專利名稱：水稻胚乳特異表達基因的啟動子及表達模式鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到水稻中同一胚乳特異性表達基因 的不同長度啟動子區(qū)域的分離克隆及表達模式鑒定。
背景技術(shù)：
通過分子生物學以及基因工程的手段去研究和改良作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很好 的應(yīng)用前景。自1983年獲得第一株轉(zhuǎn)基因煙草以來(Zambryski et al.，1983)，在近30年 的時間里，植物基因工程的研究取得了突飛猛進的進展，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學和育種學中 一項重要的方法和技術(shù)。但是在其廣泛運用的過程中也逐漸暴露了一些問題。其中之一就 是現(xiàn)階段研究中經(jīng)常用組成型啟動子來驅(qū)動外源基因表達，由于組成型啟動子會使驅(qū)動的 目的基因在植物各組織中恒定而持續(xù)的表達，從而過度消耗細胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，并且不 能從時間和空間上有效地調(diào)控目的基因的表達，所以有時會帶來一些負面效應(yīng)。如外源基 因在整株植物中表達，產(chǎn)生的大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原 有的代謝平衡，不利于產(chǎn)量和品質(zhì)的提高；有些產(chǎn)物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了 植物的正常生長,甚至導(dǎo)致死亡(Karlowsikiand Hirsch, 2003 ；Ehsani et al. ,2003) 如 利用組成型啟動子表達病毒衣殼蛋白，就可能會引起病毒農(nóng)殼轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致植物病毒新 株系的產(chǎn)生(Robinson，1996)，因此也引起了一些安全性方面的思考。另外，重復(fù)使用同一 種組成型啟動子驅(qū)動兩個或兩個以上的外源基因表達可能會引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象 (Kumpatlaet al.，1998)，所以給多基因轉(zhuǎn)化也帶來了不少麻煩。因此，啟動子在植物基因 工程中的研究地位也越來越突出。研究者們通過尋找更為有效的組織、器官特異性表達啟 動子或者是誘導(dǎo)表達啟動子來代替組成型啟動子，以期更好地調(diào)控植物基因表達。誘導(dǎo)型 啟動子雖然優(yōu)點突出，利用誘導(dǎo)型啟動子獲得轉(zhuǎn)基因植株盡管也有一些報導(dǎo)，但到目前為 止能用于生產(chǎn)實際的還比較少，而組織器官特異表達的啟動子有望用于生產(chǎn)實際則有一些 較成功的例子(Cai et al.，2007 ；Ye et al. ,2009) 所謂組織特異型啟動子是指除具有一般啟動子的結(jié)構(gòu)外，通常還有增強子和沉默 子的一般特性。在組織特異型啟動子調(diào)控下，基因的表達常常只發(fā)生在某些特定的器官或 組織部位，并常常表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。這些啟動子的調(diào)控往往受到組織細胞生理狀態(tài) 和化學物理信號等物質(zhì)的誘導(dǎo)，還受到發(fā)育階段的調(diào)控，其表達是多種因子相互作用的結(jié)^ ο果實和種子是植物的生殖器官，也是營養(yǎng)物質(zhì)主要的儲藏場所。利用果實或種 子等器官特異性啟動子調(diào)控基因表達，不僅可提高基因在這些部位的表達量，將生物能耗 降到最低，利于表達產(chǎn)物的分離，而且可有目的地提高轉(zhuǎn)基因植物果實或種子的營養(yǎng)或改 善其品質(zhì)。Sandhu等利用E8啟動子(成熟果實中乙烯應(yīng)答性基因的啟動子)驅(qū)動呼吸 道合胞病毒F抗原基因成功轉(zhuǎn)化番茄植株，用果實特異表達抗原喂飼小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn) 生特異的粘膜免疫反應(yīng)、血清學抗體反應(yīng)及THl型細胞免疫反應(yīng)(Sandhu et al.，2000)。 Vasconcelos等用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅(qū)動大豆鐵蛋白基因，使轉(zhuǎn)基因水稻谷粒中鐵和鋅的含量都有所增加，而且鐵蛋白主要積累在胚乳中，不會在食品加工過程中丟失(Vasconcelos et al.，2003)。研究人員在一些單子葉植物的種子儲藏蛋白中也分 離了一些胚乳特異表達的順式作用元件，最著名的GCN4元件被認為對維持胚乳特異表達 活性是必須的(Wu et al.，1998)。但也有文獻報導(dǎo)，GCN4元件僅僅是起到增強啟動子在 胚乳中的表達強度的作用，其并不能決定啟動子胚乳特異表達的特性(Vickers et al., 2006)。另外，一些種子中特異表達的啟動子如PsGNS2啟動子(Buchner et al. ,2002), FAEl (Rossak et al. ,2001)啟動子等也有相關(guān)的報導(dǎo)。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是禾本科作物功能基因組學研究的模式植 物。啟動子是精確調(diào)控基因表達的“開關(guān)”。因此對水稻組織器官特異表達啟動子的分離克 隆及深入研究，不僅有助于闡明植物形態(tài)、發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，還可以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因 育種，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，更好的為人類生產(chǎn)生活服務(wù)。本發(fā)明就是利用有關(guān) 分子生物學方法，從水稻“明恢63”基因組中分離克隆了同一個胚乳特異表達基因上游不同 長度的啟動子區(qū)域，將不同長度的啟動子融合報告基因GUS導(dǎo)入水稻“中花11”中，驗證其 表達模式，進而鑒定出控制表達量及表達模式區(qū)段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有可用于水稻基因工程研究的組織特異表達啟動子數(shù) 目的不足，從水稻“明恢63” (我國廣泛應(yīng)用的優(yōu)良水稻恢復(fù)系)基因組中分離并鑒定出胚 乳特異表達的啟動子，有望將這些啟動子用于水稻的基因工程改良。