專利名稱：一種利用有色稻米發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏的方法
技術領域：
一種利用富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏的方法。涉及發(fā)酵法培養(yǎng)豹斑毒鵝膏菌絲體，是將豹斑毒鵝膏子實體接種至新鮮的固體斜面上進行培養(yǎng)，待斜 面長好后接種至含較低濃度的富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟的液體培養(yǎng)基中進行種 子的培養(yǎng)，即對菌種加以馴化；再接入添加了足量富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟的液 體培養(yǎng)基中進行深層液體發(fā)酵培養(yǎng)。豹斑毒鵝膏菌又名豹斑毒傘，屬鵝膏菌屬鵝膏菌科傘 菌目。含有與毒蠅鵝膏菌相似的毒素及豹斑毒傘素等毒素。豹斑毒鵝膏的毒素，尤其是毒 蠅堿，對蠅蟲具有明顯的致死力，是一種很好的生物殺蟲劑。但豹斑毒鵝膏人工培養(yǎng)生長速 度較慢，且發(fā)酵菌絲體得率較低。富含微量元素的有色稻米通過微生物發(fā)酵加工成功能酒 釀后會產生發(fā)酵廢糟，發(fā)酵廢糟中仍含有較高含量的未被微生物轉化的微量元素、蛋白質 以及豐富的C、N源，所以利用該發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏菌絲體可得到較多的菌絲體混合 液。這樣既可提高該菌人工培養(yǎng)菌絲體產率，又充分消化和利用了有色稻米加工副產物。發(fā) 酵結束后，可將里面的殺病蟲活性粗提物提出，以用于防治林木病蟲。
背景技術：
鵝膏菌是世界性分布的大屬，隸屬于真菌界、擔子菌門、擔子菌綱、蘑菇目、鵝膏 科，由Persoon在1797年確立。由于鵝膏菌屬真菌于人類的生活息息相關，因而歷來受到 真菌學家的重視，其中關于鵝膏毒素的研究也十分豐富。由于鵝膏菌絕大多數為外生菌根 菌，與高等植物形成共生關系，很難進行人工培養(yǎng)。因此人工培養(yǎng)鵝膏菌，進而從中提取稀 有的同時又是生物學研究中有著重要價值的鵝膏毒素，是眾多真菌學家長期以來的一個愿 望。目前，已獲得人工純培養(yǎng)的鵝膏菌約有13種。在所有已經獲得純培養(yǎng)的種類中，有幾種 如毒蠅鵝膏，赭蓋鵝膏是比較容易培養(yǎng)的，而有的種類尤其是一些劇毒種類雖然有可以培 養(yǎng)的報道，但其生長及其緩慢，發(fā)酵所得菌絲體中有效成分含量很低。豹斑毒鵝膏菌又名豹 斑毒傘，屬鵝膏菌屬鵝膏菌科傘菌目，含有與毒蠅鵝膏菌相似的毒素及豹斑毒傘素等毒素。 豹斑毒鵝膏的毒素，尤其是毒蠅堿，對蠅蟲具有明顯的致死力，是一種很好的生物殺蟲劑。有色稻米，是在水稻生長發(fā)育過程中通過以微量元素富積技術為核心而培育出的 具有高含量的微量元素營養(yǎng)功能稻米，這些有色稻米以其果皮具有色素沉淀和微量元素而 得名。例如，高產富硒雜交紅米611A/R319是四川農業(yè)大學水稻研究所與四川大學共同研 究的高產雜交紅米，該雜交紅米同普通紅米一樣，含有眾多對人體健康有益的活性功能單 元，如花青素、黃酮、生物堿、留醇、強心甙等，在抗炎、抗過敏、改變體內酶活性、改善微循 環(huán)、增加冠狀動脈血流量、提高機體免疫功能、抗氧化和延緩衰老等方面意義重大。此外，還 含有較高的蛋白質和硒、鐵、鋅等微量元素。經檢測，有色稻米通過微生物發(fā)酵加工成功能 酒釀后產生的發(fā)酵廢糟含有較高含量的未被微生物轉化的微量元素以及豐富的C、N源。本方法利用富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏，不僅發(fā)酵生成的 菌絲體產量較多，而且其有效成分的含量高，同時利用了有色稻米加工產生的副產物，是一 種經濟有效的培養(yǎng)鵝膏菌的方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用有色稻米發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏的方法。本發(fā)明的技術方案將豹斑毒鵝膏子實體接種至新鮮的固體斜面上進行培養(yǎng)，待 斜面長好后接種至含較低濃度的富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟的液體培養(yǎng)基中進行 種子的培養(yǎng)，即對菌種加以馴化；再接入添加了足量富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟的 液體培養(yǎng)基中進行深層液體發(fā)酵培養(yǎng)。由于有色稻米發(fā)酵廢糟中含有豐富的硒 、鐵和鋅等 微量元素以及豐富的C、N源，所以該混合發(fā)酵液中營養(yǎng)物質豐富。