專利名稱：油菜餅抗菌肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于生產(chǎn)飼料和食品防腐劑的油菜餅抗菌肽。
背景技術(shù)：
在飼料中添加防腐劑、防霉劑等是延長飼料保質(zhì)期的有效措施之一，但這些飼料 保存劑都是化學(xué)藥劑，存在殘留問題，產(chǎn)生毒副作用，會間接影響到人體健康。抗生素作為 抗菌助長劑添加到飼料中由來已久。它能夠減少動物的發(fā)病率；抑制腸道中有害微生物， 提高動物對養(yǎng)分的吸收率具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。但是，抗生素在動物體內(nèi)和動物產(chǎn)品中的 殘留，以及病原菌產(chǎn)生的抗藥性問題，對人類的健康和環(huán)境產(chǎn)生了負(fù)面的影響。隨著抗生素 的大量、廣泛地用于飼料中和人們對食品質(zhì)量的要求越來越高，人們對其使用的副作用認(rèn) 識日益加深，抗生素在飼料業(yè)已面臨著淘汰或禁用的局面。而化學(xué)防腐劑、防霉劑以及抗生 素隨著飼料到達(dá)胃腸道，會影響體內(nèi)正常的微生物菌群，破壞其間的平衡，造成消化功能紊 亂，進(jìn)而引起慢性腹瀉等消化道疾病，尋找新型、安全的抗菌劑代替抗生素，已成為當(dāng)前國 內(nèi)外飼料學(xué)科的一項(xiàng)重要內(nèi)容?？咕?antimicrobial peptides, AMPs)因具有廣譜的抗細(xì)菌活性，高效的抗 真菌、病毒和原蟲的活性；熱穩(wěn)定性好；抗菌機(jī)理獨(dú)特，不易產(chǎn)生抗藥性等特性，正引起 人們的關(guān)注，有望成為替代抗生素的產(chǎn)品之一。研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽廣泛存在于原核生物、 植物及動物體內(nèi)，并在生物的天然防御系統(tǒng)中起著重要的作用?？咕陌辜?xì)菌多肽 (antibacterial peptides)禾口抗真菌多月太(antifungal peptides)。目前，不少研究者對抗菌肽做了一些相關(guān)的研究。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鱟素對多種飼料 中的有害微生物包括致病性和相對致病性飼料細(xì)菌、飼料霉菌等均有高效的殺菌作用，有 望成為一種新型高效、環(huán)保的綠色飼料添加劑應(yīng)用于飼料的保鮮防腐。馬衛(wèi)明等發(fā)現(xiàn)豬小 腸抗菌肽對雞、豬大腸桿菌株、雞白痢沙門氏菌株、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、魚致病 性嗜水氣單胞菌等11株細(xì)菌均有不同程度的抑制作用。溫劉發(fā)等人通過在畜禽魚的飼料 中添加抗菌蛋白或抗菌肽，發(fā)現(xiàn)無論是在日生長速度、相對增重率、飼料系數(shù)、成活率，還是 抗病力方面均有顯著提高。此外，國外有報(bào)道稱，抗菌肽對飼料防霉也有一定的效果。國內(nèi)的抗菌肽研究主要集中在動物和微生物源抗菌肽的理化性質(zhì)，作用機(jī)制以及 基因工程應(yīng)用方面，對植物源抗菌肽的研究相對較少。四川大學(xué)資源微生物學(xué)及微生物生 物技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長期都在對植物源抗菌蛋白和肽進(jìn)行篩選，通過篩選證實(shí)很多植 物都含有抗菌蛋白和肽類物質(zhì)。特別是我國大面積種植的甘藍(lán)型油菜，是油菜生產(chǎn)大國，而 榨油之后的副產(chǎn)品油菜餅也產(chǎn)量巨大，為抗菌肽的獲取提供了豐富的資源。本發(fā)明提供了油菜餅抗菌肽的分離純化方法和穩(wěn)定性測試方法、動物急性毒性試 驗(yàn)方法以及提供一種防止飼料中霉菌的應(yīng)用方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及來源于油菜餅(Rape-seed meal)的抗菌肽，對飼料中引起霉變的某些真菌有較好的抑制效果。飼料因微生物尤其是霉菌污染而造成飼料品質(zhì)下降，甚至影響動物的健康，給飼 料生產(chǎn)企業(yè)和畜牧生產(chǎn)者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。