專利名稱：一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物細(xì)胞工程及作物雜交育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用花粉雄核培養(yǎng)和二倍體化處理技術(shù)，快速獲得北五味子雜交純合系，并以其作為供選母本，與父本進(jìn)行 北五味子雜交育種的方法。
背景技術(shù)：
北五味子是我國東北地區(qū)重要的藥用植物資源，果實除藥用外還可加工風(fēng)味獨特 的果酒和果汁飲料，應(yīng)用前景十分廣闊。近年來，北五味子作為短缺藥材和食品原料，在東 北三省呈現(xiàn)積極的發(fā)展態(tài)勢。目前，北五味子的藥用原料依賴于野生資源，我國中藥材市場、制藥和釀酒加工企 業(yè)年需五味子干品7000-8000噸，而野生資源的年產(chǎn)量只有500-700噸，市場供需矛盾日趨 緊張。近年來由于國內(nèi)外市場對五味子的需求日益增加，野生北五味子被大量采挖，遭到嚴(yán) 重破壞。因此，在加強(qiáng)野生資源保護(hù)力度的同時，開展大面積人工栽培是解決原料短缺的根 本途徑。變野生為家植的成功實踐正推動著這一新興栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。自然界分布了很多 的野生類型，未經(jīng)純化直接種植，導(dǎo)致產(chǎn)生種質(zhì)混雜。北五味子變異類型很多，因此要規(guī)范 它的種植，避免產(chǎn)量高的五味子和產(chǎn)量低的五味子混雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)含量高的五味子和 含量低的五味子混雜，抗病的五味子和不抗病的混雜等問題。北五味子人工馴化和栽培只有近30多年的歷史，建園所用幼苗以實生苗為主，因 而品種極其混雜，個體間表型千差萬別，這樣不僅不利于果園統(tǒng)一管理，而且會影響藥效。 北五味子育種與栽培技術(shù)的研究，是解決擴(kuò)大北五味子資源量的措施之一。為了保護(hù)野生 資源和滿足越來越大的生產(chǎn)需要，我國從上世紀(jì)90年代開始重視北五味子的人工栽培研 究，系統(tǒng)地開展了規(guī)范化栽培、資源收藏評價、新品種選育研究；并選育出我國第一個北五 味子無性系新品種“紅珍珠”。因為沒有成熟的無性繁殖體系，這一優(yōu)良品種得不到推廣。 目前“紅珍珠”只能通過種子繁殖來生產(chǎn)苗木，其后代不可能維持母體的優(yōu)良特性?？傮w而 言，優(yōu)良品種依然較少，不利于五味子的規(guī)?；a(chǎn)，而且這些品種還有一個共同的弱點， 即來源于天然自交或雜交，優(yōu)良性狀單一，優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)不能統(tǒng)一，其中表現(xiàn)最明顯的就是抗 病性、抗逆性(低溫、干旱等)低，因此急需一種有效的北五味子無性繁殖方法來推廣這一 優(yōu)良品種。用組織培養(yǎng)的方法繁殖苗木，可以解決北五味子栽培及優(yōu)質(zhì)苗木快速繁殖等問 題，為北五味子栽培技術(shù)提供新方法。關(guān)于北五味子的組織培養(yǎng)研究，陳雅君、周鑫通過以 帶腋芽的嫩莖為外植體，誘導(dǎo)腋芽分化，并進(jìn)一步形成完整植株，但由于增殖倍數(shù)只有3. 2 倍和芽生長速度太慢(培養(yǎng)15d，長0. 7cm)而不能應(yīng)用于生產(chǎn)；胡寶忠、李興亮對五味子組 織培養(yǎng)中的外植體和培養(yǎng)基進(jìn)行了比較和優(yōu)化，利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑也可以獲得五味 子再生植株，且可大規(guī)模獲得植株，有助于保存種質(zhì)資源；李成浩等利用營養(yǎng)器官誘導(dǎo)體細(xì) 胞胚發(fā)生獲得再生植株；Smiskova等和Kim等以五味子合子胚作為外植體進(jìn)行體細(xì)胞胚誘 導(dǎo)獲得再生植株。