這樣既可提高該菌人工 培養(yǎng)菌絲體產率，又充分消化和利用了有色稻米加工副產物。發(fā)酵結束后，將菌絲體中殺病 蟲活性成分進行粗提，以用于林木病蟲防治。步驟為1)待用菌種的培養(yǎng)出發(fā)菌株為豹斑毒鵝膏菌；①斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基配方以g/L計馬鈴薯200、瓊脂20、葡萄糖20、硫酸鎂2. 0、磷酸二氫鉀 3. 0，富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟2. 5，pH為6 ；培養(yǎng)方法取豹斑毒鵝膏菌子實體中心部分接種于新鮮的斜面上，在28°C下培養(yǎng) 30天左右；②500mL —級搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量150mL 培養(yǎng)基配方以g/L計馬鈴薯200、葡萄糖20、硫酸鎂2.0、磷酸二氫鉀3.0、維生素 B10. 01，蛋白胨5，富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟2. 5，pH為6 ；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的斜面接種至事先滅菌的搖瓶中，在28士 1°C下，轉速IlOrpm 下培養(yǎng)30天；③IOOOmL 二級搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量400mL 培養(yǎng)基配方與一級搖瓶種子培養(yǎng)基配方相同；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的一級種子以10%的接種量接種至事先滅菌的搖瓶中，在 28 士 1°C下，轉速IlOrpm下培養(yǎng)30天，即成待用菌種；2) 50L 一級液體種子培養(yǎng)，裝液量25-30L ①一級液體種子培養(yǎng)基配方以g/L計葡萄糖10、麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩 皮汁、酵母膏3. 0、維生素B1O. 01、硫酸鎂2. 0、磷酸二氫鉀3. 0、富含微量元素的有色稻米發(fā) 酵廢糟5，pH為6;②控制工藝在0. IMpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量5%-10%接入待用菌種， 溫度28 士 1°C，罐壓0. 05Mpa，通氣量1 0. 3，V/V，攪拌轉速IOOrpm ；③轉罐標準發(fā)酵時間30-40天，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌；3) 500L 二級液體種子培養(yǎng)，裝液量250-300L ①培養(yǎng)基配方與一級液體種子配方相同；②控制工藝在0. IMpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10% -15%接入一級種 子，溫度28 士 1°C，罐壓0. 05Mpa，通氣量1 0. 3，V/V，攪拌轉速IOOrpm ；③轉罐標準發(fā)酵時間30-40天，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌；
4) 3000L深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量1800L ①發(fā)酵培養(yǎng)基配方以g/L計葡萄糖5、麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁、酵母 膏3. 0、維生素B1O. 01、硫酸鎂2. 0、磷酸二氫鉀3. 0、富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟10， PH 為 6 ；②控制工藝在0. IMpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10% -15%接入二級種 子，溫度28 士 1°C，罐壓0. 05Mpa，通氣量1 0. 3，V/V，攪拌轉速IOOrpm ；
③放罐標準發(fā)酵時間30-40天，菌絲球上浮二分之一，鏡檢有鎖狀聯合，菌絲球 不能自溶；5)殺病蟲活性粗提物提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎2_3h，過濾濃縮后，用0. 22 μ m 濾膜過濾除菌即得。6)殺病蟲活性粗提物成分鑒定將所提出的粗提物用GC-MS分析其所含毒素成 分。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟進行純種液體 深層發(fā)酵培養(yǎng)豹斑毒鵝膏菌體，大大提高了產量。本發(fā)明主要采用富含微量元素有色稻米 發(fā)酵廢糟，污染小、成本低、工藝簡便、科技含量高、有效成分含量高、附加值高，適宜工業(yè)化 生產。
