專利名稱:食蟹猴急性肝衰模型的建立方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及急性肝衰動物模型的建立方法,具體涉及利用食蟹猴建立急性肝衰模型的方法。
背景技術(shù):
急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是指原來不存在肝硬化的患者26 周內(nèi)出現(xiàn)凝血異常和不同程度的意識改變,其病程短、預后極差,有報道顯示病死率高達 80%。目前,唯一有效的治療方法是原位肝移植。然而,目前因為器官短缺,有三分之一的 急性肝衰患者在等待器官移植的過程中死亡。作為急性肝功能衰竭患者肝移植或肝再生的 橋梁,人工肝支持系統(tǒng)是非常必要的。人工肝支持系統(tǒng)已被國內(nèi)外學者證明具有良好的臨床治療效果。人工肝支持系統(tǒng) 可以分為非生物人工肝支持系統(tǒng)和生物人工肝支持系統(tǒng),其中最有發(fā)展前景的是生物人工 肝支持系統(tǒng)。生物人工肝是利用培養(yǎng)的生物活性成分(肝細胞)置于體外生物反應器中, 患者血液/血漿流過生物反應器,通過半透膜或直接接觸與培養(yǎng)肝細胞進行物質(zhì)交換,為 肝功能衰竭患者提供肝臟支持功能。在生物人工肝的研究中,為評價生物人工肝的安全性 和有效性,穩(wěn)定的急性肝功能衰竭模型的建立是必不可少的。然而,目前沒有一種已建立的動物模型能夠適應這種要求。因此,有必要提供一種 急性肝衰動物模型,以滿足科學研究的需求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種食蟹猴急性肝衰模型的建立方法,所述方法包括經(jīng)食 蟹猴頸外靜脈注射D-氨基半乳糖的步驟。在本發(fā)明的實施方式中,所述D-氨基半乳糖為0. lg/ml的D-氨基半乳糖的葡萄 糖溶液的形式。在優(yōu)選的實施方式中,所述D-氨基半乳糖的葡萄糖溶液的pH為6. 8。在本發(fā)明的另一實施方式中,所述D-氨基半乳糖的葡萄糖溶液在10分鐘內(nèi)被注 射完畢。在本發(fā)明的另一實施方式中,所述D-氨基半乳糖以0. 3g/kg體重的劑量被注射進 入食蟹猴。在本發(fā)明的另一實施方式中,在注射之前,在頸外側(cè)中段且與頸外靜脈垂直處作 2 3cm的橫切口,切開皮膚皮下組織,結(jié)扎出血點,并用彎血管鉗沿靜脈方向分離皮膚組 織,將靜脈游離1.5 2cm。由D-氨基半乳糖導致大量肝細胞壞死所誘導的急性肝功能衰竭過程被認為是最 接近人的急性肝衰竭病程。本發(fā)明提供的食蟹猴急性肝衰模型的建立方法,是通過食蟹猴 頸外靜脈注射D-氨基半乳糖溶液,以導致大量肝細胞壞死,建立食蟹猴急性肝衰模型。根 據(jù)該模型,對不同的食蟹猴進行分析對比,實際試驗結(jié)果表明,通過頸外靜脈注射D-氨基 半乳糖溶液后,食蟹猴出現(xiàn)了一些與肝功能下降相關的臨床表現(xiàn),如食欲下降、活動減少、惡心嘔吐、嗜睡以及昏迷,最終死于肝功能衰竭,生化檢測、死亡后的尸體解剖及光鏡、電鏡 病理學改變也證實了這一實驗結(jié)果,從而說明本發(fā)明以實驗手段建立了食蟹猴急性肝衰模 型,該模型能夠很好地用于生物人工肝系統(tǒng)的安全性和有效性的臨床前評價。
圖1-3分別為本發(fā)明實施例1中食蟹猴的肝臟、腎臟和腦部切片在光鏡下觀察到 的圖片;圖4-6分別為本發(fā)明實施例1中食蟹猴的肝臟、腎臟和腦部切片在電鏡下觀察到 的圖片;圖7-9分別為本發(fā)明實施例2中食蟹猴的肝臟、腎臟和腦部切片在光鏡下觀察到 的圖片;圖10-12分別為本發(fā)明實施例2中食蟹猴的肝臟、腎臟和腦部切片在電鏡下觀察 到的圖片。