為了便于研究利用，我 們創(chuàng)建了 EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP2_471、EnP3_292 和 EnP3_110 共 6 個不同長度的 啟動子。將這些啟動子融合報告基因葡糖醛酸酶基因(以下簡稱GUS基因)導(dǎo)入水稻 “中花11”(中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所商業(yè)經(jīng)營品種)中，驗證其表達模式，并進行表達量 的測定，為日后利用該啟動子奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的(本發(fā)明的技術(shù)路線見圖1)利用華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室水稻全生育期表達譜芯片數(shù)據(jù) 庫 CREP(http://cr印.ncpgr. cn) (Wang et al.，2010)及反轉(zhuǎn)錄 PCR (以下簡稱 RT-PCR)等 方法，從水稻“明恢63”(我國廣泛推廣應(yīng)用的優(yōu)良水稻恢復(fù)系)基因組中分離并鑒定出 具有胚乳特異性表達的啟動子。申請人將其命名為EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP3_471、 EnP3-292和EnP3_110。所述的啟動子EnP3序列，它是序列表SEQ ID NO 1所示的序列。 通過分析該啟動子驅(qū)動GUS報告基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達模式發(fā)現(xiàn)該啟動子僅在轉(zhuǎn)化 植株的胚乳表達，并且隨著胚乳發(fā)育階段的不斷進行，表達量呈現(xiàn)下降趨勢；在其他組織如 葉片、葉鞘、莖桿、根、花、穎殼及胚中均檢測不到表達。所述的啟動子EnP3-859、EnP3-678、 EnP2-471 和EnP3-292序列，分別是序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5所示的序列，它們分別是由啟動子EnP3截短的核心區(qū)859bp、678bp、471bp及292bp 的序列。這4個片段均具有獨立的啟動基因表達的功能，并且在轉(zhuǎn)化植株中的表達模式與 EnP3相同，即僅在胚乳表達，不過表達量各有區(qū)別。所述的啟動子EnP3-110序列，它是序列 表SEQ ID NO 6所示的序列，是由EnP3-292進一步截短的IlObp的序列，分析其驅(qū)動⑶S 報告基因在轉(zhuǎn)基因水稻中表達情況發(fā)現(xiàn)，這個區(qū)段的表達模式發(fā)生了顯著的改變在葉片、 葉鞘、莖桿及穎殼這些綠色組織中可以檢測到表達，但是在根、花及種子(包括胚和胚乳)中卻檢測不到表達，成為一個短的綠色組織特異表達啟動子。本發(fā)明的具體步驟是首先在華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室水稻全生育期表達譜芯片數(shù) 據(jù)庫CREP(http://cr印.ncpgr.cn) (Wang et al. ,2010)上發(fā)現(xiàn)了一個可能是胚乳特異表 達的候選基因，在美國國立生物研究所網(wǎng)站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上獲 得該基因的序列，如SEQ ID NO 7所示，共459bp，以這459bp的序列設(shè)計引物來做RT-PCR 反應(yīng)從而進一步確定其表達譜，RT-PCR結(jié)果顯示(見圖2)該基因僅在胚乳中表達。在此 基礎(chǔ)上用特異性引物以PCR的方法從水稻“明恢63”基因組中擴增得到一個被命名為EnP3 的啟動子候選片段，將該啟動子候選片段EnP3與報告基因GUS編碼序列構(gòu)建成融合基因 并裝載到雙元Ti載體DX2181(載體圖及多克隆位點等信息見圖3 )上，裝配成EnP3-GUS 載體(見圖4)，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將EnP3-GUS載體轉(zhuǎn)入水稻受體“中 花11”中，同時轉(zhuǎn)化空載體DX2181作為陰性對照，轉(zhuǎn)化花椰菜花葉病毒35S啟動子驅(qū)動 ⑶S(CaMV35S-GUS)作為陽性對照。獲得轉(zhuǎn)基因植株后通過細織化學染色及⑶S活性定量 分析，考察該啟動子在胚乳發(fā)育各時期的表達變化，進而驗證和克隆該啟動子。檢測結(jié)果表 明該啟動子僅在轉(zhuǎn)化植株的胚乳表達，并且隨著胚乳發(fā)育階段的不斷進行，表達量呈現(xiàn)下 降趨勢；在其他組織如葉片、葉鞘、莖桿、根、花、穎殼及胚中均檢測不到表達。采用片段缺失 的方法，我們構(gòu)建了 5個來源于EnP3的5’端缺失片段連接GUS的表達載體，同樣通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入水稻受體“中花11”中，分析這5個片段的表達模式，結(jié)果 顯示來源于啟動子EnP3的4個區(qū)段(EnP3-859、EnP3_678、EnP3_471和EnP3_292)均具 有獨立的啟動基因表達的功能，并且在轉(zhuǎn)化植株中的表達模式與EnP3相同，即僅在胚乳表 達，不過表達量各有區(qū)別；由EnP3-292進一步截短的EnP3-110區(qū)段的表達模式發(fā)生了顯 著的改變在葉片、葉鞘、莖桿及穎殼這些綠色組織中可以檢測到表達，但是在根、花及種子 (包括胚和胚乳)中卻檢測不到表達，成為一個短的綠色組織特異表達啟動子。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明鑒定了胚乳特異表達的啟動子EnP3及控制其表達量及表達模式的核 心區(qū)域，為基因工程和分子育種提供了新的特異表達的啟動子資源。(2)本發(fā)明可以直接應(yīng)用于水稻胚乳特異表達的啟動子的鑒定和克隆。


序列表SEQ ID NO :1，公開了本發(fā)明克隆的的水稻胚乳特異表達啟動子EnP3的核 苷酸序列，長度為1040bp。序列表SEQ ID NO :2是從所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 個啟動子應(yīng)用的核苷酸序列，長度為859bp。序列表SEQ ID NO :3是從所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 個啟動子應(yīng)用的核苷酸序列，長度為678bp。序列表SEQ ID NO :4是從所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 個啟動子應(yīng)用的核苷酸序列，長度為471bp。序列表SEQ ID NO :5是從所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 個啟動子應(yīng)用的核苷酸序列，長度為292bp。