飼料霉變是各種霉菌在適宜的溫度、濕度 和營養(yǎng)環(huán)境下迅速生長而造成的，其結(jié)果是使飼料發(fā)熱、結(jié)塊、有霉味，甚至改變飼料顏色 并產(chǎn)生霉菌毒素。受霉菌感染的飼料，由于霉菌生長消耗飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，以及在霉菌所 含酶的作用下使飼料的組成成分發(fā)生改變或分解，致使飼料的營養(yǎng)價值嚴(yán)重降低。此外，動 物食用被霉菌污染的飼料后，霉菌毒素會殘留在動物體及其代謝產(chǎn)物中，因而可能會造成 動物性食品污染，再通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生極大的危害。因此，采用高效低毒的防霉劑 對飼料中霉菌及其毒素進(jìn)行預(yù)防處理，對于保證飼料質(zhì)量，保護(hù)人與動物的生命安全具有 十分重要的意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽不僅具有廣譜高效殺菌活性，還具有穩(wěn)定性好、水溶性 好、抗菌機(jī)理獨(dú)特、對高等動物正常細(xì)胞無害等特點(diǎn)?？咕鞍?肽)在農(nóng)業(yè)包括飼料生產(chǎn) 中的研究也逐漸深入，但研究多集中于在飼料中添加抗菌肽以預(yù)防動物疾病，從而成為傳 統(tǒng)抗生素的代替物等方面，但是將其開發(fā)成為飼料防霉劑方面的研究卻很少。本發(fā)明的目的是提供一種新的抗菌肽，可用于飼料甚至食品的腐敗真菌的防治。 從油菜餅的水溶性物質(zhì)中分離到具有抗真菌活性的小肽。該活性肽熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在PH7 8 的時候抑菌效果最為明顯。動物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，提取的抗菌肽為無毒物質(zhì)。通過 與幾種防腐劑對飼料中霉菌抑制作用的比較發(fā)現(xiàn)，油菜餅粕抗菌肽提取物的防霉性能優(yōu)于 恩拉鼎(Enradin)、富馬酸，僅次于復(fù)合型防霉劑霉必克，可以開發(fā)成為一種高效的植物源 性飼料防腐劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一套油菜餅抗菌肽的分離純化方法。本發(fā)明的抗菌肽 可用諸如鹽析、分子篩以及多維色譜技術(shù)等進(jìn)行分離?？紤]到成本問題，可以以抗菌肽初提 物的形式加以應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是提供一種油菜餅抗菌肽在飼料防霉中的應(yīng)用方法，包括用 量和條件等。步驟為1)培養(yǎng)基制備PDA培養(yǎng)基(土豆馬鈴薯培養(yǎng)基)馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水1000mL, pH自然;121°C 滅菌 30min。2)抗真菌活性檢測方法①孢子懸液的制備取長滿真菌菌落(已形成分生孢子)的PDA平板，加入適量無菌水，玻璃棒輕輕攪 動洗脫孢子。然后將該洗脫液過濾，除去菌絲，加適量無菌水配制制成3 5X 104個孢子/ mL左有的孢子懸液，置4°C條件下保存。供試菌株為柑橘綠霉和黑曲霉。②打孔法制作PDA平板，吸取100 U L供試菌種的孢子懸液，無菌操作，均勻涂布到平板上， 晾干。用6mm直徑的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加樣品或無菌水至平滿，正面放 置，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d。測量抑菌圈直徑。3)油菜餅抗菌肽的分離純化
