專利名稱：側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的農(nóng)用生物活性及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的農(nóng)用生物活性及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豐白[Platycladus orientalis (L. ) Franco] M 白禾斗(Cupressaceae) 豐白 M (Platycladus Spach.)，是我國(guó)特有樹種，是城市尤其是北方城市綠化常用樹種之一。側(cè)柏葉氣清香、味苦澀、微辛，具有涼血止血、清肺止咳功效，種仁可入藥，能養(yǎng)心安神、止汗?jié)櫮c。側(cè)柏葉提取物對(duì)金葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度抑菌活性，其根際土壤提取物對(duì)蘿
卜等植物種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有抑制作用。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)從2005年開始研究側(cè)柏的農(nóng)藥活性，發(fā)現(xiàn)側(cè)柏各器官提取物對(duì)蘋果腐爛、葡萄白腐、葡萄黒痘等植物病原菌都有較強(qiáng)抑制作用，其中葉提取物的抑菌活性最好，并進(jìn)一步從葉中分離到抑菌化合物8-甲基香豆素，相關(guān)研究已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利。然而眾所周知，植物資源是限制植物源農(nóng)藥規(guī)模化生產(chǎn)和使用的主要因素之一。申請(qǐng)者根據(jù)宿主植物與其內(nèi)生微生物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，而具有相同或相似次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的 “內(nèi)共生理論”，從側(cè)柏中分離篩選到對(duì)多種農(nóng)業(yè)病蟲草害有顯著抑制作用的內(nèi)生真菌，相關(guān)研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從側(cè)柏中分離篩選出代謝產(chǎn)物有農(nóng)藥活性的內(nèi)生真菌，并將該菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上以防治作物的病害、蟲害及草害。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)側(cè)柏內(nèi)生真菌的分離篩選及其代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)病蟲草害防治上的應(yīng)用，具體包括以下步驟(1)側(cè)柏組織的準(zhǔn)備采集健康側(cè)柏的根、莖、葉。(2)側(cè)柏組織的表面消毒與無菌檢測(cè)將步驟(1)側(cè)柏組織經(jīng)表面消毒后，直接接種于PDA培養(yǎng)基表面，置于(27士 1) °C恒溫箱培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長(zhǎng)的組織。(3)側(cè)柏組織內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)將步驟O)的無菌組織在無菌條件下切割成小片移植于PDA培養(yǎng)基上，置于(27士 1)°C恒溫箱培養(yǎng)，至樣品周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，備用。(4)內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配置每升含蛋白胨0-5. 5g、玉米粉l_8g、麩皮 0-10g、可溶性淀粉 0-10g、葡萄糖 l_8g、黃豆餅粉 l-9g、CaC03 0 . 5-2 . 5g, NH4NO3 0. 1-1. 2g、 MgSO4 0. 1-0. 9 g、KH2PO4 0. 1-0. 9g，其余為無菌水。(5)內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別裝在三角瓶中，用接種鉤挑取少許經(jīng)步驟(3)分離純化的內(nèi)生真菌菌絲于培養(yǎng)瓶中，置于(27 士 1)°C搖床，200r/ min，振蕩培養(yǎng)4-5天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心，取發(fā)酵上清液。
(6)有效菌株篩選取步驟(5)各上清液與冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基按體積1 9 混合于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后在每個(gè)培養(yǎng)基平板上放一個(gè)直徑為4mm的供試菌餅，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，計(jì)算各菌株發(fā)酵液對(duì)供試病原菌的抑制率，從中篩選出高效抑菌內(nèi)生真菌菌株，備用。(7)側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物病蟲草害中的應(yīng)用將步驟(6)篩選出的高效菌株，采用步驟(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，以其上清液或發(fā)酵混合物， 配以適量農(nóng)用藥物輔料，制備成多種劑型的農(nóng)用藥物。