具體實施例方式1、待用菌種的培養(yǎng)將豹斑毒鵝膏菌子實體接種至事先滅好菌的用上述斜面配 方配制的一只空白斜面上，在28°C培養(yǎng)30天后將斜面上的菌體刮入事先滅好菌的裝有適 量無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10分鐘，制成菌懸液。吸4ml該菌懸液于事先滅好 菌的含有較低濃度高產富硒雜交有色稻米發(fā)酵廢糟的一級搖瓶種子液體培養(yǎng)基中(裝液 量150mL/500mL)，在28°C，轉速IlOrpm下培養(yǎng)30天得一級搖瓶種子；無菌條件下，將培養(yǎng) 好的一級搖瓶種子一瓶倒入事先滅好菌的用上述二級搖瓶種子配方配制的含有較低濃度 高產富硒雜交有色稻米發(fā)酵廢糟的液體培養(yǎng)基中(裝液量400mL/1000mL)，在28°C，轉速 IlOrpm下培養(yǎng)7_14天，長好后將兩瓶種子液合并即成待用菌種。2、一級液體種子培養(yǎng)按上述一級液體種子培養(yǎng)基配方，配制比一級搖瓶種子液 體培養(yǎng)基中高產富硒雜交有色稻米發(fā)酵廢糟濃度高一倍的一級液體種子培養(yǎng)基，在0. IMpa 下滅菌30分鐘冷卻后接入搖瓶種子。按上述一級液體種子培養(yǎng)參數培養(yǎng)。采用50L全自 動發(fā)酵罐，裝液量為25-30L。3、二級液體種子培養(yǎng)按上述二級液體種子培養(yǎng)基配方，配制比二級搖瓶種子液 體培養(yǎng)基中高產富硒雜交有色稻米發(fā)酵廢糟濃度高一倍的二級液體種子培養(yǎng)基，在0. IMpa 下滅菌30分鐘冷卻后接入一級種子。按上述二級液體種子培養(yǎng)參數培養(yǎng)。采用500L全自 動發(fā)酵罐，裝液量為250-300L。4、深層液體發(fā)酵培養(yǎng)采用3000L發(fā)酵罐，裝液量為1800L。按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配 方，配制比二級液體種子培養(yǎng)基中高產富硒雜交有色稻米發(fā)酵廢糟濃度高一倍的深層液體 發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件滅菌后接入二級液體種子。按上述發(fā)酵罐的培養(yǎng)參數培養(yǎng)。所得菌 絲體干重為30. 6kg。5、殺病蟲活性粗提物提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎2_3h，過濾濃縮后，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌即得。 6、殺病蟲活性粗提物成分鑒定經GC-MS分析后， 殺病蟲活性粗提物成分主要包 括α -amanitin、毒蠅堿、鵝膏蕈氨酸和異鵝膏胺四種主要成分。
權利要求
一種利用富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏的方法，其特征是將豹斑毒鵝膏子實體接種至新鮮的固體斜面上進行培養(yǎng)，待斜面長好后接種至含較低濃度的富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟的液體培養(yǎng)基中進行種子的培養(yǎng)，即對菌種加以馴化；再接入添加了足量富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟的液體培養(yǎng)基中進行深層液體發(fā)酵培養(yǎng)；由于富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟中含有豐富的硒、鐵和鋅等微量元素以及豐富的C、N源，所以該混合發(fā)酵液中營養(yǎng)物質豐富，這樣既可提高該菌人工培養(yǎng)菌絲體產率，又充分消化和利用有色稻米加工副產物；發(fā)酵結束后，將菌絲體中殺病蟲活性成分進行粗提，以用于林木病蟲防治；步驟為1)待用菌種的培養(yǎng)出發(fā)菌株為豹斑毒鵝膏菌；①斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基配方以g/L計馬鈴薯200、瓊脂20、葡萄糖20、硫酸鎂2.0、磷酸二氫鉀3.0，富含微量元素有色稻米發(fā)酵廢糟2.5，pH為6；培養(yǎng)方法取豹斑毒鵝膏菌子實體中心部分接種于新鮮的斜面上，在28℃下培養(yǎng)30天左右；②500mL一級搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量150mL培養(yǎng)基配方以g/L計馬鈴薯200、葡萄糖20、硫酸鎂2.0、磷酸二氫鉀3.0、維生素B10.01，蛋白胨5，富含微量元素有色稻米發(fā)酵廢糟