根據(jù)育種目標(biāo)選擇親本是育種能否成功的關(guān)鍵，沒有符合育種條件的親本，想育 成好的品種是不可能的事。這就需要根據(jù)北五味子性狀遺傳規(guī)律判斷出最有希望的親本， 確定合適的雜交組合。從目前五味子品種的選育方法分析，已獲得的優(yōu)良品種主要來源于 野生和實生植株的自然變異，不僅選種工作方向性差、效率低、育種目標(biāo)不明確，而且育出 品種遺傳背景紛繁復(fù)雜，因而無法實現(xiàn)品種的進(jìn)一步改良和系列化。雜交育種是最基本的、 貢獻(xiàn)最大的一種育種方法，以培育純系品種或混系品種為目標(biāo)，因目前尚無優(yōu)良品種苗木， 生產(chǎn)用苗仍以實生苗為主。但在以種子進(jìn)行有性繁殖過程中優(yōu)良性狀無法控制，有些甚至 丟失。純合體是雜交育種的最佳材料。北五味子是雌雄同株的單性花植物，遺傳機(jī)制復(fù) 雜，采用常規(guī)途徑獲得相對純合的親本，周期很長，至少需要經(jīng)過5-7代親本自交。植物花 粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)已在數(shù)百種植物上獲得成功，花粉作為單倍有機(jī)個體，可以在1-2年內(nèi) 通過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得純合個體，因此開展北五味子花粉培養(yǎng)，有助于快速獲得大量單倍體植 株，經(jīng)過人工誘發(fā)加倍，獲得純合二倍體植株，根據(jù)育種目標(biāo)篩選出優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)材料作為親 本，通過常規(guī)雜交育種培育出北五味子的優(yōu)良雜交新品種，從而加速北五味子育種進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用花粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)快速獲得單倍體植株，并利 用二倍體化技術(shù)誘發(fā)產(chǎn)生二倍體植株，為北五味子常規(guī)雜交育種提供純系二倍體親本的方 法。本發(fā)明的一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法，包括下列步驟一.北五味子花粉單倍體植株的培育1.將成熟的處于總苞開裂臨界期的北五味子雄花序，進(jìn)行低溫、表面消毒和干燥 處理；2.分離出花粉；3.接種到 MS 培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15 :473_497，1962) 上直接誘導(dǎo)形成愈傷組織；4.選取新鮮致密的高活性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(MS+2，4_D 1. Omg/ L+6-BA 0. 5mg/L+NAA 0. lmg/L)中分化形成再生苗；5.再生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖、0. 8%瓊脂)；6.培育出花粉單倍體植株。二.北五味子純合二倍體的獲得1.對由花粉經(jīng)誘導(dǎo)、分化、生根形成的候選單倍體植株，進(jìn)行染色體形態(tài)觀察和核 型分析、確認(rèn)；2.用0. -0. 3%秋水仙素溶液，對所選取的生長良好的單倍體植株的莖尖生長 點或正在膨大的根尖進(jìn)行處理，獲得候選純合二倍體植株；3.對候選純合二倍體植株進(jìn)行核型分析、確認(rèn)；4.純合二倍體植株隔離條件自交擴(kuò)繁后，繁育出可作為母本的二倍體純合系。三.雜交北五味子品種的培育1.以選育的純合二倍體植株為母本；
2.以配合力強(qiáng)的自交系，或進(jìn)一步經(jīng)遺傳改良的自交系為父本；3.對母本和父本實施雜交組合，篩選獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗凍、抗旱的北五味子新品 種。對母本和父本實施雜交組合中，北五味子母本的原始材料選自各種來源的品種、 品系或野生種，北五味子父本是配合力強(qiáng)的自交系或進(jìn)一步經(jīng)遺傳改良的自交系。