序列表SEQ ID NO :6是從所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 個啟動子應(yīng)用的核苷酸序列，長度為UObp。序列表SEQ ID NO 7是本發(fā)明克隆的水稻胚乳特異表達啟動子EnP3在基因組中 所驅(qū)動的基因(Genebank登錄號為GI =31415924)的核苷酸序列，長度為459bp。序列表SEQ ID NO 8是本發(fā)明克隆的水稻胚乳特異表達啟動子EnP3在基因組中 所驅(qū)動的基因(Genebank登錄號為GI =31415924)編碼的氨基酸序列，長度為134個氨基酸。圖1 :實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2 利用RT-PCR的方法來分析EnP3在基因組中所驅(qū)動的基因(GI =31415924) 的表達模式。上下列分別表示的為內(nèi)參水稻Actinl基因和目的基因(GI =31415924)在各 個組織中的表達情況。圖3 表示雙元載體DX2181結(jié)構(gòu)示意圖。該載體是在pCAMBIA1380的基礎(chǔ)上改造 而來，在多克隆位點處以相反的方向分別構(gòu)建了一個GUS基因和EGFP基因。圖4 構(gòu)建好的以DX2181為骨架的表達載體簡圖。a為陰性對照，即DX2181空載 體，無啟動子驅(qū)動⑶S基因表達；b為陽性對照，即用CaMV35S啟動子來驅(qū)動⑶S基因表達； c為EnP3及其系列缺失片段來驅(qū)動⑶S基因表達。LB、RB分別為DX2181中T-DNA的左邊 界和右邊界；hyg為潮霉素抗性篩選基因；gus為報告基因GUS ( β -葡萄糖苷酸酶)；egfp 為報告基因EGFP (增強的綠色熒光蛋白)；MCS表示多克隆位點；35sP表示CaMV35S啟動子 (花椰菜花葉病毒35S啟動子)；EnP3-X表示EnP3及其系列缺失片段；箭頭方向表示基因 或啟動子表達的方向。圖5 由EnP3驅(qū)動⑶S基因的轉(zhuǎn)化植株的各個組織的組織化學染色。a為葉片；b 為葉鞘；c為莖桿；d為根；e為花；f為種子(含胚與胚乳)。圖6 由EnP3及其系列缺失片段驅(qū)動GUS基因的轉(zhuǎn)化植株的成熟種子的組織化 學染色。a、b、c、d、e、f 分別表示的是啟動子片段 EnP3、EnP3_859、EnP3_678、EnP3_471、 EnP3-292和EnP3_110的表達情況，圖中En表示胚乳，Em表示胚。圖7 由EnP3-110驅(qū)動⑶S基因的轉(zhuǎn)化植株的各個組織的組織化學染色。a為葉 片；b為葉鞘；c為莖桿；d為根；e為花；f為種子(含胚與胚乳)。圖8 由EnP3-110驅(qū)動⑶S基因的轉(zhuǎn)化植株的各個組織的⑶S活性定量檢測， DX2181表示陰性對照。圖9 由EnP3及其系列缺失片段驅(qū)動GUS基因的轉(zhuǎn)化植株的胚乳在不同發(fā)育時期 的⑶S活性定量檢測。圖例中的DAF表示開花后天數(shù)(days after flowering) ；DX2181表 示陰性對照。
具體實施例方式實施例1 胚乳特異表達候選基因(Genebank登錄號為GI =31415924)的表達譜驗 證材料準備本實施例所用材料是秈稻品種(Oryza sativa ssp. Indica)明恢 63 (我國廣泛應(yīng)用的優(yōu)良水稻恢復(fù)系)，種植方法是水培。營養(yǎng)液成分如下所示1.44mM NH4NO3, 0. 3mM NaH2PO4, 0. 5mM K2SO4,1. OmM CaCl2, 1. 6mM MgSO4, 0. 17mM NaSiO3, 50 μ mFe-EDTA，O. 06 μ M (NH4)6Mo7O24,15 μ M H3BO3, 8 μ MMnCl2, 0. 12 μ M CuSO4, 0. 12 μ M ZnSO4, 29 μ M FeCl3,40. 5μ M Citric acid, ρΗ5. 5 (Yoshida et al.，1976)。在孕穗期取葉片、 葉鞘、莖桿、根、穗，受精14天后取胚乳。RNA提取采用Trizol Reagent (Invitrogen, Carisbad,CA,USA)方法。總RNA經(jīng)1. 4%瓊脂糖膠電泳檢測和濃度測定確認質(zhì)量合格(18S、 28S兩條主帶清晰無拖尾，0D260/0D280 = 1.8-2.0)后方可進行后續(xù)試驗。將各個組織的 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于_20°C冰箱保存。反轉(zhuǎn)錄使用的試劑盒是Promega公司的M-MLV， 按照產(chǎn)品說明書操作即可。首先在華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室水稻全生育期表達譜芯片數(shù) 據(jù)庫CREP(http://cr印.ncpgr.cn) (Wang et al. ,2010)中發(fā)現(xiàn)了一個可能是胚乳特異表 達的候選基因，所對應(yīng)的探針號是Os. 13536. 1.31_站，芯片顯示在胚乳發(fā)育的7，14，21天 均高量表達，在其他組織無表達或表達量很低。該探針所表征的基因在TIGR上的登錄號是 L0C_0s03g55734,在NCBI上 的基因號為GI =31415924,基因功能注釋為“可能的醇溶谷蛋白 (putative prolamin) ”?；虼笮?59bp，mRNA大小為459bp，編碼134個氨基酸(見序列 表 SEQ ID NO :8)。設(shè)計能擴增部分mRNA 的 RT-PCR 引物(YRJTZ3F :AAGCATCTCCCATACGCTGT， YRJTZ3R :TCAACAACAACCATAAGGAAAGA，擴增大小為430bp)，以水稻“明恢63”的葉片、葉鞘、 莖桿、根、穗、胚乳的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actinl為內(nèi)參(擴增引物為actinlF GCCACACTGTCCCCATCTAT, actinlR GCGACCACCTTGATCTTCAT)。PCR 反應(yīng)條件94 "C 5min, 94°C 30sec,55. 5°C 30sec,72°C 50sec，30 個循環(huán)，72°C 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 0· 8%瓊脂糖膠 電泳檢測。檢測結(jié)果見附圖2。結(jié)果顯示，候選基因GI :31415924在胚乳中表達，在其他組 織不表達。實施例2 胚乳特異表達啟動子EnP3候選片段及相應(yīng)缺失片段的獲得(相應(yīng)分子 生物學常規(guī)操作參考《分子克隆實驗指南(第二版)》(J.