2.5，pH為6；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的斜面接種至事先滅菌的搖瓶中，在28±1℃下，轉速110rpm下培養(yǎng)30天；③1000mL二級搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量400mL培養(yǎng)基配方與一級搖瓶種子培養(yǎng)基配方相同；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的一級種子以10％的接種量接種至事先滅菌的搖瓶中，在28±1℃下，轉速110rpm下培養(yǎng)30天，即成待用菌種；2)50L一級液體種子培養(yǎng)，裝液量25-30L①一級液體種子培養(yǎng)基配方以g/L計葡萄糖10、麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁、酵母膏3.0、維生素B10.01、硫酸鎂2.0、磷酸二氫鉀3.0、富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟5，pH為6；②控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量5％-10％接入待用菌種，溫度28±1℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3，V/V，攪拌轉速100rpm；③轉罐標準發(fā)酵時間30-40天，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌；3)500L二級液體種子培養(yǎng)，裝液量250-300L①培養(yǎng)基配方與一級液體種子配方相同；②控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10％-15％接入一級種子，溫度28±1℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3，V/V，攪拌轉速100rpm；③轉罐標準發(fā)酵時間30-40天，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌；4)3000L深層液體發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量1800L①發(fā)酵培養(yǎng)基配方以g/L計葡萄糖5、麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁、酵母膏3.0、維生素B10.01、硫酸鎂2.0、磷酸二氫鉀3.0、富含微量元素的有色稻米發(fā)酵廢糟10，pH為6；②控制工藝在0.1Mpa下滅菌30分鐘，冷卻后按接種量10％-15％接入二級種子，溫度28±1℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3，V/V，攪拌轉速100rpm；③放罐標準發(fā)酵時間30-40天，菌絲球上浮二分之一，鏡檢有鎖狀聯合，菌絲球不能自溶；5)殺病蟲活性粗提物提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎2-3h，過濾濃縮后，用0.22μm濾膜過濾除菌即得；6)殺病蟲活性粗提物成分鑒定將所提出的粗提物用GC-MS分析其所含毒素成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及富含微量元素有色稻米發(fā)酵后的廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏的方法。豹斑毒鵝膏含有較多毒素，尤以毒蠅堿對蠅蟲具有顯著致死力，是一種很好的生物殺蟲劑，但豹斑毒鵝膏人工培養(yǎng)生長速度較慢，發(fā)酵菌絲體得率低。富含微量元素有色稻米通過微生物發(fā)酵加工成功能酒釀后會產生發(fā)酵廢糟，發(fā)酵廢糟中仍有較高含量的未被微生物轉化的微量元素以及豐富的C、N源，因此利用該發(fā)酵廢糟培養(yǎng)豹斑毒鵝膏既可提高菌絲體產率，又充分利用了有色稻米加工副產物。用該新型方法培養(yǎng)豹斑毒鵝膏菌后，粗提活性殺病蟲物質，以用于防治林木病蟲。本發(fā)明主要包括菌種的培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、深層液體發(fā)酵培養(yǎng)、有色稻米加工副產物利用、殺病蟲活性粗提物提取等。
文檔編號A01G1/04GK101861796SQ20101017603
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權日2010年5月18日
發(fā)明者曹玫, 朱建清, 楊志榮, 羅強, 聶遠洋, 趙建 申請人:四川大學