專利名稱：一種食線蟲真菌及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及一種食線蟲真菌及其制備法與應用。
背景技術：
植物寄生線蟲是一類重要的病原微生物，分布廣、種類多，全世界已報道的植物線 蟲有200多屬5000余種，給農林業(yè)生產造成嚴重為害(馮志新，2001)。據估計全球每年由 植物寄生線蟲所造成的作物損失達780億美元(Barker et al，1998)。就現今危害最為嚴 重的線蟲種類——根結線蟲來講，其有著廣泛的寄主，且為世界性分布，可給全球作物總產 量造成10%以上的損失(Whitehead，1998)。植物線蟲具有隱蔽性，多寄主性，頑固性，易傳播的特點，其種群增長迅速，給防治 上帶來了諸多的困難。自從20世紀40年代化學技術的革命后，化學殺蟲劑被廣泛用于農 林業(yè)生產，并在害蟲防治中占居重要地位。但由于人們長期過分依賴化學農藥，且缺乏生態(tài) 意識，造成了嚴重的環(huán)境污染。單殺線蟲劑而言，以往使用的多為高毒力化學農藥，這些藥 物對人畜不安全，對環(huán)境污染嚴重，并易使線蟲產生抗藥性，對有益生物殺傷力強。同時，隨 著人們環(huán)保意識的增強，對健康食品要求的日益增高，以往用于植物線蟲防治的高毒農藥 多以法律的形式給予禁用。因此，可以滿足以上諸多難題的生物防治方法在植物線蟲病害 的防治地位尤顯重要。鑒于此，人們將目光轉向了生物防治。食線蟲菌物是一類線蟲天敵，目前市場上成功上市的線蟲生防制劑均來源這類菌 物。其中，隔指孢菌是重要的類群。研究開發(fā)隔指孢菌具有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是彌補現有技術的不足，提供一株新的具有殺線蟲功能的食線蟲真 菌一海南隔指孢真菌。本發(fā)明的另一個目的是提供所述海南隔指孢真菌的制備方法。本發(fā)明還有一個目的是提供所述海南隔指孢真菌的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現提供一株食線蟲真菌，本申請人從感染根結線蟲的空心菜根際土樣中分離得 到的一株對線蟲具有很好毒殺作用的隔指孢屬新種，命名為海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)。菌株于2010年2月4日保存于中國湖北武昌珞珈山中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M2010042o所述海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)，(D. hainanensislg21_l)， 菌株形態(tài)特征為在PDA上生長菌絲稠密乳白色，氣生菌絲較多；當菌落生長數天后，中央 的氣生菌絲消失，并有大量的串生厚垣孢子生成。當在CMA培養(yǎng)基上生長，菌落近無色， 生長較緩慢，25°C暗培養(yǎng)lld，菌落可達6. 8cm ；周邊菌絲透明， 有隔，通常寬度在2. 5 4. 5 μ m。分生孢子棒狀，遠軸端鈍圓，長17. 7 40. 5(27. 7) μ m，寬4. 8 10. 1(7. 0) μ m，分 生孢子多數為孢子梗頂部單端生，少頂部多生，最多不超過4個，分生孢子梗無色，直立，有分隔，長146. 7 260. 6 μ m，基部寬2. 0 4. 0 μ m，端部約2. 0 μ m，端部少數頂部分枝。分 生孢子有0 4個隔，大多數1 3個分隔。老熟菌絲易生厚垣孢子，厚垣孢子近圓形，直徑 大小一般在7. 5 12. 5 (11. 3) μ m。菌株的捕食器官為黏性球，黏性球的柄長5 27. 5 μ m， 柄寬2. 3 3. 2 μ m，球部長5. 0 10. 0 μ m，寬4. 5 9. 0 μ m。多數黏性球的柄垂直伸出菌