具體實施例方式以下將結(jié)合具體實驗來闡述本發(fā)明的具體實施方法以及本發(fā)明的優(yōu)點。研究表明,D-氨基半乳糖是一種肝細胞毒性藥物,可在短時間內(nèi)引起嚴重肝損害, 其作用機制是①通過抑制肝細胞的RNA和漿膜蛋白合成造成肝細胞壞死;②肝細胞壞死 與細胞外Ca 2+大量進入細胞內(nèi)有關;③腸外因素,包括胃腸通透性增加,細菌的移位和內(nèi) 毒素等都增加了 D-氨基半乳糖的肝臟毒性。大動物模型是醫(yī)療新產(chǎn)品開發(fā)的必需資料。在生物人工肝進行大動物肝功能衰竭 的實驗治療過程中,大動物的血漿將與人的肝細胞直接接觸,這可能誘發(fā)動物抗人的免疫 反應;考慮到降低免疫因素的需要,本發(fā)明采用靈長類食蟹猴為模型動物。靈長類動物是目 前最理想的臨床前實驗數(shù)據(jù)來源,在形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類 高度近似的優(yōu)點,但開展并不廣泛,數(shù)據(jù)資料比較稀缺。食蟹猴肝功能衰竭模型的建立目前 尚未有成熟的方法,也尚未有利用生物人工肝進行救治的研究報道。從臨床表現(xiàn)、血液生化 指標、組織學改變等各個生理病理方面模擬人類的急性肝功能衰竭過程,將有利于我們探 討生物人工肝治療急性肝衰竭的方法,有利于評價生物人工肝的安全性和有效性,這不僅 有重要的理論價值,也有著潛在的應用前景。本發(fā)明的方法具體包括以下步驟(1)準備材料本發(fā)明所選用的動物為食蟹猴,雄性,7歲齡,體重6 7kg。(2) D_氨基半乳糖溶液的配制稱取D-氨基半乳糖鹽酸鹽(藥物純度為98%)溶于5%的葡萄糖溶液中,配制藥 物的濃度為lg/10ml,用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為6. 8。(3)暴露頸外靜脈麻醉后于頸外側(cè)中段且與頸外靜脈垂直處作2-3cm的橫切口,切開皮膚皮下組 織,結(jié)扎出血點,用彎血管鉗沿靜脈方向分離皮膚組織,將靜脈游離1. 5-2cm。(4)給藥
吸取已配制好的D-氨基半乳糖溶液,接上頭皮針,準確地把頭皮針插進頸外靜 脈,回抽注射器見回血后將頭皮針與頸外靜脈結(jié)扎在一起,lOmin內(nèi)按0. 3g/kg的劑量把 D-氨基半乳糖溶液經(jīng)頸外靜脈一次性輸入食蟹猴體內(nèi)。(5)給藥后的觀察項目記錄給藥后食蟹猴的生存情況和生存時間,生化指標和死亡后的尸體解剖及光 鏡、電鏡病理學改變。實施例11材料與方法1. 1材料選取成年食蟹猴,雄性,7歲齡,體重6. 7kg,未曾用于其他實驗,單籠飼 養(yǎng),水和食物不限。1. 2 方法1. 2. 1D-氨基半乳糖溶液的配制稱取D-氨基半乳糖鹽酸鹽(藥物純度為98 % ) 溶于5%的葡萄糖溶液中,配制藥物的濃度為lg/10ml,用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值 為6. 8 (pH值用數(shù)字pH計測定),配好的溶液在2h內(nèi)應用,在lOmin內(nèi)經(jīng)頸外靜脈插管一次 性輸入動物體內(nèi)。1. 2. 2ALF模型的建立實驗猴術(shù)前禁食12h,不禁水。采用速眠新II (0. lmL/kg) 肌內(nèi)注射和氯胺酮(0. lml/kg)肌內(nèi)注射聯(lián)合麻醉方法麻醉猴,平臥位并妥善固定,用 2. 5-3%的碘酒,75%的酒精消毒局部皮膚,并鋪好無菌小孔巾,于頸外側(cè)中段且與頸外靜 脈垂直處作2-3cm的橫切口,切開皮膚皮下組織,結(jié)扎出血點。用彎血管鉗沿靜脈方向分離 皮膚組織,將靜脈游離1. 5-2cm。從游離靜脈深面穿過2根1號絲線,暫時不結(jié)扎,留作牽引 用。吸取已配制好的D-氨基半乳糖溶液,接上頭皮針,并將液體灌滿管腔內(nèi)。左手提起靜 脈遠心端的1號絲線,右手準確地把頭皮針插進頸外靜脈,回抽注射器見回血后收緊近心 端的絲線,將頭皮針與頸外靜脈結(jié)扎在一起。在lOmin內(nèi)把20. lml D-氨基半乳糖溶液經(jīng) 頸外靜脈一次性輸入實驗猴體內(nèi),完成后拔出頭皮針,結(jié)扎頸外靜脈。