薩姆布魯克等，1996))明恢63基因組DNA的抽提在明恢63分蘗盛期取新鮮葉片用于抽提其基因 組DNA，具體方法為Murray報道的十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，以下簡稱CTAB)抽提法(Murray and Thompson. 1980)，抽提出的DNA完全溶解后 置于-20°C冰箱保存。在生物信息學網(wǎng)站NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)上提取候選基因 GI =31415924的上游序列，具體來講是-976至+54(轉(zhuǎn)錄起始點為+1)區(qū)間共計1130bp 作為啟動子候選片段。將其命名為EnP3。利用PCR法，以抽提的明恢63基因組DNA 為模板，通過設(shè)計特異引物(EnP3F Ce<S AAGCTTGGAGCATTTGTAGGAATGCC ；EnP3R CGC GGATCCTGTTGACAGCGTATGGGAGA)來擴增EnP3，為了后續(xù)構(gòu)建載體的方便，左右引物分別添 加Hindlll、BamHI酶切位點(下劃線表示)及相應(yīng)的保護堿基(陰影表示)。PCR反應(yīng)條 件94°C 5min，94°C lmin，66°C 50sec,72°C lmin30sec，30 個循環(huán)，72°C 7min。取EnP3的部分PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳檢測。剩余的PCR產(chǎn)物用于做TA克隆。 使用的試劑盒為Promega公司的T-Vctor系統(tǒng)。反應(yīng)體系為5. O μ 1，具體如下EnP3PCR產(chǎn) 物 1. 9 μ 1、T-Vctor 0. 3 μ 1、2 倍緩沖液(以下簡寫為 buffer) 2. 5 μ 1、T4 Iigase 0·3μ1。連接產(chǎn)物于16°C低溫水浴10h，然后電轉(zhuǎn)化(1800伏，電擊2_3秒)入大腸桿 菌DH5ci (該菌株為商業(yè)化的大腸桿菌菌株)，37°C復(fù)蘇40min，涂含氨芐霉素(Amp)、異 丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5_溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(Χ-gal)的平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑選白斑用含Amp的LB培養(yǎng)基來擴大培養(yǎng)。抽提所搖菌的質(zhì)粒，用 HindIII和BamHI雙酶切來篩選陽性克隆。酶切體系為20. Oy 1，具體如下質(zhì)粒3. 0μ 1、 IOXK buffer2. 0 μ UHindIIIO. 1 μ l.BamHIO. 1 μ l,ddH2014. 8 μ 1，37°C反應(yīng) 4h，酶切產(chǎn)物 用0.8%瓊脂糖電泳檢測。挑選陽性克隆用ABI3730測序儀進行測序。測序結(jié)果顯示來源 于明恢63基因組的EnP3序列(序列表SEQ ID NO 1所示)與NCBI上報道日本晴的序列 并非是100%完全匹配，存在少量差異，最終大小為1040bp，后續(xù)5’缺失片段的設(shè)計均以明 恢63基因組的序列為準。5個5’缺失片段與全長啟動子共用同一個右引物(EnP3R CGC GGATCCTGTTGACAGCGTATGGGAGA)，左引物根據(jù)它們最終的擴增片段大小分別 命名為 EnP3F-859 ( CCC AAGCTTTTGGAATTGCGCGAAGTTAG)、EnP3F~678 ( CCC AAGCTTGCTAAATGTTACTTCCTCCG)、EnP3F~471 (C Q€ AAGCTTGTCGTGACTTATGTAACACG)、 EnP3F-292 ( CCC AAGCTTGCACCAATGC ACCATTGATC)禾口 EnP3F_110( CCC AAGCTTCCTATAAATAATCCCCTAGAGC)。在每條左引物5，端都引入HindIII酶切位點(以下劃 線表示)及相應(yīng)的保護堿基(以陰影表示)。PCR模板為測序正確的TA-EnP3質(zhì)粒。得到 擴增產(chǎn)物之后，后續(xù)操作按照構(gòu)建TA-EnP3的方法進行。實施例3 胚乳特異表達啟動子EnP3候選片段及相應(yīng)缺失片段的轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建 (相應(yīng)分子生物學常規(guī)操作參考J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南(第二版)》，科學出 版社(1996)。(1)酶切載體DX2181。DX2181載體是在pCAMBIA1380 (該載體是澳大利 亞 CAMBIA(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture, CAMBIA)實驗室在全世界公開交流使用的載體)的基礎(chǔ)上改造而來，在多克 隆位點處以相反的方向分別構(gòu)建了一個GUS基因和EGFP基因，載體圖及多克隆位點等信息 見圖3。用HindIII、BamHI雙酶切DX2181，酶切產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))回收，電泳檢測其酶切完整性，置于-20°C冰箱保 存。(2)酶切EnP3及相應(yīng)缺失片段的TA克隆質(zhì)粒。用HindIIIjamHI雙酶切經(jīng)過測 序為正確的EnP3及相應(yīng)缺失片段的TA克隆質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物用0. 8%瓊脂糖電泳分離，然后 目標帶用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，電泳檢測其酶切完整性，置于-20°C冰箱保存。(3)將酶切回收的EnP3及相應(yīng)缺失片段構(gòu)建到載體DX2181上(見附圖4)，電轉(zhuǎn) 化入大腸桿菌DH5ci (該菌株為商業(yè)化的大腸桿菌菌株)。酶切檢測與測序后將構(gòu)建好的載 體導(dǎo)入農(nóng)桿堿型的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株(該菌株為商業(yè)化的農(nóng)桿菌菌株)，構(gòu)成可用于 轉(zhuǎn)化的工程菌株。然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法(林擁軍等，2002)轉(zhuǎn)化水稻品種“中 花 11”。實施例4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要參照華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗 室發(fā)表的“農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化操作手冊”所示的方法(林擁軍等，2002)。