絲生長。菌株lg21-l的分生孢子中無中間特大細胞，分生孢子梗直立，無色，通常單生，分 生孢子單生于孢子頂端，少多生，符合隔指孢屬特征，因此根據菌株采集地命名為海南隔指 包(Dactylella hainanensis lg21_l)。與海南隔指孢在形態(tài)上相似的種有弱捕隔指孢(D. asthenopaga)、D. querci和回 筍隔指孢(D. huisuniana)。和弱捕隔指孢相比，海南隔指孢在較老的菌絲上易生成串生的厚垣孢子，弱捕 隔指孢未觀察到厚垣孢子；海南隔指孢分生孢子稍小(海南隔指孢分生孢子長17. 7 40. 5 μ m，寬4. 8 10. 1 μ m ；弱捕隔指孢分生孢子長20 46 μ m，寬6. 5 9. 2 μ m)；分 生孢子梗稍長(海南隔指孢分生孢子梗長146. 7 260. 6 μ m ；弱捕隔指孢分生孢子梗長 100 200 μ m)；粘球柄稍長(海南隔指孢粘球柄長5 27. 5 μ m，弱捕隔指孢粘球柄長3 10 μ m)；分生孢子分隔數不同(海南隔指孢0 4個，弱捕隔指孢1 5個)。與D. querci相比，海南隔指孢在較老的菌絲上易生成串生的厚垣孢子，D. querci 無厚垣孢子；海南隔指孢粘球柄稍長(海南隔指孢粘球柄長5 27. 5 μ m，弱捕隔指孢粘 球柄長0 5.5 μ m)；分生孢子梗較長，(海南隔指孢分生孢子梗長146.7 260. 6μπι; D. querci分生孢子梗長130 180 μ m)；與回筍隔指孢相比，兩者分生孢子形態(tài)與大小均有所不同(海南隔指孢分生孢子 較為短粗，多為棍棒狀，大小為25 52. 5 X 4 6 μ m ；回筍隔指孢分生孢子狹長，多呈紡錘 形，大小為17. 7 40. 5X4. 8 10. Iym)；回筍隔指孢產孢細胞合軸多育，呈燭臺狀，而海 南隔指孢無。進一步對海南隔指孢進行分子鑒定，擴增靶標序列為ITS區(qū)，ITS序列如表SEQ ID N0:1所示。所述基因的獲得包括以下步驟(1)基因組DNA的提取(a)用解剖刀刮取PDA平板上25°C培養(yǎng)IOd的菌絲在液氮中研磨成粉狀；將菌絲 粉迅速放入1. 5mL的液氮預冷離心管中，每管0. 3g ；(b)用 500yL DNA 抽提緩沖液懸浮(IOOmM Tris-HCl, 750mM NaCl, 40Mm EDTA)， 并加入50 μ L 20% SDS輕輕混合，37°C處理Ihr ；(c)加入 75 μ L 的 5Μ NaCl 禾口 65 μ L CTAB 溶液(0. 75Μ NaCl 含 10% CTAB)，65°C 水浴20min ；(d)加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25 24 1)抽提，5000g離心lOmin，取上 清；(e)重復步驟d ；(f)力卩 2 μ L RNase (10mg/mL) 37°C處理 30min ；(g)加入等體積的異丙醇混勻，5000g，離心IOmin沉淀DNA ；(h)用0. 5mL 70%的酒精洗劑沉淀，離心2min，到掉酒精，風干；
(i)力口 30 μ L TEdOmM Tris-HCl, IMm EDTA, ρΗ8· 0)重新懸浮 DNA ；(j)每個樣取2 μ L，Marker2000取5 μ L，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。(2) ITS 區(qū)的 PCR 擴增以菌株的基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITSl和ITS4擴增ITS區(qū)的片段。ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘；ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘；反應體系模板lyL;10x緩沖液 2. 5yL;4x dNTP 0. 5yL;引物 ITSl IyL;引物 ITS4 1 μ L ；酶0. 25 μ L ；水18. 75 μ L。以不加模板為陰性對照。