①油菜蛋白粗提液的制備稱取一定量油菜餅?zāi)ニ?，?00mL0. 05mol/L的pH8. 0的Tris-HCl緩沖液，4°C放 置12h后，4°C，4000r/min離心30min取上清液。②硫酸銨沉淀粗蛋白上清液用飽和度為60士5%的硫酸銨沉淀，4°C放置過夜，4°C，14，000r/min離心 20min，取沉淀，用lmL 0. 05mol/L的pH8. 0的Tris-HCl緩沖液溶解。③脫鹽將粗提液放入透析袋中，透析液選用0. 05mol/L的pH 8. 0的Tris-HCl緩沖液，每 隔2小時換一次透析液。④分子篩柱層析Sephadex G-100，取提取液上樣，用 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl 緩沖液洗脫， 流速0. 15mL/min,每3min收集1管，逐管收集，以洗脫液為對照測定每管的0D28(I值。并測 試每管洗脫液的抑菌活性。⑤高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)純化對具 有抑菌效果的收集液進(jìn)一步純化。檢測各峰抑菌活性，收集抗菌活性部分。⑥分離液濃縮將具有抗菌活性的分離液冷凍干燥，粉末用適當(dāng)體積的0. 05mol/L的pH8. 0的 Tris-HCl緩沖液溶解備用。4)油菜餅抗菌肽的活性測定①將真菌接種在PDA平板上，28°C培養(yǎng)三天，讓其形成成熟的孢子。供試菌株玉米 赤霉、柑橘綠霉、黑曲霉、黃曲霉。②用接種針勾取少量孢子(無菌操作)混入2ml無菌水中，劇烈震蕩后加入約 200ml 50°C左右的PDA培養(yǎng)基(已加入了 100 y g/ml的氨卞青霉素)中，立即混勻倒板，冷 卻待用。③活性測定時，用6mm直徑打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加樣品至平板， 正面放置，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d。測量抑菌圈直徑。5)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離小肽的Tricine-SDS-PAGE，分離膠濃度4%，濃縮膠濃度15%，樣品分別添加 還原性樣品緩沖液(含巰基乙醇)和非還原性樣品緩沖液(不含巰基乙醇)，在沸水中煮 5-10分鐘，冷卻離心后取20 u 1上樣。6)抗菌肽的穩(wěn)定性分析①熱穩(wěn)定性檢測將抗菌肽分離液于40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、120°C下分別處理 15min,以柑橘綠霉為供試菌，以原抗菌肽分離液作為對照，重復(fù)3次，測定其抑菌圈直徑， 每個處理重復(fù)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小來確定其熱穩(wěn)定性。②酸堿穩(wěn)定性檢測將抗菌肽分離液5mL用lmol/L HC1調(diào)整pH為3、4、5、6、7五個處理；另取5mL抗 菌蛋白(肽)分離液用111101/1妝011調(diào)整？11為9、10兩個處理，以原抗菌肽分離液(pH8)作 為對照，以柑橘綠霉為受試菌，每個處理重復(fù)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小來確定其穩(wěn)定性。
7)對真菌抑制作用的掃描電鏡觀察在柑橘綠霉的抑菌實(shí)驗(yàn)中，未加入油菜餅抗菌肽提取液的平板未發(fā)生抑菌效果， 加入油菜餅抗菌肽提取液的平板產(chǎn)生了抑菌效果，分別切下前者菌絲正常生長的培養(yǎng)基 (A)和后者(B)抑菌圈內(nèi)的培養(yǎng)基，進(jìn)行電鏡觀察。8)油菜餅抗菌肽提取物的動物急性毒性試驗(yàn)選昆明種小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，體重為20士2g。將實(shí)驗(yàn)動物 隨機(jī)分為2組，每組10只，一個給藥組和一個對照組。雌雄分開喂養(yǎng)。按小鼠每10克體重 灌胃0. 4ml (已達(dá)最大體積)受試藥物(油菜餅抗菌肽提取液，0. 8g/mL)，一日內(nèi)給藥一次。 給藥后立即觀察至6小時，以后每天觀察，連續(xù)7天，第8天解剖觀察。9)油菜餅蛋白提取物對飼料中霉菌抑制作用。①抑菌活性試驗(yàn)采用平皿抑菌圈法，將配好的不同濃度的防霉物質(zhì)——油菜餅抗菌肽、恩拉鼎預(yù) 混劑、富馬酸、復(fù)合型防霉劑霉必克分別按0. 8%、0. 25%,0. 08%,0. 05%定量地加到定量 的已溶化的霉菌培養(yǎng)基中混勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻后在中心部位接種各 種測試菌株。由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未見報(bào)道，故試 驗(yàn)時它的添加量增加為正常使用量的250倍。同時設(shè)置空白組，置于恒溫恒濕箱內(nèi)(28°C) 培養(yǎng)，觀察霉菌的生長情況。