上述北五味子母本的原始材料的品種、品系或者野生種可以為中國吉林省靖宇縣 農(nóng)家品種，或適宜種植的優(yōu)質(zhì)品種、品系。以下內(nèi)容將對本發(fā)明中的常用術(shù)語進(jìn)行解釋“北五味子種質(zhì)資源”是制作北五味子母本的原始材料，可以是各種來源(國內(nèi)或 者國外)的品種、品系或者野生種，但以適種優(yōu)質(zhì)品種、品系或當(dāng)?shù)刂惺燹r(nóng)家品種為首選； 北五味子父本是配合力強(qiáng)的自交系或者進(jìn)一步經(jīng)遺傳改良的自交系?！氨奔?號”北五味子純合二倍體是選取吉林省北佳中藥材科技開發(fā)有限公司 繁育基地種植的具有優(yōu)良性狀的北五味子花粉，獲得單倍體再生植株，并誘發(fā)其產(chǎn)生的 二倍體植株，采用ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)標(biāo)記技術(shù)、色譜指紋圖譜和 HPLC(HighPerformance Liquid Chromatography)分析遺傳多樣性和種質(zhì)資源的優(yōu)劣。經(jīng) 鑒定，該純合二倍體植株綜合性狀優(yōu)良，其有效成分與栽培的北五味子相差不大，但具有高 產(chǎn)、抗凍、抗旱等特性。本發(fā)明的積極效果在于針對北五味子作為珍稀藥用植物，目前尚無優(yōu)良品種苗 木，生產(chǎn)用苗仍以實生苗為主，種質(zhì)混雜，育種材料嚴(yán)重缺乏、育種周期長、育種效率低、特 定地區(qū)適種北五味子優(yōu)質(zhì)品種嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀，利用花粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)快速獲得單倍體 植株，并利用二倍體化技術(shù)誘發(fā)產(chǎn)生二倍體植株，為北五味子常規(guī)雜交育種提供純系二倍 體親本的方法。
具體實施例方式以下只是作為事例說明發(fā)明人實施本發(fā)明的過程，并不限制本發(fā)明的其它實施范 圍，也不排除使用者可使用其它更加有效的方案。1.單倍體植株快速獲得技術(shù)以吉林省北佳中藥材科技開發(fā)有限公司繁育基地種植的具有優(yōu)良性狀的北五味 子為原始種質(zhì)材料，當(dāng)雄花總苞處于開裂臨界期(似開未開)，此時雄花已經(jīng)成熟；上午 8:00-9:00采集單核中晚期的花蕾用冰壺帶回實驗室，小心摘取雄花序，立即放在黑暗干燥 的容器中，并在-15°C冰箱中進(jìn)行10-30天的低溫處理。在超凈工作臺上，選擇完整未破裂 的花蕾，先用70%酒精浸泡10s，然后用20%的次氯酸鈉溶液消毒5min，并用無菌水沖洗 3-4次，放在超凈臺上風(fēng)吹30min至干。用鑷子夾住花苞基部，用解剖針剝開花苞，然后敲打 鑷子，使花粉均勻散落在含有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用封口膜封好。整個過程要注意雜 菌污染?；ǚ墼贛S培養(yǎng)基中首先置于4°C低溫處理24h，然后放在24_26°C、光照時間12h/ d、光照強(qiáng)度25001x的人工氣候箱中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，直至形成愈傷組織，選取新鮮致密的高 活性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到添加了 1. Omg/L 2，4-D、0. 5mg/L 6-BA和0. lmg/L NAA的最優(yōu)MS培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至形成花粉單倍體植株。此過程中，要經(jīng)常觀察污染情況、培養(yǎng)基失水情況等，并及時處理污染，或更換新鮮的培養(yǎng)基。單倍體植株的核型分析取花粉植株的根尖，采用染色體常規(guī)切片和壓片技術(shù)，以8-羥基喹啉(或者二氯苯)飽和溶液進(jìn)行預(yù)處理3-5h，然后用卡諾固定液固定2-24h，經(jīng) 50%乙醇浸泡，蒸餾水沖洗，以及l(fā)mol/L濃度的鹽酸溶液解離7-8min后，洗去鹽酸，進(jìn)行卡 寶品紅染色3-5min制片，顯微鏡檢查，并以染色體數(shù)目確認(rèn)單倍體。2.純合二倍體植株獲得方法選擇確認(rèn)為單倍體的生長良好的植株，然后用0. 1-0. 3%秋水仙素溶液，處理其 莖尖生長點，或用棉球進(jìn)行全株涂抹，即可獲得純合二倍體植株；秋水仙素優(yōu)選的濃度為 0. 2%。處理后進(jìn)行定期核型分析，以確認(rèn)二倍體植株。3.北五味子雜交種的選育北五味子供試父本在吉林省北佳中藥材科技開發(fā)有限公司繁育基地選擇具有優(yōu) 良性狀的北五味子“紅珍珠”(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所選育)植株北五味子純合二倍體母本的繁育花粉培育并二倍化的純合北五味子植株，選取 優(yōu)質(zhì)和多抗的植株為供試母本。在開花前1-2天，雌蕊表現(xiàn)出較強(qiáng)的生理活性，是授粉的最佳時機(jī)；在培育過程 中，及時清除地下橫走莖，提高母體的營養(yǎng)水平，促進(jìn)雌花分化。