反應程序94"C 5min ；94 "C 30sec — 55 "C 30sec — 72 "C lmin, 35 個循環(huán)； 720C 2min ；4°C ⑴。PCR產物切膠回收，連接到PMD-18T載體，最后轉化克隆送交上海英駿生物技術有 限公司測序。(3)序列分析序列分析的結果通過國際互聯網進行序列同源性檢索，檢索主程序采用BLASTN， 即核酸序列對核酸序列數據庫的檢索，序列分析采用DNA Star軟件進行。比對結果發(fā)現海南隔指孢與3個近似種，即弱捕隔指孢、D. querci和回筍隔指孢 的相似性分別為77. 9%、82%和84. 7%，進一步證明該新種與這3個近似種為不同種。本發(fā)明同時提供了所述海南隔指孢(Dactylella hainanensislg21-l)菌的制備 方法，包括試管種培養(yǎng)、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方法。所述試管種培養(yǎng)基配方為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA) :200g馬鈴薯，20g葡萄糖，20g 瓊脂粉，IOOOml水；方法為將Dactylella hainanensislg21_l菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基斜 面上，20 30°C下培養(yǎng)6 12天，得到試管種。所述液體培養(yǎng)基可采用LMZ培養(yǎng)液，配方為每1升磷酸緩沖液中含2g明膠、8g胰 蛋白胨、Ig 酵母浸出粉、0. 5g(NH4)2SO4^O. OlgFeSO4 · 7Η20、0· 5gMgS04 · 7H20，所述磷酸緩沖 液組成為 11. 28gNa2HP04 · 12Η20/10· 687g NaH2PO4 · 2H20, pH 6· 5?；蛘卟捎肔MZ+B. χ培養(yǎng)液，配方為加入松材線蟲的LMZ培養(yǎng)液。液體培養(yǎng)方法是每個250mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)液，濕熱滅菌后，冷卻。接活化的 海南隔指孢菌圓片，每瓶5片。在180轉/min 28士2°C情況下，暗培養(yǎng)8d，中性中速濾紙無 菌過濾，濾液保存于4°C冰箱中待用。所述固體培養(yǎng)基CMA配方為20g玉米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水。培養(yǎng)方法是每個 90mm的培養(yǎng)皿中倒入約1/3厚的培養(yǎng)基，接種D. hainanensis后，用封口膜封口后于25°C 下培養(yǎng)6 12天。本發(fā)明對海南隔指孢(D. hainanensis lg21_l)菌進行了殺線蟲藥效試驗，確定其 對線蟲的作用，可應用于制備植物寄生線蟲生防制劑。海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌應用于制備植物寄生線蟲生防 制劑方面時，優(yōu)選利用其幼嫩孢子，優(yōu)選的劑量范圍是8 X IO5 1. 6 X IO6個孢子/kg 土壤。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一株新的海南隔指孢(Dactylella hainanenSiSlg21-l)菌，具有良好的殺線蟲活性，可應用于制備殺線蟲活性制劑。本發(fā)明提供了海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌的多種培養(yǎng)方法及應用，為生物防治生物防治線蟲提供重要的技術基礎。


圖1海南隔指孢液體培養(yǎng)液對松材線蟲的擊倒作用情況圖2海南隔指孢孢子萌發(fā)黏附于根結線蟲卵的情況圖3海南隔指孢施菌量對南方根結線蟲的效果的情況(根結級數)圖4海南隔指孢施菌量對南方根結線蟲的效果的情況(防治效果)圖5不同處理組對南方根結線蟲在作物番茄上的防效情況圖6海南隔指孢不同施菌量對番茄伸長生長的影響的情況圖7海南隔指孢不同施菌量對番茄生物量的影響
