專利名稱：一種氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)疾病研究的模型領(lǐng)域，具體涉及一種用于氣虛發(fā)熱病癥研究的氣 虛發(fā)熱動(dòng)物模型及其制備方法。
背景技術(shù)：
近幾年來(lái)有關(guān)各種氣虛證的造模方法形式多樣，有疲勞加飲食失節(jié)或?yàn)a下去，偏 食苦味或酸味，耗氣破氣或苦寒瀉下加耗氣破氣等(李軍蘭，方肇勤.氣虛證動(dòng)物模型造模 方法[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，18(3) :56-60.)。目前比較公認(rèn)的氣虛造模方法主 要有單純疲勞法、疲勞加飲食失節(jié)法、疲勞加瀉下法、煙熏法及手術(shù)(吳捷，劉勤社，高潔， 等.養(yǎng)血婦康顆粒劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性氣血虛證動(dòng)物的影響[J].陜西中醫(yī)，2002，23 (5) =467-469.； 陳家旭，陳易新，季紹良，等.瀉下、勞倦因素致脾氣虛下鼠下丘腦、血漿NPY含量的變化 [J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25(6) =22-24.；田道法，唐發(fā)清，周小軍，等.氣虛證模型 大鼠反義DNA陣列A區(qū)基因表達(dá)譜特征的初步研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21(2) 1-3.；高雪，李浩，曲敬來(lái)，等.補(bǔ)肺湯對(duì)肺氣虛證大鼠下呼吸道病理變化的影響[J].中 醫(yī)藥信息，2000，17 (5) :55-56.)，但總體上以采用疲勞的方法為主，在疲勞的基礎(chǔ)上加用限 食、瀉下等方法。有研究表明，應(yīng)用疲勞加限食法制作的動(dòng)物氣虛模型更符合中醫(yī)理論，可 使氣更不足，氣虛癥候更明顯。氣虛多由先天稟賦不足，或后天失養(yǎng)，或勞傷過(guò)度而耗損(勞則氣耗)，或久病 不復(fù)，氣的生化不足等所致(張珍玉.對(duì)中醫(yī)學(xué)氣的認(rèn)識(shí)[J].浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000， 24(1) :32-32.)，臨床上可導(dǎo)致多種病證的發(fā)生，發(fā)熱是其中之一，熱勢(shì)或高或低，但因氣虛 所致，故發(fā)熱多在勞累后發(fā)作或加劇。目前實(shí)驗(yàn)大鼠發(fā)熱模型主要以酵母、內(nèi)毒素(LPS)和 2，4_ 二硝基酚最為常見(jiàn)，其共同的特點(diǎn)是造模方便，成功率高，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求也比較低。 其中LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱與傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)癥候所致發(fā)熱相似，是較經(jīng)典的發(fā)熱模型，因此常用 于篩選中藥解熱藥物并探討發(fā)熱機(jī)制(唐曉峰，薛漫清，王暉.大鼠發(fā)熱模型及發(fā)熱機(jī)制的 研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25 (3) :327-331.)。PGE是公認(rèn)的中樞發(fā)熱介質(zhì)(金惠銘主編.病理生理學(xué).北京.人民衛(wèi)生出版社， 第五版，2001 :96.)。研究資料表明，致熱原引起發(fā)熱時(shí)，腦脊液及下丘腦中？6氏含量明顯 增加。動(dòng)物側(cè)腦室注入微量的PGE2可誘導(dǎo)發(fā)熱反應(yīng)，并且PGE2可直接刺激P0/AH區(qū)溫度敏 感神經(jīng)元，改變其放電頻率，抑制PGE合成和釋放的物質(zhì)能抑制發(fā)熱反應(yīng)(趙紅艷，范書(shū)擇， 孫麗華等.黃芩甙對(duì)發(fā)熱大鼠下丘腦PGE2和cAMP含量的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2002,18(2) :139-141.)。根據(jù)以往的資料，國(guó)內(nèi)多數(shù)學(xué)者主張cAMP也是發(fā)熱的中樞介質(zhì)之 一。胡景新等靜脈注射ET或EP引起家兔雙相熱時(shí)，腦脊液和下丘腦中cAMP含量均明顯增 多，且與體溫上升呈顯著正相關(guān)(張量，佟雷，楊宇等.低溫時(shí)蛙皮素對(duì)IL-10致熱大鼠下 丘腦和血漿cAMP含量的影響[J],中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10 (12) 1354-1357.)。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為(張惠敏，鄭守曾.氣虛體質(zhì)的研究進(jìn)展[J].北京中醫(yī)藥大學(xué) 學(xué)報(bào)，2004，27(1) :14-16.)，精、氣、血、津液是構(gòu)成和維持人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，氣虛
