 0mg/L ；步驟(2)種源鱗莖處理與滅菌置50°C培養(yǎng)箱內(nèi)熱處理90min;其滅菌處理為 75%酒精浸泡0. 75min,0. 升汞溶液滅菌18min，10%次氯酸鈉水溶液滅菌14min ；步驟 (3)鱗莖芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20士 1 °C，光照12h/d，光照強(qiáng)度3000Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)50d ；在同上環(huán)境條件下再培養(yǎng)70d ；循環(huán)熱處理55d后，剝?nèi)∑?外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，培養(yǎng)90d后，置6°C低溫處理50d;步驟(4)鱗莖芽的增殖培 養(yǎng)在20 士 1°C、黑暗條件下培養(yǎng)60d;步驟(5)種質(zhì)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)在 20士2°C和黑暗條件下先培養(yǎng)15個(gè)月；為延長(zhǎng)保存期再保存4次后，經(jīng)田間種植恢復(fù)后再按 上述步驟又進(jìn)行1次再保存，才滿足對(duì)該種質(zhì)離體保存期的需要；步驟(6)試管鱗莖出苗與 冷藏經(jīng)12°C預(yù)處理IOd后，于3°C冷藏處理60d后擇時(shí)定植；其余步驟、工藝同實(shí)施例1。實(shí)施例4 (對(duì)種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)方法)(1)植物材料百合鱗莖和試管鱗莖(2)百合DNA提取及濃度測(cè)定采用植物基因組DNA提取(TIANGEN)試劑盒，分別 對(duì)每個(gè)百合樣品進(jìn)行總DNA的抽提，所用試劑器皿均滅菌處理，具體操作流程如下a)稱取約0. Ig的新鮮百合樣品，加入液氮充分研磨；b)將磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μ L 65°C預(yù)熱緩沖液GPl的離心管中 (實(shí)驗(yàn)前在預(yù)熱的GPl中加入巰基乙醇，使其終濃度為0. 1% )，迅速顛倒混勻后，將離心管 放在65°C水浴20min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；c)加入等體積的酚氯仿(1 1)，充分混勻后，13，400g離心5min，將上清液移 至新的離心管中；d)加入700 μ L氯仿，充分混勻，13，400g離心5min ；e)小心將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管，加入700 μ L緩沖液GP2，充分混 勻；f)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，13，400g離心30s，棄掉廢液(吸附柱容積為 700 μ L左右，可分次加入離心)；g)向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，13，400g離心30s，棄掉廢液，將吸附柱 CB3放入收集管中；h)向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液PW，13，400g離心30s，棄掉廢液，將吸附柱 CB3放入收集管中；i)向吸附柱CB3中加入500 μ L漂洗液Pff, 13，400g離心30s,棄掉廢液；j)將吸附柱CB3放回收集管中，13，400g離心2min，棄掉廢液，將吸附柱CB3室溫 放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；k)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加80 μ L洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2-5min，13，400g離心2min，將溶液收集到離心管中；用瓊脂糖 凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量，用美國(guó)BECKMAN DU2530型核酸/蛋白分析儀檢測(cè)DNA純度和濃度，并 將其稀釋為20ng/y L的工作液備用，于_20°C保存；(3) ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件經(jīng)正交優(yōu)化試驗(yàn)確定為20 μ L體系，采用Fermentas公司 Taq酶和dNTP，引物由invitrogen公司合成，各反應(yīng)成分用量分別為10XPCR 緩沖液 2· 0μ L，25mmol/L MgCl2 1. 2μ L,2. 5mmol/L dNTP 1. 6μ L, ΙΟμ θΙ/L 弓丨物 1 μ L，20ng/μ L 模板 DNA 1 μ L，Taq 酶(5U/ μ L) 0. 1 μ L, ddH20 13. 1 μ L ；ISSR-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min ；94°C變性 45s、52°C退火 45s、72°C延伸 1. 5min，循環(huán)38次，72 °C終延伸7min，4°C下保存；
