專(zhuān)利名稱(chēng)：番茄谷氧還蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種番茄谷氧還蛋白基因 SlGRXl及其克隆方法和用途。本發(fā)明涉及番茄SlGRXl的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白屬 于CFGS類(lèi)谷氧還蛋白。
背景技術(shù)：
活性氧是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)傳導(dǎo)因子，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和新 陳代謝，以及作物的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)都起著重要的作用。然而，植物體內(nèi)過(guò)多的活性氧積累會(huì)對(duì) 破壞其體內(nèi)的生物大分子，干擾植物正常的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而對(duì)植物造成嚴(yán)重的傷害，容易造 成植物的萎蔫甚至死亡。植物生長(zhǎng)的各種逆境環(huán)境如干旱、鹽害、冷害、重金屬、紫外輻射、 臭氧、機(jī)械傷害、營(yíng)養(yǎng)缺乏、病原體入侵、高光強(qiáng)等均導(dǎo)致光合電子傳遞鏈及呼吸鏈產(chǎn)生過(guò) 量活性氧，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，從而降低植物的產(chǎn)量與品質(zhì)。為了抵抗環(huán)境的活性氧脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化的過(guò)程中形成了清除活性氧的復(fù) 雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括mRNA的降解與選擇性剪切、蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化、糖基化、泛 素化等。其中谷氧還蛋白基因在植物的抗氧化脅迫中起重要作用，該類(lèi)蛋白其能夠還原生 物體內(nèi)蛋白質(zhì)間或者蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵而形成巰基，維持蛋白的氧化還原狀態(tài)，從而調(diào) 控蛋白的活性。近年來(lái)，蛋白質(zhì)的可逆氧化還原修飾日益受到重視，這種修飾可能是信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)調(diào)控中的一種新的分子機(jī)制，成為除磷酸化修飾、糖基化修飾及泛素化修飾外的重要方 式。通過(guò)獲得新的谷氧還蛋白基因，研究其分子功能，對(duì)于研究植物抗逆的分子機(jī)理有重要 價(jià)值，也為植物的基因工程研究提供新的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前對(duì)植物抗逆反應(yīng)分子機(jī)制、抗逆植物基因資源匱乏等問(wèn) 題，提供一種番茄谷氧還蛋白基因SlGRXl及其克隆方法和用途。植物谷氧還蛋白基因SlGRXl是具有如SEQ ID NO 1所示1003個(gè)堿基DNA序列， 編碼具有抗氧化、干旱及鹽堿能力的CGFS類(lèi)的谷氧還蛋白。植物谷氧還蛋白基因SlGRXl的克隆方法包括下列步驟1)根據(jù)擬南芥和水稻的CGFS類(lèi)谷氧還蛋白基因，對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)，根據(jù)保守 的同源序列設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物Tl為5’-SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3’，下游 引物T2為5，-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3，，其中，W代表T或者A，S代表G或者C，M代 表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者 C，R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T ；2)用上述引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增基因片段，經(jīng)測(cè)序后與NCBI等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源 性比對(duì)，證明得到的片段為為番茄的谷氧還蛋白基因的片段；3)以上述擴(kuò)增的基因片段為種子序列，采用電子克隆的方法，在番茄 的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行電子延伸拼接，根據(jù)延伸的序列設(shè)計(jì)引物，上游引物YGS2為5，-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3，，下游引物 YGAS 為 5，-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3，，禾Ij 用RT-PCR克隆獲得到1003bp的基因片段，將該片段克隆到PGEM-T easy載體上測(cè)序，得到 的基因命名為SlGRXl ；番茄CGFS類(lèi)蛋白是具有權(quán)利要求1所述植物谷氧還蛋白基因SlGRXl編碼的如 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或者與其氨基酸序列至少60%同源性。