轉(zhuǎn)化受體為 水稻品種“中花11”的成熟種子所誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織。經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩 選得到具有潮霉素抗性的愈傷，再經(jīng)過分化、生根、煉苗和移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基配制過程中所涉及到得的主要試劑的名稱及縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)； KT (Kinet in, Mij] Μ) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS (Acetosringone, Zi lit T # Sll ) ；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate, /K I S S )； HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液);N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)(2)主要溶液配方DN6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(IOX)配制)硝酸鉀(KNO3)28. 3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4. Og硫酸銨((NH4)2SO4)4. 63g硫酸鎂(MgSO4· 7H20) 1. 85g氯化鈣(CaCl2· 2H20) 1. 66g將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000ml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制碘化鉀(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸錳(MnSO4· 4H20) 0. 44g硫酸鋅(ZnSO4· 7H20) 0. 15g將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2-EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制):將3. 73克乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20)和2. 78克FeSO4 · 7H20分別溶解， 混合并用蒸餾水定容至1000ml，至70°C溫浴2小時，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制):煙酸(Nicotinic acid)0. Ig維生素Bl (Thiamine HCl) 0. Ig維生素B6(Pyridoxine HCl) 0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)IOg加蒸餾水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(按照10X濃縮液配制):硝酸銨(NH4NO3)16. 5g硝酸鉀(KNO3)19. Og磷酸二氫鉀(KH2PO4)1. 7g硫酸鎂(MgSO4· 7H20) 3. 7g
氯化鈣(CaCl2· 2H20) 4. 4g將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(按照100X濃縮液配制):硫酸錳(MnSO4· 4H20)2. 23g硫酸鋅(ZnSO4· 7H20) 0. 86g硼酸(H3BO3)0. 62g碘化鉀(ΚΙ)0. 083g鉬酸鈉(Na2MoO4· 2H20) 0. 025g硫酸銅(CuSO4· 5H20) 0. 0025g氯化鈷(CoCl2· 6H20) 0. 0025g將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。7) 2，4-D 貯存液(lmg/ml)的配制稱取2，4-D IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全 后定容至100ml，于室溫下保存。8)6_BA 貯存液(lmg/ml)的配制稱取6-BA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(lmg/ml)的配制稱取NAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制稱取IAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)的配制稱取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制稱取AS 0. 392g，WADMS0 IOml溶解，分裝至1. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液配制稱取氫氧化鉀5. 6g，用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(取已經(jīng)制備好的IOX濃縮液，下同)IOOmlN6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IOmlFe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IOml維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IOml2,4-D貯存液(取上述制備好的)2. 5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0.6g蔗糖30g
Phytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如121°C下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng) 基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。2)繼代培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4-DC存液2.0ml脯氨酸0. 5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 15g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入 培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)Iml2，4-DC存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個IOOml的三角瓶中，封口，按上述