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。實施例1海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA) :200g馬鈴薯，20g葡萄糖，20g瓊脂粉， IOOOml /K。將Dactylella hainanensis lg21_l 菌絲體接種到 PDA 培養(yǎng)基斜面上，20 30°C 下培養(yǎng)6 12天，得到試管種。實施例21g21_l菌的固體培養(yǎng)將海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌保存菌接種到CMA培養(yǎng)基 (組成20g玉米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水)進行活化，然后接種到YMA培養(yǎng)基(組成2g 酵母浸出粉，20g麥芽糖，1000ml水)上(直徑75mm培養(yǎng)皿)，25°C下暗培養(yǎng)16d。將菌保 存于4°C冰箱中待用，或直接配備孢子培養(yǎng)液使用。實施例31g21_l菌的固體培養(yǎng)將海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌保存菌接種到CMA(組成 20g玉米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水)培養(yǎng)基進行活化，然后接種到以下配方的培養(yǎng)基lg KH2PO4，0.5g MgSO4,0. 5g NaCl，0. 05gZnS04，0. 05g FeSO4,15g 瓊脂粉，20g 葡萄糖，加入 1000ml超純水，調pH值至6. 5 7. 0。其他同實施例2。實施例41g21_l菌的固體培養(yǎng)將海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌保存菌接種到CMA(20g玉 米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水)培養(yǎng)基進行活化，然后接種到以下配方的培養(yǎng)基lg KH2PO4, 0. 5g MgSO4,0. 5g NaCl，0.05g ZnSO4,0. 05g FeSO4,15g瓊脂粉，4g酵母浸出粉，加入 1000ml 超純水，調pH值至6. 5 7. 0。其他同實施例2。實施例51g21_l菌的液體培養(yǎng)選用LMZ液(Zhao et al，2004)或LMZ+B. χ作為培養(yǎng)液，每個250mL三角瓶裝50mL 培養(yǎng)液，濕熱滅菌后，冷卻。接活化的海南隔指孢菌圓片，每瓶5片。在180轉/min 28 士 2°C 情況下，暗培養(yǎng)8d，中性中速濾紙無菌過濾，濾液保存于4°C冰箱中待用。
LMZ液配方為每一升磷酸緩沖液中含2g明膠，8g胰蛋白胨，lg酵母 浸出粉，0. 5g(NH4)2S04，0. Olg FeS04 7H20，0. 5g MgS04 7H20，磷酸緩沖液為 11. 28gNa2HP04 12H20/10. 687g NaH2P04 2H20, pH 6. 5 ；LMZ+B. x 培養(yǎng)液配方為加入約 1000 條松材線蟲的LMZ培養(yǎng)液。所述松材線蟲來源于農業(yè)部批準設立的線蟲學和殺線活性物研 究機構一華南農業(yè)大學植物線蟲研究室，也可以采用本領域實驗室常規(guī)實驗使用的松材線 蟲。實施例61g21_l菌的液體培養(yǎng)選用LMZ+B.x作為培養(yǎng)液，每個250mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)液，濕熱滅菌后，冷卻。 