(4) ISSR引物的篩選利用加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia，UBC)及日本Masumi Yamagishi等人在百合研究中所采用的ISSR引物序列所提供的50個(gè)公用ISSR引 物，經(jīng)試驗(yàn)篩選出適用于百合遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)的5個(gè)引物，(1)5'-ACACACACACACACACYG-3‘； ⑵ 5，-TCTCTCTCTCTCTCTCG-3，；(3) 5，-CTCCTCCTCCTCRC-3，；⑷ 5，-CTCTCTCTCTCTCTCTG-3，； (5) 5 ‘ -CTCTCTCTCTCTCTGTG-3 ‘。根據(jù)英駿生物合成引物的熔解溫度(meltingtemperature， Tm)值，用百合品種‘Siberia、，‘ 1038，、‘ 1068-2，和‘1078-4，的種質(zhì)原始材料和離體保 存材料的DNA為模板，進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，篩選的引物遵守如下原則1)產(chǎn)生的DNA帶清晰 可辨；2)在分析的樣品之間有較高的多態(tài)性；3)產(chǎn)生多態(tài)性DNA譜帶具有重復(fù)性；篩選出 多態(tài)性高的引物及其最適退火溫度，再對(duì)全部材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(5) PCR擴(kuò)增及電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% Agarose Gel瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠電泳成像系統(tǒng) 對(duì)凝膠檢測(cè)并照相、保存；(6)數(shù)據(jù)處理電泳圖譜的每條帶DNA片段均為1個(gè)分子標(biāo)記，代表1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)，以長(zhǎng)度 在100-1500bp范圍內(nèi)的PCR擴(kuò)增片段用于統(tǒng)計(jì)分析，以0或1統(tǒng)計(jì)建立二元數(shù)據(jù)矩陣，在 相同遷移位置，有擴(kuò)增帶記為1，無(wú)帶記為0 ；采用P0PGENE 1. 32軟件分析遺傳距離和遺傳 相似系數(shù)等遺傳多樣性指數(shù)，用NTSYSpc 2. 02c軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析，分析經(jīng)離體保存 樣品和對(duì)照樣品間的遺傳距離，以此確定離體保存材料的遺傳穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
東方百合種質(zhì)資源離體保存方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制包括基本培養(yǎng)基和離體保存各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量為a)基本培養(yǎng)基其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為蔗糖30～50g/L，瓊脂粉4～5g/L，pH5.6～5.8的MS培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)基為蔗糖50～60g/L，瓊脂粉4～5g/L，pH5.6～5.8的3/5MS培養(yǎng)基；離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基為蔗糖60～75g/L，瓊脂粉4.0～5.0g/L，pH5.6～6.0的1/2MS培養(yǎng)基；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基IMS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基IIMS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；d)增殖培養(yǎng)基3/5MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；e)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+PP333 1～10mg/L+甘露醇1.0～5.0g/L+AC 