植物谷氧還蛋白基因SlGRXl用于經(jīng)轉(zhuǎn)基因或雜交育種改良植物的抗氧化、干旱 及鹽堿的能力。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)1)采用同源克隆及電子克隆的方法從番茄中克隆到一個(gè)新的谷氧還蛋白基因，克 隆方法簡(jiǎn)單、高效。2)通過(guò)利用基因的下調(diào)和上調(diào)表達(dá)2種方法分析基因的功能，數(shù)據(jù)更為確鑿可 信，通過(guò)2種方法均證明該基因具有抗氧化、干旱及鹽堿的功能，具有很強(qiáng)的理論研究及應(yīng) 用研究?jī)r(jià)值?？梢酝ㄟ^(guò)外源基因?qū)爰夹g(shù)過(guò)量表達(dá)SlGRXl基因來(lái)提高植物對(duì)氧化、干旱及 鹽堿的能力，從而增強(qiáng)作物對(duì)逆境的抗性，提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。


圖1是SlGRXl基因的組織表達(dá)特異性；圖2是SlGRXl蛋白的亞細(xì)胞定位；圖3是SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株對(duì)氧化脅迫的反應(yīng)。A =SlGRXl基因沉默 番茄與對(duì)照植株葉盤(pán)在H2O2脅迫下Od和5d時(shí)的癥狀表現(xiàn)；B =SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照 植株葉盤(pán)的相對(duì)葉綠素含量隨時(shí)間變化；C =SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株中SlGRXl基 因的表達(dá)情況；圖4是SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株對(duì)干旱的反應(yīng)。A =SlGRXl基因沉默番茄 與對(duì)照植株在干旱處理Od和6d時(shí)的表型；B =SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株葉片的相對(duì) 含水量；C =SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株中SlGRXl基因的表達(dá)情況；圖5是SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株對(duì)鹽堿的反應(yīng)。A =SlGRXl基因沉默番茄 與對(duì)照植株在NaCl處理Od和IOd時(shí)的表型；B =SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株葉盤(pán)的相 對(duì)葉綠素含量；C =SlGRXl基因沉默番茄與對(duì)照植株中SlGRXl基因的表達(dá)情況；圖6是轉(zhuǎn)SlGRXl基因擬南芥及對(duì)照對(duì)氧化、干旱及鹽堿的抗性。A 轉(zhuǎn)基因擬南 芥及對(duì)照對(duì)氧化、干旱及鹽堿脅迫的反應(yīng)；B 轉(zhuǎn)基因擬南芥及對(duì)照在各種脅迫條件下的根 長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1番茄谷氧還蛋白基因的克隆根據(jù)擬南芥和水稻的CGFS類(lèi)谷氧還蛋白基因，根據(jù)保守的同源序列設(shè)計(jì)了 一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物Tl為5’ -SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3’，下游引物T2為 5，-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3，，其中，W 代表 T 或者 A，S 代表 G 或者 C，M 代表 A 或 者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C， R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序，通過(guò)與NCBI等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)證明得到的片段為為番茄的谷氧還蛋白基因。以該 片段為種子序列，采用電子克隆的方法，在番茄的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行延伸拼接，根據(jù)延伸 的序列設(shè)計(jì)引物，上游引物YGS2為5，-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3，，下游引物YGAS為 5，-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3，。利用 RT-PCR 技術(shù)獲得到 1003bp 的片段，序列如 SEQ ID N0:1所示。序列分析表明該基因是一個(gè)新的谷氧還蛋白基因，具有完整的開(kāi)放閱讀框， 編碼如SEQ ID NO :2所示292個(gè)氨基酸。該基因是第一個(gè)從番茄中克隆到的谷氧還蛋白基 因，將該基因命名為SlGRXl。將基因序列提交到Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì)表明SlGRXl是一 種新的谷氧還蛋白基因。由SlGRXl編碼的蛋白質(zhì)的剩余部分與任何已知序列無(wú)高度同源。實(shí)施例2S1GRX1基因的特性及功能分析和應(yīng)用1. SlGRXl基因的組織表達(dá)特性分析