方法滅菌。使用前加入Iml無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN(50mg/ml)和400微升CN(250mg/ml)分裝倒 入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400mg/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基 羧芐青霉素濃度為250mg/l)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA 貯存液0. 5mlKT C存液0. 5mlNAA貯存液50微升IAA貯存液50微升CH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g
加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN(50mg/ml) 250微升CN(250毫g/ml)，分裝倒入培 養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml6-BA 貯存液2mlKT C存液2mlNAA C存液0.2mlIAA 貯存液0.2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。煮沸并用蒸餾水定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方 法滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并用蒸餾水定容至IOOOml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟1)愈傷誘導(dǎo)a.將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯 化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；b.用滅菌水洗種子4-5次；c.將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；d.將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士 1°C。2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25 士 1°C。3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25 士 1°C。4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)a.在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (該菌株來自CAMBIA 公司商業(yè)化的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28°C ；b.將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時。5)農(nóng)桿菌侵染a.將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；b.調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6J). 8-1. 0 ；c.將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；d.轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度 19-20 "C。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)a.滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；b.浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；c.轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；d.轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。7)分化a.將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；b.轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照(1500-2000LUX)下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度 26°C。8)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照(1500-2000LUX)下培 養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)溫度26 °C。9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保 持水分濕潤。實施例5 =PCR法檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株轉(zhuǎn)化苗移入溫室后，待其返青，然后分單株取l-2cm幼嫩葉片，抽提其基因組DNA 為模板，用PCR法檢測陽性植株。擴增片段為報告基因gus的部分片段，大小為699bp。引 物序列為 GUS-F GGGCGAACAGTTCCTGATTA, GUS-R :AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR 反應(yīng)條件 940C 5min，94°C 50sec，57°C 40sec，72°C 50sec，30 個循環(huán)，72°C 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 0· 8% 瓊脂糖膠電泳檢測。通過此法，可剔除陰性植株。小量葉片基因組DNA的提取方法取適量幼嫩葉片，加SOOul 1. 5XCTAB(1. 5XCTAB 配方1· 5 % CTAB、75mM Tris-HClU5mM EDTA 及 1· 05M NaCl)研 磨，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；65°C水浴30min;加入600 μ L氯仿/異戊醇(體積比為24 1) 上下顛倒數(shù)次(約15min)，下層液相呈深綠色為止；室溫下12000r/min離心IOmin ；取 500 μ L上清于一新1. 5ml離心管，加入預(yù)冷的95%乙醇lmL，混勻后置-20°C，30min ；室溫 下12000r/min離心lOmin，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100 μ LddH2O溶 解，備用。