1.0～5.0mg/L；(2)種源鱗莖處理與滅菌將種源鱗莖以5℃低溫處理3～4個(gè)月打破其休眠；再用透氣塑料薄膜包裹該鱗莖置于含水量為60～70％的潮濕泥炭中，置50℃培養(yǎng)箱內(nèi)熱處理70～90min；剝離外層鱗片，取其內(nèi)4～6cm長(zhǎng)的種源鱗莖芽，用1％洗潔精液浸泡10min，經(jīng)清水沖洗后進(jìn)行種源鱗莖芽滅菌處理后，備用；(3)鱗莖芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)取滅菌后種源鱗莖芽剝?nèi)∑鋬?nèi)0.2～0.3mm的莖尖作為外植體，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)50～60d至誘導(dǎo)出鱗莖芽；將該鱗莖芽切去頂部葉片并縱向切成2塊后轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在同上環(huán)境條件下培養(yǎng)60～90d至誘導(dǎo)形成叢生狀鱗莖芽；放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30℃、35℃、38℃的順序，每3d變換一檔進(jìn)行循環(huán)熱處理50～60d后，剝?nèi)∑鋬?nèi)0.2～0.3mm的莖尖為外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基II進(jìn)行二次誘導(dǎo)培養(yǎng)，在同上環(huán)境條件下培養(yǎng)60～90d至誘導(dǎo)形成鱗莖芽后，置6℃低溫處理45～60d，以恢復(fù)該鱗莖芽的生長(zhǎng)活性；(4)鱗莖芽的增殖培養(yǎng)將低溫處理后的鱗莖芽，切去葉片和部分基部組織后縱切成4～6塊接種在增殖培養(yǎng)基上，在20±1℃、黑暗條件下培養(yǎng)60～90d至形成健壯的鱗莖芽；(5)種質(zhì)離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽切去芽頂部和部分基部組織并縱向切成4～6塊后接種在離體保存培養(yǎng)基中，在20±2℃和黑暗條件下培養(yǎng)12-15個(gè)月至切塊基部形成的鱗莖芽膨大成直徑為0.8～1.2cm的試管鱗莖；即可出苗或切除該試管鱗莖根系并縱向切成4～6塊后接種在離體保存培養(yǎng)基中，在相同條件下可循環(huán)再進(jìn)行1-4次的保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)；4次后則需經(jīng)田間種植恢復(fù)后再按上述步驟進(jìn)行離體再保存，直至滿足對(duì)該種質(zhì)離體保存期的需要；(6)試管鱗莖的出苗與冷藏將試管鱗莖用清水洗去瓊脂、包裹于消毒過的含水量為60～70％的泥炭中，10～12℃預(yù)處理10～20d后，于3～6℃冷藏處理50～60d至打破休眠期后，即定植或在1～3℃條件下2～3個(gè)月的延長(zhǎng)貯藏期內(nèi)擇時(shí)定植；(7)定植選擇海拔1000～1900米具夏季冷涼氣候的山區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，將步驟(6)冷藏后的鱗莖于4月下旬至5月中旬定植在消毒過的基質(zhì)里，15～20d后始萌芽出苗、生長(zhǎng)；(8)種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)選擇生長(zhǎng)正常，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，經(jīng)ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)為未發(fā)生遺傳變異的植株，培育成合格的東方百合種球。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種源鱗莖芽滅菌處理為75%酒精浸泡 0.5 1. Omin,無(wú)菌水沖洗6次，再用0. 1 %升汞溶液滅菌15 20min，無(wú)菌水沖洗6次，再 用10%的次氯酸鈉水溶液滅菌13 15min，無(wú)菌水沖洗6次。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的定植基質(zhì)為泥炭珍珠巖按體積比 7 3配制而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了東方百合種質(zhì)資源離體保存方法，屬于植物組培快繁與種質(zhì)資源保存技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括培養(yǎng)基的配制，種源鱗莖處理與滅菌，鱗莖芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，鱗莖芽的增殖培養(yǎng)，種質(zhì)離體保存與膨大培養(yǎng)，試管鱗莖的出苗與冷藏，定植，及種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)等步驟。本發(fā)明改進(jìn)了培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)步驟方法，使離體保存轉(zhuǎn)接培養(yǎng)周期達(dá)12-15個(gè)月，比MS培養(yǎng)基延長(zhǎng)6個(gè)月以上，經(jīng)檢測(cè)未發(fā)生遺傳變異，存活率高達(dá)100％，提高了離體保存效率，并顯著降低了保存成本。本發(fā)明可在東方百合育種與種球生產(chǎn)企業(yè)推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N3/00GK101796925SQ20101013898
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者丁曉瑜, 丁渭文, 向林, 孫崇波, 林森洪, 柴金甫, 袁峰, 賈燕嬌, 郭方其, 黎俠 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;紹興東方百合組培研發(fā)有限公司