為了分析該基因在番茄體內(nèi)的表達(dá)情況，分別用TRIzoI試劑提取番茄的葉片、 根、莖及花瓣中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用quantitative real time RT-PCR分析 SlGRXl在番茄體內(nèi)不同組織的表達(dá)情況，引物5，-ATGCGAGCATCGTTGTTGC-3，/5，-TCTATCTG GCTCCTCAACCACAC-3，用來(lái)擴(kuò)增目標(biāo) SlGRXl 基因；引物 5，-CACGAGGTATAATCTAGGGTTTG-3，/ 5，-ATTTTGTCAGGGTTGTATCCTAC-3，用來(lái)擴(kuò)增番茄的內(nèi)參基因EF-1-α。分析結(jié)果表明，在檢 測(cè)的組織中，均檢測(cè)到了該基因的表達(dá)，其中葉片中的表達(dá)量最高，根中的表達(dá)量最低(見(jiàn) 圖1).2. SlGRXl蛋白的亞細(xì)胞定位將SlGRXl基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體PCHF3并融合到GFP的C端，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 農(nóng)桿菌菌株EHA105中。用PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性的農(nóng)桿菌活化至0D_為0. 2-0. 8， 浸潤(rùn)4葉期的本氏煙葉片，48小時(shí)后在共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。結(jié)果表明，空 載體中的GFP蛋白多在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的周?chē)?，并沒(méi)有進(jìn)到細(xì)胞核內(nèi)，而GFP:S1GRX1的融 合蛋白則分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，因此可以斷定SlGRXl蛋白能定位在植物的細(xì)胞核和 細(xì)胞質(zhì)中(見(jiàn)圖2)。3. SlGRXl基因的功能分析及應(yīng)用利用中國(guó)番茄黃花曲葉病毒即TYLCCNV的衛(wèi)星DNAmii沉默載體及其輔助病毒 TYLCCNV在番茄中沉默了 SlGRXl基因，在番茄中沉默了 SlGRXl基因，用接種空載體的番茄 作為對(duì)照，對(duì)沉默的植株及對(duì)照進(jìn)行抗逆性分析，包括其對(duì)氧化、干旱及鹽堿的抗性測(cè)定。 采用葉盤(pán)法檢測(cè)番茄沉默SlGRXl基因后對(duì)氧化脅迫的抗性，將SlGRXl基因沉默的植株及 對(duì)照的葉盤(pán)剪下，放在添加20mM的H2O2的MS培養(yǎng)基中，5天后觀察SlGRXl基因沉默的植 株與對(duì)照的差異，檢測(cè)結(jié)果表明=SlGRXl基因沉默的番茄葉綠素降解的更快，葉盤(pán)很快由 綠色變成黃色，而對(duì)照葉盤(pán)表現(xiàn)出更強(qiáng)的保持葉綠素的能力(見(jiàn)圖3A)，相對(duì)葉綠素含量測(cè) 定表明，SlGRXl基因沉默的植株的葉綠素明顯低于對(duì)照處理(見(jiàn)圖3B)，表明SlGRXl基因 對(duì)于植物抗氧化脅迫是必須的。干旱處理將SlGRXl基因沉默的植株及對(duì)照植株澆透水后停止?jié)菜M(jìn)行干旱處 理，干旱6天后SlGRXl基因沉默的植株葉片表現(xiàn)出萎蔫癥狀，而對(duì)照植株仍然正常生長(zhǎng) (見(jiàn)圖4A)，植物相對(duì)含水量(RWC)測(cè)定表明SlGRXl基因沉默的植株明顯低于對(duì)照植株(見(jiàn) 圖4B)。這些分析表明SlGRXl基因?qū)χ参锏目购捣磻?yīng)有重要的調(diào)控作用。高鹽脅迫是在番茄SlGRXl基因沉默后，用400mM的NaCl澆灌SlGRXl基因沉默的番茄及對(duì)照植株，每3天一次，在脅迫處理的第10天，SlGRXl基因沉默的植株葉片開(kāi)始萎 蔫變黃，植株停止生長(zhǎng)，表現(xiàn)出典型的鹽脅迫癥狀，對(duì)照植株在10天后依然正常生長(zhǎng)，葉片 表現(xiàn)為綠色(見(jiàn)圖5A)。鹽脅迫改變了植物葉片的葉綠素含量，經(jīng)鹽處理后SlGRXl基因沉 默的植株葉片的葉綠素含量明顯低于對(duì)照(見(jiàn)圖5B)。這些結(jié)果表明，SlGRXl基因?qū)τ谥?物的抗鹽脅迫是必須的，在抗鹽過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步分析SlGRXl基因的功能以及在植物基因工程中的應(yīng)用，我們將該基 因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，分析異源表達(dá)該基因是否能提高其他植物的抗氧化、干旱及鹽堿的能 力。轉(zhuǎn)基因的和對(duì)照擬南芥種子用雙蒸水浸泡30分鐘后用95%乙醇浸泡5分鐘，再用20% 次氯酸鈉漂白7分鐘，最后用雙蒸水洗滌5次。種子于4°C春化處理48小時(shí)后放到25度培 養(yǎng)箱中發(fā)芽培養(yǎng)。培養(yǎng)7天等擬南芥全部發(fā)芽后將發(fā)芽的苗轉(zhuǎn)移到帶有抗性的培養(yǎng)基中進(jìn) 行根的生長(zhǎng)脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6，在正常的情況下，轉(zhuǎn)基因的擬南芥和對(duì)照的根長(zhǎng)的并無(wú) 明顯差異，在脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)明顯高于對(duì)照擬南芥，說(shuō)明外源SlGRXl基 因的表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥對(duì)氧化、干旱及鹽堿的抗性。