3則生血不足、氣虛則血行不暢、氣虛則津停，所以氣虛往往與血虛、血瘀、痰濕相互兼夾，形
成復(fù)雜的體質(zhì)。明代的萬(wàn)全言“......如受肺之氣為皮毛，肺氣不足，則皮脆薄怯寒，毛發(fā)
不生；受心之氣為血脈，心氣不足，則血不華色，面無(wú)光彩；受脾之氣為肉，脾氣補(bǔ)助，則肌 肉不生，手足如削；受肝之氣為筋，肝氣不足，則骨軟?！边€有研究表明，制作病證結(jié)合動(dòng)物模 型是研究氣虛發(fā)熱癥的重要途徑(羅堯岳.氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研究述評(píng)[J].湖南中 醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24 (5) =57-58.)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的研究較少，而氣虛發(fā)熱病癥又 是臨床常見(jiàn)病癥之一，通過(guò)游泳勞損法加限食法，提供一種氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型。本發(fā)明另一目的在于提供上述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型，該模型是采用游泳勞損法加限食法得到大鼠氣虛發(fā)熱模 型。本發(fā)明氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法包括如下步驟將大鼠控制飲食并力竭游 泳，腹腔注射LPS。作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，所述控制飲食是將大鼠的喂食量降為常規(guī) 飲食量的1/2 1/3。作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，所述大鼠力竭游泳時(shí)，不能以尾撐在底部休 息，持續(xù)游泳到下沉，經(jīng)10s后仍不能返回水面為止，每天游泳1 2次，持續(xù)3 4周。作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，所述大鼠力竭游泳時(shí)的水溫為18 25°C。作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，所述腹腔注射LPS的量為60 lOOy g/kg， 最優(yōu)選為80iig/kg。通過(guò)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氣虛癥的大鼠被毛稀疏易脫落、黯淡枯燥，實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行肺 病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其肺組織中有少量炎性細(xì)胞，上皮細(xì)胞受損呈現(xiàn)纖毛倒伏、粘連；正常大鼠 支氣管黏膜結(jié)構(gòu)和肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)上皮壞死脫落、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，從而證實(shí)肺 與皮毛之間確實(shí)存在一定的依附關(guān)系。而且進(jìn)行脾病理學(xué)切片也提示有形態(tài)學(xué)改變，從這 幾點(diǎn)來(lái)看，可以初步判斷本發(fā)明方法可以成功制作氣虛發(fā)熱大鼠模型。本發(fā)明氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型可用于氣虛發(fā)熱病癥的中醫(yī)臨床辨證論治，還可為中醫(yī) 治療氣虛發(fā)熱病癥的研究提供平臺(tái)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明通過(guò)對(duì)大鼠控制飲食以及使其游泳勞損力竭，還有腹腔注射LPS，得到了 氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型。研究數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的大鼠眼微睜無(wú)神，自主活 動(dòng)少，對(duì)外界反應(yīng)吃段，逃避、攻擊行為明顯減少；體溫偏高，可高達(dá)39.4°C且熱程較長(zhǎng)；組 織病理學(xué)切片觀察可知?dú)馓摪l(fā)熱模型的肺局部組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)模 糊，肺泡間隔變薄或斷裂。因此本發(fā)明方法得到的大鼠氣虛發(fā)熱模型與現(xiàn)有的氣虛發(fā)熱模 型相比，氣更不足，氣虛癥候更加明顯，且通過(guò)LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱癥狀與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)癥候所致 發(fā)熱相似，是較經(jīng)典的發(fā)熱模型，因此本發(fā)明大鼠氣虛發(fā)熱模型的氣虛發(fā)熱癥狀更顯著，為中醫(yī)治療氣虛發(fā)熱病癥提供了良好的研究平臺(tái)。


圖1是正常組大鼠的行為學(xué)觀察；
圖2是氣虛組大鼠的行為學(xué)觀察；