②飼料防霉實(shí)驗(yàn)油菜餅抗菌肽提取物、恩拉鼎、富馬酸、復(fù)合型防霉劑霉必克分別按0.8%、 0.25%、0.08%、0.05%的添加量添加到粉料中，并設(shè)空白組(CK)。上述各成分分別進(jìn)行強(qiáng) 化試驗(yàn)和常規(guī)試驗(yàn)。強(qiáng)化試驗(yàn)該方法是提高飼料水分含量，惡化環(huán)境(高溫、高濕)，促使飼料盡快發(fā) 霉，根據(jù)霉變嚴(yán)重程度及測定霉菌總數(shù)來判斷防霉效果。在18%含水量的粉料中按設(shè)計(jì)的 比例添加防霉物質(zhì)，置培養(yǎng)箱(溫度36°C，相對濕度95%以上)培養(yǎng)。常規(guī)試驗(yàn)在正常飼料(粉料的自然水分為12. 58% )中按設(shè)計(jì)的比例添加防霉 物質(zhì)，同時設(shè)置空白組，在自然環(huán)境下儲放(試驗(yàn)期間溫度為25°C 30°C，空氣相對濕度為 80%左右)，各試驗(yàn)樣品采用獨(dú)立包裝，便于取樣。定期進(jìn)行水分、霉菌總數(shù)的測定，每天定 時觀測室溫、料溫、空氣相對濕度和飼料霉變情況等。③測定方法霉菌菌落總數(shù)的測定按GB/T 13092-2006飼料中霉菌總數(shù)的測定方法測定。水分的測定按GB/T 6435-1986飼料水分的測定方法測定。
具體實(shí)施例方式1)培養(yǎng)基制備PDA培養(yǎng)基(土豆馬鈴薯培養(yǎng)基)馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水lOOOmL，pH自然；121°C 滅菌 30min。2)抗真菌活性檢測方法①孢子懸液的制備取長滿真菌菌落(已形成分生孢子)的PDA平板，加入適量無菌水，玻璃棒輕輕攪
6動洗脫孢子。然后將該洗脫液用4層無菌紗布過濾，除去菌絲，加適量無菌水配制制成3 5X104個孢子/mL左右的孢子懸液，置4°C條件下保存。供試菌株為柑橘綠霉和黑曲霉。②打孔法制作PDA平板，吸取100 u L供試菌種的孢子懸液，無菌操作，均勻涂布到平板上， 晾干。用6mm直徑的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加樣品或無菌水至平滿，正面放 置，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d。測量抑菌圈直徑。3)油菜餅抗菌肽的分離純化①油菜蛋白粗提液的制備稱取油菜餅40g磨碎，加200mL 0. 05mol/L的pH8. 0的Tris-HCl緩沖液，4°C放置 12h 后，4°C，4000r/min 離心 30min 取上清液。②硫酸銨分級沉淀粗蛋白上清液200mL，分成5份，用硫酸銨沉淀，飽和度分別為30 %，40 %，50 %，60 %和 70% 4°C放置過夜，4°C，14，000r/min 離心 20min，取沉淀，用 lmL 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl緩沖液溶解。檢測其抑菌效果，篩選出具有最好抑菌效果的飽和度，按此飽和度進(jìn) 行鹽析。③脫鹽將粗提液放入透析袋中，透析液選用0. 05mol/L的pH 8. 0的Tris-HCl緩沖液，每 隔2小時換一次透析液。④分子篩柱層析Sephadex G-100，取提取液上樣，用 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl 緩沖液洗脫， 流速0. 15mL/min，每3min收集1管，逐管收集，以洗脫液為對照測定每管的0D28(I值。并測 試每管洗脫液的抑菌活性。 冑雙 1 才目fei普夕去(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) i^it對具有抑菌效果的收集液進(jìn)一步純化。檢測各峰抑菌活性，收集抗菌活性部分。⑥分離液濃縮將具有抗菌活性的分離液冷凍干燥，粉末用適當(dāng)體積的0. 05mol/L的pH8. 0的 Tris-HCl緩沖液溶解備用。4)油菜餅抗菌肽的活性測定①將真菌接種在PDA平板上，28 °C培養(yǎng)三天，讓其形成成熟的孢子。供試菌株玉米 赤霉、柑橘綠霉、黑曲霉、黃曲霉。②用接種針勾取少量孢子(無菌操作)混入2ml無菌水中，劇烈震蕩后加入約 200ml 50°C左右的PDA培養(yǎng)基(已加入了 100 y g/ml的氨卞青霉素)中，立即混勻倒板，冷 卻待用。③活性測定時，用6mm直徑打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加樣品至平板， 正面放置，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d。測量抑菌圈直徑。5)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離小肽的Tricine-SDS-PAGE，分離膠濃度4%，濃縮膠濃度15%，樣品分別添加 還原性樣品緩沖液(含巰基乙醇)和非還原性樣品緩沖液(不含巰基乙醇)，在沸水中煮 5-10分鐘，冷卻離心后取20 u 1上樣。