本發(fā)明(6)所述供試菌為蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、葡萄黑痘病菌 (Elsinoe ampelina)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本用途發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1 側(cè)柏內(nèi)生真菌的典型分離培養(yǎng)從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園采集側(cè)柏莖葉等組織，自來水洗凈晾干，75%乙醇浸泡5min， 0. 升汞浸泡aiiin，進(jìn)行表面消毒，最后用無菌水漂洗5次。用無菌濾紙吸干水分備用。 表面消毒后的莖組織，直接接種于PDA培養(yǎng)基表面，置于(27士 1) °C恒溫箱培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長(zhǎng)的莖組織。在無菌狀態(tài)下，將上述無菌莖組織切成0. 2cmX0. 2cm的片段，接入新鮮的PDA培養(yǎng)基中，置于(27 士 1)°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)樣品周圍明顯長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌絲顏色，形態(tài)以及長(zhǎng)出的先后順序，挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，反復(fù)純化直至獲得單一菌株，斜面保存編號(hào)備用。將上述分離得的側(cè)柏內(nèi)生真菌各菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基各組分與每升所含的質(zhì)量為蛋白胨2. 5g、玉米粉3g、麩皮5g、可溶性淀粉4g、葡萄糖4g、黃豆餅粉4g、CaC03 lg、NH4NO3 0. 6g、MgSO4 0. g、KH2PO4 0. 6g ；將500mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別裝在300mL三角瓶中，每瓶裝液量為50mL ；用接種鉤挑取少許菌絲接種于培養(yǎng)瓶中，置于(27 士 1) °C搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)5天，發(fā)酵液經(jīng) 5000r/min離心lOmin，取發(fā)酵上清液。實(shí)施例2 側(cè)柏內(nèi)生菌典型活性(殺菌)篩選取上述各菌株發(fā)酵上清液ImL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷去至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻凝固后在每個(gè)培養(yǎng)基平板上放一個(gè)直徑為4mm的供試菌餅，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以無菌水處理作為對(duì)照，重復(fù)三次。采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，以下列公式計(jì)算抑制率菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)X 100% /(對(duì)照菌落直徑-4)結(jié)果表明有21株至少對(duì)1種植物病原真菌有拮抗作用(占總分離株數(shù)的 19. )，編號(hào)為G21、J77、J86、TO1、TO7、Y127的內(nèi)生真菌對(duì)蘋果腐爛病菌和葡萄黑痘病菌有較強(qiáng)的拮抗作用。實(shí)施例3 側(cè)柏內(nèi)生菌典型制劑制備產(chǎn)品含2 %的J77菌種代謝產(chǎn)物，加入3 %的白炭黑作為吸附劑，并加入1 %的農(nóng)乳0203-B和3%的木質(zhì)素磺酸鈉輔料，最后用輕質(zhì)碳酸鈣補(bǔ)足100%，混勻后，經(jīng)氣流粉碎制成可濕性粉劑。
權(quán)利要求
1.側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的農(nóng)藥活性及其在防治作物上病、蟲、草害的應(yīng)用
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在防治作物上病、蟲、草害的應(yīng)用，其特征在于將菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，以其上清液或發(fā)酵混合物，配以農(nóng)用藥物輔料，制備成多種劑型的農(nóng)用藥物。
全文摘要
本發(fā)明(名稱為側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的農(nóng)用生物活性及其應(yīng)用)涉及側(cè)柏內(nèi)生真菌及其分離培養(yǎng)方法和其代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)業(yè)主要病蟲草害的抑制作用。該真菌分離自側(cè)柏，它對(duì)蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、葡萄黑痘病菌(Elsinoe ampelina)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)等多種農(nóng)業(yè)植物病原菌具有較好的抑菌活性，同時(shí)對(duì)反枝莧、野燕麥等多種雜草及多種害蟲也有一定抑制作用。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102204568SQ201010154980
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者王現(xiàn)坤, 郝雙紅, 魏艷 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)