接活化的海南隔指孢菌圓片，每瓶5片。在180轉/min28士2°C情況下，暗培養(yǎng)8d，中性中 速濾紙無菌過濾，濾液保存于4°C冰箱中待用。LMZ+B. x液配方為加入約1000條松材線蟲的LMZ培養(yǎng)液。實施例7海南隔指孢(D.hainanensis Y. Z. Li et J. L. Liao, sp. nov.) lg21_l 殺線蟲活性 試驗1、制備試驗用線蟲(1)將全齒復活線蟲(Pnanagrellus redivivus)(來自中國科學院微生物研究 所，也可以采用本領域實驗室使用的同類線蟲)接種于燕麥片培養(yǎng)基(組成10g燕麥片， 30ml水)上，25°C下培養(yǎng)6天左右，置于4°C冰箱備用。使用前將所需線蟲用貝曼漏斗法洗 出，置于5ml離心管內加入無菌水，瞬時離心，棄上清，重復3次得到潔凈供試線蟲。(2)制備豐公材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在倒入1/3厚PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接入擬盤多毛孢(Pestalotiopsis sp.)(華 南農業(yè)大學植物線蟲研究室保存)，25°C培養(yǎng)4 7天。待菌絲鋪滿培養(yǎng)皿后，接種松材線 蟲，25°C培養(yǎng)5 8天。用無菌水將線蟲沖洗，制成含量為2條/ yl的線蟲懸浮液。(3)制備根結線蟲取爪哇根結線蟲(采自云南昆明，單卵塊純化后保存于華南農業(yè)大學植物線蟲研 究室)的單卵塊接種至預先在消毒土壤中培育2周的感病番茄或馬鈴薯植株上，約45d后， 將根拔起用自來水洗凈，于解剖鏡下挑取根上卵塊，將其放在雙層網篩(鐵絲網和濾紙) 上，網篩浸于加有滅菌水的滅菌培養(yǎng)皿內，25°C孵化3天收集已孵化的二齡蟲。2、試驗方法(1)對 P. redivivus 生測試驗參照實施例2、3或4，將在PDA斜面上保存的菌株在CMA平板上活化7d后，用直徑 9mm的打孔器打取菌圓片接種到直徑75mm的CMA平板上，25°C暗培養(yǎng)7天，每皿加入無菌 水配制的P. redivivus蟲液250 y L (約500條)，用玻璃三角棒推平，25°C暗培養(yǎng)30hr，在 10x立式解剖鏡下隨機選取10個區(qū)域(所選區(qū)域隨機均勻分布，總面積占培養(yǎng)皿總面積的 1/5)，記錄已捕食和未捕食的線蟲數。計算線蟲捕捉率和平均值，數據處理同上。捕捉率公 式如下
<formula>formula see original document page 7</formula>
蟲液密度的確定取收集的活躍線蟲P.redivivus，于玻璃廣口瓶中，吸取10ul顯 微鏡下觀察，計數三次。計算蟲的實際數量密度后，測量實際總體積數，再用滅菌水進行稀 釋至2000條/mL。將計數稀釋后的各皿封起，放回25°C暗培養(yǎng)，至加蟲起計算達3天時，取出在 10XlOx顯微鏡下觀察計數捕食器的數量。每皿隨機選取10個視野，記錄總和。三個重復 求平均。(2)液體培養(yǎng)濾液對松材線蟲的作用效果選用LMZ液(Zhao et al，2004)或LMZ+B. x作為培養(yǎng)液，每個250mL三角瓶裝50mL 培養(yǎng)液，濕熱滅菌后，冷卻(參照實施例5或6)。接活化的海南隔指孢菌圓片(同前述生測 試驗)，每瓶5片。在180轉/!^11、28士21條件下，暗培養(yǎng)8d，中性中速濾紙無菌過濾，取濾 液處理松材線蟲，選用24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加濾液450 u L，加松材線蟲液50 y L (約100 條)，每個處理三個重復。25°C、無光條件下處理18hr，在4X10x顯微鏡下記錄靜止和活動 的線蟲數。清水稀釋測試線蟲混合液恢復2hr并用針刺線蟲，檢驗線蟲的死活。