6)抗菌肽的穩(wěn)定性分析①熱穩(wěn)定性檢測將抗菌肽分離液于40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、120°C下分別處理 15min,以柑橘綠霉為供試菌，以原抗菌肽分離液作為對照，重復(fù)3次，測定其抑菌圈直徑， 每個處理重復(fù)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小來確定其熱穩(wěn)定性。②酸堿穩(wěn)定性檢測將抗菌肽分離液5mL用lmol/L HC1調(diào)整pH為3、4、5、6、7五個處理；另取5mL抗 菌蛋白(肽)分離液用111101/1妝011調(diào)整？11為9、10兩個處理，以原抗菌肽分離液(pH8)作 為對照，以柑橘綠霉為受試菌，每個處理重復(fù)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小來確定其穩(wěn)定性。7)對真菌抑制作用的掃描電鏡觀察在柑橘綠霉的抑菌實(shí)驗(yàn)中，未加入油菜餅抗菌肽提取液的平板未發(fā)生抑菌效果， 加入油菜餅抗菌肽提取液的平板產(chǎn)生了抑菌效果，分別切下前者菌絲正常生長的培養(yǎng)基 (A)和后者(B)抑菌圈內(nèi)的培養(yǎng)基，進(jìn)行電鏡觀察。8)油菜餅抗菌肽提取物的動物急性毒性試驗(yàn)選昆明種小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，體重為20士2g。將實(shí)驗(yàn)動物 隨機(jī)分為2組，每組10只，一個給藥組和一個對照組。雌雄分開喂養(yǎng)。按小鼠每10克體重 灌胃0. 4ml (已達(dá)最大體積)受試藥物(油菜餅抗菌肽提取液，0. 8g/mL)，一日內(nèi)給藥一次。 給藥后立即觀察至6小時，以后每天觀察，連續(xù)7天，第8天解剖觀察。9)油菜餅蛋白提取物對飼料中霉菌抑制作用。①抑菌活性試驗(yàn)采用平皿抑菌圈法，將配好的不同濃度的防霉物質(zhì)——油菜餅抗菌肽、恩拉鼎預(yù) 混劑、富馬酸、復(fù)合型防霉劑霉必克分別按0. 8%、0. 25%、0. 08%、0. 05%定量地加到定量 的已溶化的霉菌培養(yǎng)基中混勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻后在中心部位接種各 種測試菌株。由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未見報(bào)道，故試 驗(yàn)時它的添加量增加為正常使用量的250倍。同時設(shè)置空白組，置于恒溫恒濕箱內(nèi)(28°C) 培養(yǎng)，觀察霉菌的生長情況。抑菌活力(％ )=(對照菌盤擴(kuò)展直徑_含抗菌物質(zhì)菌盤擴(kuò)展直徑)X 100% /對 照菌盤擴(kuò)展直徑。②飼料防霉實(shí)驗(yàn)油菜餅抗菌肽提取物、恩拉鼎、富馬酸、復(fù)合型防霉劑霉必克分別按0.8%、 0.25%、0.08%、0.05%的添加量添加到粉料中，并設(shè)空白組(CK)。上述各成分分別進(jìn)行強(qiáng) 化試驗(yàn)和常規(guī)試驗(yàn)。強(qiáng)化試驗(yàn)該方法是提高飼料水分含量，惡化環(huán)境(高溫、高濕)，促使飼料盡快發(fā) 霉，根據(jù)霉變嚴(yán)重程度及測定霉菌總數(shù)來判斷防霉效果。在18%含水量的粉料中按設(shè)計(jì)的 比例添加防霉物質(zhì)，置培養(yǎng)箱(溫度36°C，相對濕度95%以上)培養(yǎng)。常規(guī)試驗(yàn)在正常飼料(粉料的自然水分為12. 58% )中按設(shè)計(jì)的比例添加防霉 物質(zhì)，同時設(shè)置空白組，在自然環(huán)境下儲放(試驗(yàn)期間溫度為25°C 30°C，空氣相對濕度為 80%左右)，各試驗(yàn)樣品采用獨(dú)立包裝，便于取樣。定期進(jìn)行水分、霉菌總數(shù)的測定，每天定 時觀測室溫、料溫、空氣相對濕度和飼料霉變情況等。