圖3是氣虛發(fā)熱組大鼠的行為學(xué)觀察；
圖4是腹腔注射LPS后大鼠提問(wèn)升高(AT)的影響(°C)
圖5是正常組大鼠肺臟的病理切片圖6是氣虛組大鼠肺臟的病理切片圖7是氣虛發(fā)熱組大鼠肺臟的病理切片圖8是正常組大鼠脾臟的病理切片圖9是氣虛組大鼠脾臟的病理切片圖10是氣虛發(fā)熱組大鼠脾臟的病理切片圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，220 250g，SPF級(jí)，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心提供[合格證號(hào):SCXK粵20080020]。2.藥品和試劑脂多糖 LPS(Escherichcacoliell-dotoxin 055 :B5，L2880)購(gòu)于 Sigma公司；PGE2、cAMP放免藥盒廣州威佳試劑有限公司；電腦數(shù)字溫度計(jì)MC-3B型，由 0MR0M歐姆龍(大連)有限公司生產(chǎn)。3.實(shí)驗(yàn)方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、氣虛組、氣虛發(fā)熱組，每組10只。正 常組常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食，其余兩組控制飲食(喂食量為平時(shí)的1/2)并進(jìn)行力竭游泳，水溫 控制在25°C，盛于塑料水桶中。大鼠游泳時(shí)，不能以尾撐在池底休息，1次/天，持續(xù)21天， 建立氣虛動(dòng)物模型(本實(shí)驗(yàn)參照MCARDLE推薦的力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)(田道法，唐發(fā)清，周小軍， 等.氣虛證模型大鼠反義DNA陣列A區(qū)基因表達(dá)譜特征的初步研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué) 報(bào)，2001,21 (2) 1-3.)，即游泳最后下沉，經(jīng)10s后仍不能返回水面為力竭)，氣虛發(fā)熱組大 鼠腹腔注射LPS(LPS 80 u g/kg)，正常組、氣虛組不做處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隔天記錄大鼠體重， 并對(duì)大鼠行為學(xué)進(jìn)行觀察；取大鼠下丘腦組織，采用ELISA法定量測(cè)定PGE2、cAMP含量；取 出脾、肺進(jìn)行病理學(xué)檢查。實(shí)施例2氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的行為學(xué)觀察對(duì)各組大鼠的精神狀態(tài)，反應(yīng)敏捷度，糞便體積大小，排便次數(shù)等日常活動(dòng)進(jìn)行觀察。結(jié)果正常組大鼠表現(xiàn)靈活，眼光有神，反應(yīng)迅速，被毛潔白光澤，糞便體積大，排 便次數(shù)少。氣虛和氣虛發(fā)熱模型組大鼠眼微睜無(wú)神，自主活動(dòng)少，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍，逃避、攻 擊行為明顯減少，被毛稀疏易脫落、黯淡枯燥，糞便體積小而稀，排便次數(shù)少(圖1 3)。實(shí)施例3氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的體重變化
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隔天記錄大鼠體重。結(jié)果正常組大鼠體重逐漸增長(zhǎng)，氣虛和氣虛發(fā)熱模型組大鼠體重隨著造模時(shí)間 的延長(zhǎng)顯著下降，與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05或P < 0. 01)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1大鼠體重的變化(g) (n = 10,x±s ) 注與正常組比較*P< 0. 05，**P < 0. 01 ；實(shí)施例4氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的體溫變化造模前2d，每日早晚測(cè)量各組大鼠肛溫，選取體溫在36. 6 38. 0°C，且連續(xù)體 溫變化<0.3°C的大鼠，取其平均值作為正?；A(chǔ)體溫CU ；造模后，每隔30min測(cè)定肛溫 ⑴)，連續(xù)測(cè)量8h，計(jì)算體溫變化值A(chǔ) T ( A T = T.-To)。從圖4可以看出，與正常組相比，氣虛組和氣虛發(fā)熱組大鼠在注射LPS(80ii g/kg) 后的0.5h到8h內(nèi)各個(gè)觀察點(diǎn)AT明顯升高，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差(P<0.05)；氣虛組在 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的基礎(chǔ)體溫都偏高，并在1. 5h左右達(dá)到最高溫度38. 5°C，此后在小范圍內(nèi) 波動(dòng)；氣虛發(fā)熱組在注射LPS 2. 5h后，體溫有大幅的升高，與氣虛組相比有顯著性差異(P <0. 05)，第5h左右體溫達(dá)到高峰39. 