<formula>formula see original document page 8</formula>(3)孢子對根結線蟲卵作用的觀察用滅菌水將預先用PDA平板培養(yǎng)的海南隔指孢的孢子洗下，濃度約4000個孢子/ mL,向24孔板中每孔加450 u L，加爪哇根結線蟲卵50 u L，約100粒。25°C暗培養(yǎng)48h觀察， 并將卵吸入載玻片上，蓋片拍照。(4)對南方根結線蟲的盆栽試驗將活化的菌株接種到YMA培養(yǎng)基(組成2g酵母浸出粉，20g麥芽糖，1000ml水) 上(直徑75mm培養(yǎng)皿)，25°C、暗培養(yǎng)16d，用于土壤處理菌種，處理土壤前，先計數每皿的 孢子數。孢子的計數方法為每個菌株取三皿，各加入含有0. 吐溫80無菌水8mL，用玻 璃棒輕輕推動，使孢子脫離菌絲。將孢子懸浮液懸浮均勻，取2 y L用血球計數板在lOXlOx 顯微鏡下計數，每個皿計數3次。三個皿計數的平均值乘以4000既為每個皿的實際孢子量。番茄苗的培養(yǎng)播種前，先將番茄種子用50 55°C水浴30min，以鈍化種子攜帶的 病毒，靜置浸泡8hr ；浸種后將種子略晾一下，用濕布包好，室溫下催芽。催芽期間每天用清 水淘洗1次，防止發(fā)霉。種子發(fā)芽后，先將育苗土澆足水，將土層上表面整平，將發(fā)芽的種子 均勻散布于上，播后覆土 1 1. 5cm。育苗土為基質土(組成菜園土 有機肥碧糠灰= 5 2 3)經 121°C 滅菌 2hr。土壤的處理病土取自廣州市良田鎮(zhèn)大田土壤，6個處理，混合均勻裝盆。以滅菌 土、病土和阿維菌素(0. 05g阿維菌素/kg 土壤)分別為陰性、陽性和藥劑對照，4X105個孢 子/kg 土壤，8 X 105個孢子/kg 土壤和1. 6 X 106個孢子/kg 土壤三個濃度處理。菌株對番茄根結線蟲的防治效果將接種線蟲6周的番茄扣盆將根部土輕輕去除，用自來水洗凈，觀察根上根結發(fā) 生情況，并依照以下記載標準記錄線蟲侵染級別。根結線蟲危害的記載標準(參照方中達《植病研究方法》)




100%
感染級別癥狀描述
0無根結
1有少數根結
2大部分根上有根結
3有大量根結，少數根結聯合膨大
4有大量根結，許多根結連結在一起膨大 根據下面公式計算根結指數和防治效果.
II
數
匕曰
結 根
防效(％)=
E (各級植株數X級值) (調查總株數X 4)
對照指數一處理指數
X100
x100
對照指數
菌量對番茄伸長生長的影響 將處理的番茄植株，用毫米刻度尺測量株高和根長。 株高從番茄最上生側根的點到心葉尖的距離； 根長從番茄最上生側根的點到最長根尖的距離。
對每個處理的株高和根長用應用DPS中Duncan新復極差法進行數據分析。 菌量對番茄生物量的影響
將處理的番茄植株，用電子天平稱量地上重和地下重。 地上重從番茄最上生側根的點，將其切斷，上面部分的重量； 地下重從番茄最上生側根的點，將其切斷，下面部分的重量； 4、試驗結果
(1)對P. redivivus生測試驗
將菌株在CMA25°C暗培養(yǎng)7天，接種P. redivivus 24小時，菌株對其撲捉率達
(2)液體培養(yǎng)液對線蟲的作用
用LMZ等培養(yǎng)液培養(yǎng)的海南隔指孢的濾液對線蟲的效果顯示，LMZ中菌的培養(yǎng)濾 液對線蟲的作用效果和培養(yǎng)液的對照沒有明顯區(qū)別，在培養(yǎng)液成分中加有松材線蟲的菌的 培養(yǎng)濾液對松材線蟲的擊倒率明顯高于培養(yǎng)液對照和不加線蟲的海南隔指孢的培養(yǎng)濾液， 見附圖1所示。說明松材線蟲對菌株產生擊倒線蟲的物質有一定的誘導作用。附圖1中1 為LMZ空白對照(ck)培養(yǎng)液；2為海南隔指孢菌LMZ培養(yǎng)液培養(yǎng)濾液；3為海南隔指孢菌 LMZ+B. x培養(yǎng)液培養(yǎng)濾液；相同的字母表示在P < 0. 05時，差異不顯著，誤差線為S. E.；縱 坐標為線蟲擊倒率(％ )。(3)孢子萌發(fā)菌絲對根結線蟲卵作用的觀察海南隔指孢的孢子對爪哇根結線蟲卵作用的觀察試驗顯示；孢子萌發(fā)產生的菌絲 可以黏附于卵的體表，用挑針可以將菌絲和卵一起挑出，但顯微鏡下沒有觀察到明顯侵入 現象。說明該菌對根結線蟲卵沒有寄生作用，見附圖2。(4)對南方根結線蟲防效的盆栽試驗(a)海南隔指孢的不同施菌量對南方根結線蟲的防效試驗結果表明，施入土壤的