③測定方法霉菌菌落總數(shù)的測定按GB/T 13092-2006飼料中霉菌總數(shù)的測定方法測定。水分的測定按GB/T 6435-1986飼料水分的測定方法測定。10)結(jié)果油菜餅粗蛋白純化方法中鹽析用硫酸銨的最適飽和度為60%，從油菜 餅的水溶性成分中分離得到小肽的提取物，其分子量在6. 2 8. 2KD之間。并且在溫度升 高到90°C依然保持活性，在pH7 8的時候抑菌效果最為明顯。該小肽物質(zhì)對受試真菌有 明顯的抑制作用。這種活性肽能夠很明顯地影響真菌菌絲和孢子的正常生理形態(tài)，但對小 鼠無不良影響。通過與幾種防腐劑對飼料中霉菌抑制作用的比較發(fā)現(xiàn)，油菜餅抗菌肽提取 物的防霉性能優(yōu)于恩拉鼎、富馬酸，僅次于復(fù)合型防霉劑霉必克。
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權(quán)利要求
一種油菜餅抗菌肽的分離純化、穩(wěn)定性和安全性測試方法，包括(1)培養(yǎng)基制備；(2)抗真菌活性檢驗(yàn)；(3)將一定量的油菜餅?zāi)ニ?，?00mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl緩沖液，4℃放置12h后，4℃，4000r/min離心30min取上清液；再通過飽和度為60±5％的硫酸銨沉淀、脫鹽(透析液選用0.05mol/L的pH 8.0的Tris-HCl緩沖液)、分子篩柱層析(Sephadex G-100，取提取液上樣，用0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫)以及高效液相色譜法對粗蛋白進(jìn)行純化，將純化后的分離液冷凍干燥成粉末，用適當(dāng)體積的0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解備用；(4)將提取的油菜餅抗菌肽進(jìn)行活性測定；(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定油菜餅抗菌肽的分子大??；(6)對提取的油菜餅抗菌肽進(jìn)行熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性分析；(7)掃描電鏡觀察油菜餅抗菌肽對真菌的抑制作用；(8)選昆明種小白鼠，做油菜餅抗菌肽提取物的動物急性毒性試驗(yàn)；(9)通過抑菌活性試驗(yàn)和飼料防霉實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)油菜餅抗菌肽提取物對飼料中霉菌的抑制作用。
2.權(quán)利要求1的粗蛋白提取材料，是油菜餅粕。
3.權(quán)利要求1的純化粗蛋白方法，所述硫酸銨沉淀所需的硫酸銨飽和度為60士5%。
4.權(quán)利要求1的純化粗蛋白方法，所述脫鹽所需透析液為0.05mol/L的pH8. 0的 Tris-HCl緩沖液。
5.權(quán)利要求1的純化粗蛋白方法，所述柱層析材料為S印hadexG-100，洗脫液為 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl 緩沖液。
6.權(quán)利要求1的供試菌株為玉米赤霉、柑橘綠霉、黑曲霉、黃曲霉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的對飼料中的霉菌有很好抑制作用的抗菌肽。該抗菌肽來源于油菜餅，其抑菌活性較高、分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全無毒，在飼料防腐試驗(yàn)中顯示出比單一化學(xué)防霉劑更好的抑菌效果。本發(fā)明還提供了油菜餅抗菌肽的分離純化方法、穩(wěn)定性測試方法、動物急性毒性試驗(yàn)方法以及提供一種防止飼料中霉菌的應(yīng)用方法。
文檔編號A23K1/00GK101849608SQ201010176000
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者侯若彤, 馮甦, 楊志榮, 聶遠(yuǎn)洋, 趙建, 顏亮 申請人:四川大學(xué)