專利名稱：一種非程序細(xì)胞凍存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞凍存液，特別涉及一種非程序細(xì)胞凍存液。
背景技術(shù)：
細(xì)胞，特別是干細(xì)胞等高價值的細(xì)胞，具有潛在的醫(yī)用價值等其他價值，細(xì)胞保存 技術(shù)是實現(xiàn)這些價值的基礎(chǔ)。常用的細(xì)胞保存方法有培養(yǎng)保存和凍存。培養(yǎng)保存，耗時耗力，程序繁瑣，在培養(yǎng) 的過程中，特別是長期繼代培養(yǎng)時，細(xì)胞容易發(fā)生變異，細(xì)胞特性喪失，失去保存價值。因 此，培養(yǎng)保存一般應(yīng)用于易于培養(yǎng)，不易發(fā)生變異的細(xì)胞中，如部分瘤細(xì)胞。細(xì)胞凍存即將細(xì)胞置于低溫環(huán)境下保存，以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)，保存其細(xì) 胞特性。這樣保存的成本較低，可以在需要時將細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)。與些同時，也避免了培養(yǎng)保 存中因細(xì)胞污染而導(dǎo)致的細(xì)胞品種損失?，F(xiàn)有的細(xì)胞凍存液，主要由DMS0、血清以及細(xì)胞培養(yǎng)液組成，細(xì)胞培養(yǎng)液一般作為 溶劑。這種凍存液一般為即用型凍存液，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，批次差異大，保持期短，保存效果不穩(wěn)定。此外，現(xiàn)有凍存液的凍存程序復(fù)雜，需要使用昂貴的專用凍存儀器進(jìn)行程序性降 溫，整個凍存過程耗時長達(dá)3 4小時，以保證凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率。這種凍存操作復(fù)雜、處 理量小，凍存成本較高，不能滿足大規(guī)模細(xì)胞快速凍存的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的細(xì)胞凍存液。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種非程序細(xì)胞凍存液，含有細(xì)胞膜保護(hù)劑1. 0 28w/v%、滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù) 劑1. 0 18w/v%、細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑3. 0 28%，余量為溶劑。優(yōu)選的，凍存液中還添加有0. 1 0. 7w/v%的抗氧化劑。優(yōu)選的，凍存液中還添加有0. 2 1. 07w/v%的細(xì)胞營養(yǎng)劑。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，對細(xì)胞保護(hù)效果好，添加凍存液后，可直接將細(xì)胞放 入-80°C冰箱凍存，無需復(fù)雜的程序凍存，大大縮短的細(xì)胞凍存時間，提高了凍存效率，極為 適用于大量細(xì)胞的凍存。凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇率高，復(fù)蘇后細(xì)胞的生長和分化正常。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，成分穩(wěn)定，保質(zhì)期長。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，無需另行配制或稀釋，批次間穩(wěn)定性好。


圖1是SD大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs復(fù)蘇后的生長曲線圖；圖2是未誘導(dǎo)的SD大鼠MSCs細(xì)胞圖；圖3是本發(fā)明細(xì)胞凍存液凍存的SD大鼠MSCs復(fù)蘇后，成骨誘導(dǎo)28d的細(xì)胞圖4是常規(guī)細(xì)胞凍存液程序凍存的SD大鼠MSCs復(fù)蘇后，成骨誘導(dǎo)28d的細(xì)胞圖；圖5是常規(guī)細(xì)胞凍存液非程序凍存的SD大鼠MSCs復(fù)蘇后，成骨誘導(dǎo)28d的細(xì)胞 圖；圖6是本發(fā)明細(xì)胞凍存液凍存的SD大鼠MSCs復(fù)蘇后，成脂誘導(dǎo)20d的細(xì)胞圖；圖7是常規(guī)細(xì)胞凍存液程序凍存的SD大鼠MSCs復(fù)蘇后，成脂誘導(dǎo)20d的細(xì)胞圖；圖8是常規(guī)細(xì)胞凍存液非程序凍存的SD大鼠MSCs復(fù)蘇后，成脂誘導(dǎo)20d的細(xì)胞 圖。
具體實施例方式本發(fā)明中使用的細(xì)胞膜保護(hù)劑、滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑、細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑，既可以 單獨使用，也有可以根據(jù)需要混合使用。本發(fā)明細(xì)胞凍存液中使用的溶劑，可為各種適用于細(xì)胞培養(yǎng)的溶劑，一般為血清， 特別是新生牛血清。本發(fā)明細(xì)胞凍存液中使用的滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑，包括二甲基亞砜(DMSO)、丙
二醇、丙三醇等。本發(fā)明細(xì)胞凍存液中使用的細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑，包括甲基纖維素、羥乙基淀粉、糊 精、可溶性淀粉，用以防止或延緩細(xì)胞在凍存過程中的沉降，防止細(xì)胞互相擠壓，影響細(xì)胞 凍存效果。本發(fā)明細(xì)胞凍存液中使用的抗氧化劑，為常規(guī)的抗氧化劑，包括維生素C、谷胱甘 肽等，抗氧化劑既可以單獨使用，也可以混用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇其他的 抗氧化劑。本發(fā)明細(xì)胞凍存液中使用的細(xì)胞營養(yǎng)劑，為常規(guī)的細(xì)胞營養(yǎng)劑，包括谷氨酰胺、丙 酮酸鈉等，用以補充細(xì)胞代謝時消耗的部分能量。細(xì)胞營養(yǎng)劑既可以單獨使用，也可以混 用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇其他的細(xì)胞營養(yǎng)劑。一種非程序細(xì)胞凍存液，含有細(xì)胞膜保護(hù)劑1. 0 28w/v%、滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù) 劑1. 0 18w/v%、細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑3. 0 28%，余量為溶劑。優(yōu)選的，凍存液中還添加有0. 1 0. 7w/v%的抗氧化劑。優(yōu)選的，凍存液中還添加有0. 2 1. 0 八％的細(xì)胞營養(yǎng)劑。細(xì)胞膜保護(hù)劑包括非還原性雙糖、多糖、糖酐。其中，非還原性雙糖包括海藻糖、 蔗糖；多糖包括棉子糖、木糖、潘糖；糖酐包括低分子糖酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖 酐-500。細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑包括甲基纖維素、羥乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑包括DMS0、丙二醇、丙三醇抗氧化劑包括維生素C、谷胱甘肽。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。以下實施例中，如無特別說明，百分比均指。實施例1細(xì)胞凍存液的組成如下細(xì)胞膜保護(hù)劑1%，由0. 4%的棉子糖、0. 6%的中分子糖酐-70組成，
4
滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑5 %，由DMSO組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑15%，由甲基纖維素500CP組成，抗氧化劑0. 2%，由0. 03%的維生素C、0. 17%的谷胱甘肽組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑0. 3%，由0. 2%的谷氨酰胺、0. 的丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例2細(xì)胞凍存液的組成如下細(xì)胞膜保護(hù)劑7%，由海藻糖組成，滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑9%，由6%的丙二醇、3%的丙三醇組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑28%，由20%的甲基纖維素400CP、8%的糊精組成，抗氧化劑0.4%，由維生素C組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑1. 0%，由0. 7%的谷氨酰胺、0. 3%的丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例3細(xì)胞凍存液的組成如下細(xì)胞膜保護(hù)劑28%，由10%的蔗糖、14%的潘糖、4%的低分子糖酐-40組成，滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑1%，由丙二醇組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑9%，由羥乙基淀粉組成，抗氧化劑0. 1 %，由谷胱甘肽組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑0. 2%，由丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例4細(xì)胞凍存液的組成如下細(xì)胞膜保護(hù)劑21%，由17%的木糖、4%的高分子糖酐-500組成，滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑12%，由丙二醇、丙三醇各半組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑14%，由5%的甲基纖維素1500CP、9%的可溶性淀粉組成，抗氧化劑0. 7%，由0. 2%的維生素C、0. 5%的谷胱甘肽組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑0. 8%，由谷氨酰胺、丙酮酸鈉各半組成，新生牛血清，余量。實施例5細(xì)胞凍存液的組成如下細(xì)胞膜保護(hù)劑11%，由7%的海藻糖、4%的棉子糖組成，滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑18%，由2%的DMS0、16%的丙二醇組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑14%，由8%的羥乙基淀粉、6%的糊精組成，抗氧化劑0.7%，由維生素C組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑0.5%，由0.4%的谷氨酰胺、0. 的丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例6細(xì)胞凍存液的組成如下
細(xì)胞膜保護(hù)劑17%，由5%的棉子糖、12%的木糖組成，滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑15%，由DMS0、丙二醇、丙三醇各5%組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑18%，由12%的甲基纖維素、6%的可溶性淀粉組成，抗氧化劑0.5%，由維生素C組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑0. 7%，由丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例7細(xì)胞凍存液的組成如下細(xì)胞膜保護(hù)劑23%，由7%海藻糖、12%的低分子糖酐_40、5%的木糖組成，滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑11 %，由DMSO組成，細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑3%，由甲基纖維素4000CP組成，抗氧化劑0. 5%，由谷胱甘肽組成，細(xì)胞營養(yǎng)劑0.5%，由0. 谷氨酰胺、0.4%丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。使用不同配比細(xì)胞膜保護(hù)劑的細(xì)胞凍存液，非程序性凍存SD大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞 MSCs，檢測其復(fù)蘇率，結(jié)果如表1所示。表1、細(xì)胞膜保護(hù)劑配比_細(xì)胞復(fù)蘇率比較表
權(quán)利要求
一種非程序細(xì)胞凍存液，含有細(xì)胞膜保護(hù)劑1.0～28w/v％、滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑1.0～18w/v％、細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑3.0～28w/v％，余量為溶劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于所述凍存液中還添加 有0. 1 0. 7w/v%的抗氧化劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于所述凍存液中還添加 有細(xì)胞營養(yǎng)劑0.2 1.0w/v%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于細(xì)胞膜保護(hù)劑包括非 還原性雙糖、多糖、糖酐。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于非還原性雙糖包括海 藻糖、蔗糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于多糖包括棉子糖、木糖、潘糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于糖酐包括低分子糖 酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖酐-500。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑包括 甲基纖維素、羥乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù) 劑包括二甲基亞砜(DMS0)、丙二醇、丙三醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種非程序細(xì)胞凍存液，其特征在于抗氧化劑包括維生素 C、谷胱甘肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非程序細(xì)胞凍存液，含有細(xì)胞膜保護(hù)劑1.0～28w/v％、滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑1.0～18w/v％、細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑3.0～28％，余量為溶劑。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，對細(xì)胞保護(hù)效果好，添加凍存液后，可直接將細(xì)胞放入-80℃冰箱凍存，無需復(fù)雜的程序凍存，大大縮短的細(xì)胞凍存時間，提高了凍存效率，極為適用于大量細(xì)胞的凍存。凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇率高，復(fù)蘇后細(xì)胞的生長和分化正常；細(xì)胞凍存液成分穩(wěn)定，保質(zhì)期長；使用前無需另行配制或稀釋，批次間穩(wěn)定性好。
文檔編號A01N1/02GK101983562SQ201010184600
公開日2011年3月9日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者羅晴燕, 莫筱縈, 鄭敦武, 陳嘉慧, 魏寶麗 申請人:賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司