9菌量明顯影響菌株對線蟲的防治效果，在試驗范圍內，施菌量越多防效越好。施菌和藥劑的 處理組的番茄的平均根結級數明顯下降，在施入不同菌量的處理組中可以明顯的看到，它 們的平均根結級數呈梯度下降，見附圖3、附圖4和附圖5。
附圖3和附圖4中，a根結級數；b防治效果；CK1滅菌土壤；CK2病土 ；A 4X 105個 孢子/kg;B 8X105個孢子/kg ;C 1.6X106個孢子/kg ;G阿維菌素；相同的字母表示在P < 0.01時，差異不顯著，誤差線為S.D.，n = 15。附圖5明顯的顯示出不同處理組對南方根結線蟲在作物番茄上的防效，1.6X106 個孢子/kg 土壤處理組的防效達58. 9%，與肯邦線尊的藥劑處理組差別不到10%。附圖5中CK1滅菌土壤；CK2病土；A 4X 105個孢子/kg ;B 8X 105個孢子/kg ;C 1.6X106個孢子/kg ；G阿維菌素；相同的字母表示在P < 0. 05時，差異不顯著，誤差線為 S. D. , n = 15。(b)對番茄伸長生長的影響不同的施菌量對番茄伸長生長的影響試驗結果顯示，加入不同菌量的各處理組之 間在根長和株高上沒有顯著差異，與病土對照組相比有顯著差異，明顯好于病土對照組，但 與滅菌土對照組相比，又明顯差與滅菌土對照組；而與藥劑處理組相比顯示，株高低于藥劑 處理組，而根長大于藥劑處理組，見附圖6。附圖6中CK1滅菌土壤；CK2病土；A 4X 105個孢子/kg ;B 8X 105個孢子/kg ;C 1.6X106個孢子/kg ；G阿維菌素；相同的字母表示在P < 0. 05時，差異不顯著，誤差線為 S. D. , n = 15。(c)各個處理番茄生物量的影響不同的施菌量對番茄生物量的影響試驗結果顯示，加入菌量不同的各處理組之間 在生物量上顯示出一定的差異。在地上重上看，4X 105個孢子/kg 土壤和8X 105個孢子/ kg 土壤處理組之間無顯著差異，1.6X106個孢子/kg 土壤處理組和4X 105個孢子/kg 土 壤、8 X 105個孢子/kg 土壤處理組有差異，1. 6 X 106個孢子/kg 土壤處理組地上部重于其他 兩組，說明菌株對線蟲侵染的抑制一定程度上促進了植物的生長。在地下重上看，8X105個 孢子/kg 土壤和1. 6X 106個孢子/kg 土壤處理組組間無差異，而4X 105個孢子/kg 土壤處 理組與8 X 105個孢子/kg 土壤、1. 6 X 106個孢子/kg 土壤處理組有差異，4 X 105個孢子/kg 土壤組地下重重于其他兩組，是因為根結數多且大于其他兩組的結果。不同菌量各處理組與病土對照組相比有差異，比病土對照要好；但與滅菌土對照 組相比，又明顯差與滅菌土對照組。從地上重來看，1.6X106個孢子/kg 土壤處理組明顯重 于病土對照組，而輕于滅菌土對照組。從地下重來看，8 X105個孢子/kg 土壤和1. 6X106個 孢子/kg 土壤處理組與病土對照無區(qū)別(這與病土組的根結膨大的重量彌補其被阻止的伸 展重量有一定關系)，但與滅菌土對照組比，顯著低于對照。不同菌量的各處理組與藥劑處 理組相比，生物量都低于藥劑處理組，見附圖7。附圖7中，相鄰的兩個方柱，左邊的為地上 重，右邊的為地下重。附圖7中CK1為滅菌土壤；CK2為病土；A 4X 105個孢子/kg ;B8X 105個孢子/kg C 1.6X106個孢子/kg ；G阿維菌素；相同的字母表示在P < 0. 05時，差異不顯著，誤差線 為 S. D. n = 15。試驗結果表明，海南隔指孢對卵沒有寄生作用，對線蟲的作用主要是通過捕捉運動的線蟲而實現的。海南隔指孢對線蟲的作用方式顯示，不同活性的菌絲對線蟲捕捉能力 是不同的，活力強的幼嫩菌絲(加入靶標線蟲后生長3d的菌絲)對線蟲的捕捉能力強。海 南隔指孢產生的孢子萌發(fā)并產生黏性球，可以直接黏著于線蟲體上，見附圖2，侵入其體內， 以線蟲為營養(yǎng)進行生長繁殖，黏著于線蟲體壁的孢子不能立刻使線蟲致死，可以跟隨線蟲 的運動而帶到新的地方，被動地得到了傳播，增加了菌絲侵染新的寄主的機會。因此，使用 海南隔指孢的大量的孢子進行植物線蟲防治是一種更為有效的方法。