由這些結(jié)果表明，我們克隆的番茄SlGRXl基因具有很高的應(yīng)用價(jià)值。我們可以通 過(guò)利用該基因?qū)ζ渌魑锶鐢M南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，如通過(guò)外源導(dǎo)入過(guò)表達(dá)SlGRXl基因 來(lái)提高植物對(duì)氧化、干旱及鹽堿的能力，從而增強(qiáng)作物對(duì)逆境的抗性，提高作物的產(chǎn)量與品 質(zhì)。
權(quán)利要求
一種植物谷氧還蛋白基因SlGRX1，其特征在于具有如SEQ ID NO1所示1003個(gè)堿基DNA序列，編碼具有抗氧化、干旱及鹽堿能力的CGFS類(lèi)的谷氧還蛋白。
2.一種如權(quán)利要求1所述植物谷氧還蛋白基因S1GRX1的克隆方法，其特征在于包括下 列步驟1)根據(jù)擬南芥和水稻的CGFS類(lèi)谷氧還蛋白基因，對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)，根據(jù)保守的同 源序列設(shè)計(jì)了 一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物T1為5 ’ -SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3 ’，下游弓|物 T2 為 5 ’ -ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3 ’，其中，W 代表 T 或者 A，S 代表 G 或者 C，M 代表 A 或 者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C，R代 表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T ；2)用上述引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增基因片段，經(jīng)測(cè)序后與NCBI等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比 對(duì)，證明得到的片段為為番茄的谷氧還蛋白基因的片段；3)以上述擴(kuò)增的基因片段為種子序列，采用電子克隆的方法，在番茄的 EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行電子延伸拼接，根據(jù)延伸的序列設(shè)計(jì)引物，上游引物YGS2為 5，-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3，，下游引物 YGAS 為 5，-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3，，利 用RT-PCR克隆獲得到1003bp的基因片段，將該片段克隆到PGEM-T easy載體上測(cè)序，得到 的基因命名為S1GRX1。
3.一種番茄CGFS類(lèi)蛋白，其特征在于，具有權(quán)利要求1所述植物谷氧還蛋白基因 S1GRX1編碼的如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或者與其氨基酸序列至少60%同源性。
4.一種如權(quán)利要求1所述植物谷氧還蛋白基因S1GRX1的用途，其特征在于用于經(jīng)轉(zhuǎn)基 因或雜交育種改良植物的抗氧化、干旱及鹽堿的能力。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種番茄谷氧還蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。SlGRX1基因是從番茄中分離到的第一個(gè)谷氧還蛋白基因，由1003個(gè)堿基組成，編碼一個(gè)受干旱、高鹽等環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的CGFS類(lèi)谷氧還蛋白，該基因在番茄的根、莖、葉片和花瓣中均表達(dá)，參與植物的抗非生物脅迫反應(yīng)。在番茄中沉默該基因番茄則對(duì)干旱、高鹽以及氧化脅迫更為敏感，而在擬南芥中超量表達(dá)該基因則能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱、高鹽以及氧化脅迫的抗性。故本發(fā)明提供的基因可以提高植物對(duì)干旱、高鹽以及氧化脅迫的抗性，具有很強(qiáng)的理論研究和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101845443SQ20101014854
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者吳建祥, 周雪平, 郭玉雙 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)