實施例6 =GUS組織染色法分析EnP3候選片段及相應(yīng)缺失片段各種組織中的表達 模式分別取經(jīng)PCR檢測(參考實施例5)為陽性的EnP3_GUS轉(zhuǎn)化植株(10株以上)的 根、葉片、葉鞘、莖桿、穎殼、花、種子切成約0. 5CM長度的適當大小，浸入約200 μ 1的⑶S染 液，37°C過夜，然后用75%酒精脫色，觀察是否有藍色出現(xiàn)。染色液的配方參照Jefferson 等報道的方法(Jefferson等，1987)。結(jié)果表明EnP3候選片段僅在轉(zhuǎn)化植株的胚乳表達， 在其他組織如葉片、葉鞘、莖桿、根、花、穎殼及胚中均檢測不到表達(見附圖5)。這些結(jié)果 證實，EnP3為一個胚乳特異表達的啟動子。用同樣的辦法分析了 EnP3的系列缺失片段驅(qū)動下的⑶S在各種組織中的表達模 式(見圖6)。結(jié)果表明啟動子EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292均具有獨立的啟 動基因表達的功能，并且在轉(zhuǎn)化植株中的表達模式與EnP3相同，即僅在胚乳表達，不過表 達量各有區(qū)別。同時發(fā)現(xiàn)，由EnP3-292進一步截短的EnP3-110區(qū)段的表達模式發(fā)生了顯 著的改變在葉片、葉鞘、莖桿及穎殼這些綠色組織中可以檢測到表達，但是在根、花及種子 (包括胚和胚乳)中卻檢測不到表達，成為一個短的綠色組織特異表達啟動子(見圖7)。實施例7 啟動子EnP3及相應(yīng)缺失片段⑶S活性定量檢測取EnP3及相應(yīng)缺失片段經(jīng)⑶S組織化學染色為陽性(參考實施例6)植株及轉(zhuǎn)空 載體DX2181植株的Ttl代種子，統(tǒng)一播種。待其開花受精后7天、14天、21天時取胚乳組織， 抽提其總蛋白，然后測定其GUS活性(見圖9)；同時取EnP3-110及空載體DX2181抽穗期 的葉片、葉鞘、莖桿、穗子和根組織，同樣抽提其總蛋白，然后測定其GUS活性(見圖8)。具 體方法參考 Bradford 及 Jefferson 等報道的方法(BradfordM, 1976 Jefferson 等，1987)。 結(jié)果表明在胚乳組織發(fā)育的不同時期，啟動子片段(EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP3-471 和EnP3-292)和陰性對照DX2181相比，均有顯著差異；啟動子片段EnP3_110的主要綠色組 織(葉片、葉鞘、莖桿、穎殼(實驗測量時為整穗))和陰性對照DX2181相比，均有顯著差異 這和組織化學染色結(jié)果是吻合的，即EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP3_471和EnP3_292為 胚乳特異表達啟動子，而EnP3-110為一綠色組織特異表達啟動子。從胚乳組織的表達量上 來看，全長啟動子EnP3的表達量最高(在各個發(fā)育時期均是如此)，并且隨著胚乳發(fā)育階 段的不斷進行，表達量呈現(xiàn)下降趨勢。對EnP3-678、EnP3_471和EnP3_292這三個啟動子 來講，它們的表達模式與EnP3相同，即隨著胚乳發(fā)育階段的不斷進行，表達量呈現(xiàn)下降趨 勢；并且隨著啟動子長度的逐漸縮短，對同一發(fā)育時期比較而言，表達量呈現(xiàn)下降趨勢。與 其他幾個胚乳特異表達的啟動子相比而言，EnP3-859的表達模式略有不同，即在胚乳發(fā)育 前期(開花受精后7天及14天)表達量無明顯變化，在后期有一個急劇下降的過程。綠色 組織特異表達啟動子EnP3-110在葉片、葉鞘中的表達量(以陰性對照DX2181的相應(yīng)組織 為基準)要強于在莖桿和穗子中的表達量。同時從圖上可以發(fā)現(xiàn)胚乳中開花受精后7天的 ⑶S活性從EnP3到EnP3-859以及EnP3_471到EnP3_292有一個急劇下降的現(xiàn)象；而開花 受精后14天及21天的⑶S活性的急劇下降則出現(xiàn)在EnP3-471到EnP3_292。從上面所有 結(jié)果可以推測啟動子EnP3是一個在胚乳發(fā)育前期高量表達的特異表達啟動子；在胚乳發(fā) 育早期1040-859及471-292這兩個區(qū)段中可能存在控制其表達量的順式作用元件；在胚乳 發(fā)育的中后期471-292這個區(qū)段中可能存在控制其表達量的順式作用元件。EnP3-110為 一綠色組織特異表達啟動子，而EnP3-292為一胚乳特異表達啟動子，表達模式發(fā)生顯著改變，說明292-110這個區(qū)段可能存在控制啟動子表達模式的順式作用元件。參考文獻1.林擁軍等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的牡丹江8號高效轉(zhuǎn)基因體系的建立，作物學報，2002， 28(3) 294-300 ；2. J.薩姆布魯克，E. F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南(第二版).科 學出版社，1996;3. Bradford M，A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding. Anal Biochem，1976，72 :248-254 ;4. Buchner et al.，Characterization of a tissue-specific and developmentalIy regulated beta-1，3-glucanase gene inpea (Pisum sativum). Plant Mol Biol，2002，49 :171_186 ；5. Cai M et al.，A rice promoter containing both novel positive and negative cis—elements for regulation of greentissue-specific gene expression in transgenic plants. Plant Biotechnology Journal, 2007, 5 664-674 ；6. Ehsani P et al. Expression of anti human IL-4 and IL-6 scFvs in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol，2003，52 :17_29 ;7. Jefferson et al.，GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants. EMBO J，1987，6 :3901_3907 ;8.Karlowski W M， Hirsch A M. The over-expression of an alfalfa RING-H2 gene induces pleiotropic effects onplant growth and development. Plant Mol Biol, 2003,52 121-133 ；9.Kumpatla S P et al. ， Genome intruder scanning and modulation systems and transgene silencing. Trends inPlant Sciences, 1998, 3 96~104 ；10. Murray and Thompson. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 1980，8 :4321_4325 ；11. Robinson D J. Environmental risk assessment of release of transgenic plants containing virus-derived inserts. Transgen Res，1996，5 :359_362 ;12. Rossak et al. ,Expression of the FAEl gene and FAEl promoter activity in developing seeds of Arabidopsisthaliana. Plant Mol Biol，2001，46 :717_725 ;13. Sandhu et al.，Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-Fprotein induces a systemic immune response.Transgenic Res，2000，9 :127-135 ；14. Vasconcelos et al. ,Enhanced iron and zinc accumulation in transgenic rice with the ferritin gene. Plant Sci,2003,164 371-378 ；15. Vickers et al.，A novel cis-acting element，ESP, contributes to high-level endosperm-specific expression in anoat globulin promoter. Plant Mol Biol，2006，62 :195_214 ；16. Wang L et al., A dynamic gene expression atlas covering the entirelife cycle of rice.Plant J. 2010，61 :752_766 ;17. Wu et al.，The GCN4 motif in a rice glutelin gene is essential for endosperm specific gene expression and isactivated by 0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J，1998，14 :673_683 ;18.Ye RJ et al. , Development of inseet-resistant transgenic rice with CrylO-free endosperm. Pest Managementscience，2009，65 :1015—1020 ;19. Yoshida et al. ,Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice， 3rd Edn. International Rice Researchlnstitute, Manila. 1976 ；20. Zambryski et al.，Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of theirnormal regeneration capacity. EMBO J， 1983,2 :2143-2150o
權(quán)利要求
一個水稻胚乳特異性表達的啟動子EnP3，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一個水稻胚乳特異性表達的啟動子EnP3-859，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所示。
3.一個水稻胚乳特異性表達的啟動子EnP3-678，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所示。
4.一個水稻胚乳特異性表達的啟動子Enra-471，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 4所示。
5.一個水稻胚乳特異性表達的啟動子EnP3-292，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5所示。
6.一個水稻綠色組織特異性表達的啟動子EnP3-110，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 6所示。
7.權(quán)利要求1-6任一項所述的啟動子在水稻遺傳改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。從水稻基因組中克隆了同一胚乳特異表達基因(登錄號為GI31415924)上游6個不同長度的啟動子(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292和EnP3-110)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1-6所示；其中5個啟動子(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292)僅在轉(zhuǎn)化植株的胚乳表達，并且隨著胚乳發(fā)育階段的不斷進行，表達量呈現(xiàn)下降趨勢；在其他組織如葉片、葉鞘、莖桿、根、花、穎殼及胚中均檢測不到表達。啟動子EnP3-110在葉片、葉鞘、莖桿及穎殼這些綠色組織中可以檢測到表達，但是在根、花及種子(包括胚和胚乳)中卻檢測不到表達，成為一個短的綠色組織特異表達啟動子。公開了6個啟動子及其相應(yīng)表達載體的制備方法，以及通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入水稻的應(yīng)用。
文檔編號A01H5/00GK101831429SQ20101015103
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者葉榮建, 林擁軍, 陳浩 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學