施入不同的菌量對番茄根結線蟲病的防效試驗顯示，增加菌量可以明顯降低南方 根結線蟲在寄主作物上的發(fā)病指數，且對作物沒有明顯的負面效果，表明海南隔指孢作為 生防物的可應用和開發(fā)潛力巨大。
權利要求
一種食線蟲真菌(Dactylella hainanensis lg21-1)，于2010年2月4日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM 2010042。
2.一種權利要求1所述食線蟲真菌的制備方法，其特征在于是將所述真菌菌絲體接種 到PDA培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到；所述PDA培養(yǎng)基為200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂粉和 1000ml
3.—種權利要求1所述食線蟲真菌的制備方法，其特征在于是將所述真菌圓片接種于 液體培養(yǎng)液培養(yǎng)暗培養(yǎng)后過濾得濾液待用；所述液體培養(yǎng)液為LMZ培養(yǎng)液或LMZ+B. x培養(yǎng) 液；所述LMZ培養(yǎng)液配方為每一升磷酸緩沖液中含2g明膠，8g胰蛋白胨，lg酵 母浸出 ijSO. 5g(NH4)2S04,0. 01gFeS04 7H20,0. 5gMgS04 7H20,磷酸緩沖液為 11. 28gNa2HP04 12H20/10. 687g NaH2P04 2H20，pH 6. 5 ；所述 LMZ+B. x 培養(yǎng)液配方為加入松 材線蟲的LMZ培養(yǎng)液。
4.一種權利要求1所述食線蟲真菌的制備方法，其特征在于是將所述真菌接種于固體 培養(yǎng)基CMA培養(yǎng)得到，所述固體培養(yǎng)基CMA配方為20g玉米粉，15g瓊脂粉，1000ml水。
5.一種權利要求1所述食線蟲真菌的應用，其特征在于應用于制備植物寄生線蟲生防 制劑。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于采用所述真菌的幼嫩孢子制備植物寄生線 蟲生防制劑。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于所述真菌應用于制備植物寄生線蟲生 防制劑的劑量范圍是8xl05 1. 6xl06個孢子/kg 土壤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食線蟲真菌及其制備方法與應用。所述食線蟲真菌為隔指孢屬新種的海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21-1)，于2010年2月4日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM 2010042。本發(fā)明提供了所述食線蟲真菌的制備方法，包括試管種培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法或固體培養(yǎng)法。本發(fā)明菌株對線蟲具有毒力高的突出優(yōu)點，可應用于制備植物寄生線蟲生防制劑，具有較好的應用前景。
文檔編號A01P5/00GK101831388SQ20101018118
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權日2010年5月18日
發(fā)明者卓侃, 廖金鈴, 李玉中, 羅梅 申請人:華南農業(yè)大學