4°C，此后逐漸下降，但下降的幅度不明顯，熱程較長(zhǎng)， 達(dá)8h以上；正常組大鼠體溫相對(duì)穩(wěn)定，始終保持在正常體溫內(nèi)波動(dòng)。實(shí)施例5氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的下丘腦組織中PGE2和cAMP含量變化的檢測(cè)由表2可以看出，氣虛發(fā)熱組大鼠下丘腦中cAMP、PGE2含量明顯高于正常組，有非 常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。結(jié)果顯示下丘腦組織中CAMP含量升高，推測(cè)可能由于 Ca2+濃度下降(Na7Ca2+上升)所引起發(fā)熱介質(zhì)增多而導(dǎo)致的，因此測(cè)定下丘腦內(nèi)Na+/Ca2+值 將為探討其機(jī)制的提供更有力的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明腹腔注射LPS引起降溫的同時(shí)， 下丘腦中PGE2含量降低，提示其可能通過(guò)抑制PGE2的分泌過(guò)程來(lái)降低體溫。表2下丘腦組織中PGE2和cAMP含量(n = 10，) 注與氣虛組比較，*p <0.01。實(shí)施例6氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型組織病理學(xué)切片觀察組織病理學(xué)切片檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死，取脾、肺放入10體積％福爾馬林溶 液中固定，24h后經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、切片、HE染色后放入電鏡下觀察。圖5 7為大鼠肺臟病理切片圖，可以看出，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺組織 結(jié)構(gòu)清晰，肺泡及肺間隔均未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變，氣虛和氣虛發(fā)熱組大鼠肺局部組織有炎 細(xì)胞浸潤(rùn)，部分出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)模糊，肺泡間隔變薄或斷裂。圖8 10為大鼠脾臟病理學(xué)切片圖，從圖可以看出，與正常組相比，氣虛和氣虛發(fā) 熱組大鼠脾臟局部組織有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)模糊。
權(quán)利要求
一種氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型，其特征在于是采用游泳勞損法加限食法得到大鼠氣虛發(fā)熱模型。
2.權(quán)利要求1所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于包括如下步驟將大鼠 控制飲食并力竭游泳，腹腔注射LPS。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述控制飲食是將 大鼠的喂食量降為常規(guī)飲食量的1/2 1/3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述大鼠力竭游泳 時(shí)，不能以尾撐在底部休息，持續(xù)游泳到下沉，經(jīng)IOs后仍不能返回水面為止，每天游泳1 2次，持續(xù)3 4周。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述大鼠力竭游泳 時(shí)的水溫為18 25°C。
6 根據(jù)權(quán)利要求2所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述腹腔注射LPS 的量為60 100μ g/kg。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述腹腔注射LPS 的量為80 μ g/kg。
8.權(quán)利要求1所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的應(yīng)用，其特征在于所述氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型為中 醫(yī)治療氣虛發(fā)熱病癥的研究提供平臺(tái)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型是采用游泳勞損法加限食法得到的大鼠氣虛發(fā)熱模型。本發(fā)明氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型的制備方法如下將大鼠控制飲食并力竭游泳，腹腔注射LPS。本發(fā)明氣虛發(fā)熱動(dòng)物模型可以用于氣虛發(fā)熱病癥的中醫(yī)臨床辨證論治，還可為中醫(yī)治療氣虛發(fā)熱病癥的研究提供平臺(tái)。
文檔編號(hào)A61D7/00GK101849526SQ20101018641
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者唐曉峰, 王暉, 程闊菊, 薛漫清, 陳懇 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院