權(quán)利要求
一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法，其特征在于包括下列步驟(1)北五味子花粉單倍體植株的培育；(2)北五味子純合二倍體的獲得；(3)雜交北五味子品種的培育。
2.按權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法，其特征在于步 驟(1)中所述的北五味子花粉單倍體植株的培育包括下列步驟(1)將成熟的處于總苞開裂臨界期的北五味子雄花序，進(jìn)行低溫、表面消毒和干燥處理；(2)分離出花粉；(3)接種到MS 培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15 :473_497，1962)上 直接誘導(dǎo)形成愈傷組織；(4)選取新鮮致密的高活性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(MS+2，4-D1. Omg/ L+6-BA0. 5mg/L+NAA 0. lmg/L)中分化形成再生苗；(5)再生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS+NAA0. lmg/L+3%蔗糖、0.8%瓊脂)；(6)培育出花粉單倍體植株。
3.按權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法，其特征在于步 驟(2)中所述的北五味子純合二倍體的獲得包括下列步驟(1)對由花粉經(jīng)誘導(dǎo)、分化、生根形成的候選單倍體植株，進(jìn)行染色體形態(tài)觀察和核型 分析、確認(rèn)；(2)用0.1%-0. 3%秋水仙素溶液，對所選取的生長良好的單倍體植株的莖尖生長點 或正在膨大的根尖進(jìn)行處理，獲得候選純合二倍體植株；(3)對候選純合二倍體植株進(jìn)行核型分析、確認(rèn)；(4)純合二倍體植株隔離條件自交擴(kuò)繁后，繁育出可作為母本的二倍體純合系。
4.按權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法，其特征在于步 驟(3)中所述的雜交北五味子品種的培育包括下列步驟(1)以選育的純合二倍體植株為母本；(2)以配合力強(qiáng)的自交系，或進(jìn)一步經(jīng)遺傳改良的自交系為父本；(3)對母本和父本實施雜交組合，篩選獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗凍、抗旱的北五味子新品種。
5.按權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法，其特征在于步 驟(3)中所述的對母本和父本實施雜交組合中，北五味子母本的原始材料選自各種來源的 品種、品系或野生種，北五味子父本是配合力強(qiáng)的自交系或進(jìn)一步經(jīng)遺傳改良的自交系。
全文摘要
一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北五味子雜交純合系的快速繁育方法屬植物細(xì)胞工程及作物雜交育種技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明包括北五味子花粉單倍體植株的培育、北五味子純合二倍體的獲得和雜交北五味子品種的培育；本發(fā)明針對北五味子作為珍稀藥用植物，目前尚無優(yōu)良品種苗木，生產(chǎn)用苗仍以實生苗為主，種質(zhì)混雜，育種材料嚴(yán)重缺乏、育種周期長、育種效率低、特定地區(qū)適種北五味子優(yōu)質(zhì)品種嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀，利用花粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)快速獲得單倍體植株，并利用二倍體化技術(shù)誘發(fā)產(chǎn)生二倍體植株，為北五味子常規(guī)雜交育種提供了純系二倍體親本的方法。
文檔編號A01H4/00GK101803568SQ201010157849
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者劉金亮, 劉鈺才, 張世宏, 張莉弘, 潘洪玉, 魏毅 申請人:吉林大學(xué)