檢查無出血后間斷縫 合皮膚切口。實驗猴術(shù)后給予常規(guī)的水果及飼料,沒有使用其他的支持治療和其他藥物。1. 3觀察項目1. 3. 1術(shù)后觀察生存情況1. 3. 2生存時間從給藥時開始記錄動物的存活時間1. 3. 3生化指標術(shù)前及術(shù)后每天定時抽血,用于測定肝功能、腎功能、血氨、凝血 項、支鏈氨基酸和芳香族氨基酸比等。1. 3. 4尸檢及病理檢查動物死后作詳細尸檢并取肝臟、腎臟、腦組織。光鏡檢查 尸檢組織標本分別修剪成5mm見方的小塊,用100ml/L的甲醛溶液固定,逐級酒精脫水,石 蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察;電鏡檢查尸檢組織標本分別修剪成1mm見方的小塊,經(jīng) 25g/L戊二醛和10g/L鋨酸雙重固定,常規(guī)丙酮逐級脫水,Epon-812樹脂包埋,LKB-2088超 薄切片機切片,醋酸鈾,檸檬酸鉛染色,然后在Hitachi-600透射電鏡下觀察。2 結(jié)果2. 1生存時間及生存情況食蟹猴給藥后存活時間為124小時,給藥后出現(xiàn)納差、疲 倦乏力,繼而出現(xiàn)嗜睡、肝昏迷。2. 2生化指標食蟹猴的生化指標如下表1所示。
2. 3尸檢及病理檢查(一 )體腔檢查從頌下沿胸骨中線直至恥骨聯(lián)合,按常規(guī)做“ | ”字形切口,切開皮膚、皮下及肌肉 等各層,暴露胸腔和腹腔,檢查如下胸腔暴露胸腔,心臟左位,外觀無明顯異常,剪開心包,心包腔內(nèi)無明顯積液,各 大血管走向正常。腹腔暴露腹腔,未發(fā)現(xiàn)血性腹水,臟器位置基本正常。顱腔顱腔內(nèi)腦組織無明顯出血、壞死。 肺雙肺發(fā)育健全,質(zhì)實,表面光滑,無明顯淤血,呈灰白、灰紅色。左肺2葉,大小為 9X4. 5X2. 5cm,右肺 3 葉,大小為 9X5. 5X 3cm。心臟心臟左位,大小為5. 5cmX4cmX2. 5cm,心外膜光滑,未見出血及滲出。心包 無粘連及出血點,無積液。肝肝臟被膜光滑,質(zhì)軟,邊緣鈍,顏色灰紅、灰黃色,大小為12CmX9CmX3Cm。后 緣無膽汁浸染區(qū),切面無出血壞死。胃、腸胃小彎長8. 5cm,大彎長13cm,粘膜面未見糜爛、出血、壞死。小腸灰黃、灰 紅色。胰腺大小為6. 5cmX2cmXlcm,灰黃色,未見出血灶。脾臟呈灰紅色,大小為4. 5cmX2. 5cmXlcm。表面光滑,切面暗紅色,未見出血、
壞死。被膜完整,脾髓易刮離,邊緣鈍。腎雙腎包膜光滑,表面呈分葉狀,灰紅色。左腎大小為5. 5cmX3. 5cmX2cm ;右腎 大小為4. 5cmX3. 5cmX2cm。切開后可見皮、髓質(zhì)分界清楚。腎盂無明顯擴張。(三)光鏡檢查肝臟肝細胞彌漫性腫脹,肝竇受壓變窄。肝細胞胞漿疏松化、空泡變性,部分肝細 胞內(nèi)可見脂肪空泡。部分肝細胞核碎裂、溶解。部分匯管區(qū)可見少量中性粒細胞和淋巴細 胞浸潤(圖1)。腎臟結(jié)構(gòu)層次清楚。腎間質(zhì)血管明顯擴張、充血,以髓質(zhì)處明顯。部分近曲小管 水樣變性,少量近曲小管上皮壞死脫落。腎小球毛細血管擴張、充血(圖2)。腦部大腦部分血管和神經(jīng)元周圍可見空隙,少量神經(jīng)元細胞胞漿內(nèi)可見小膠質(zhì) 細胞侵入。小腦和腦干結(jié)構(gòu)層次清楚,未見明顯異常(圖3)。(四)電鏡檢查肝臟肝細胞壞死,細胞核消失,結(jié)構(gòu)不清,細胞質(zhì)可見有較多脂滴,線粒體結(jié)構(gòu)模 糊,脊模糊不清,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少,部分擴張,光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少(圖4)。腎臟腎小管上皮胞漿空泡多,小管內(nèi)線粒體空化,RER,微絨毛排列紊亂,腎小球, 袢內(nèi)見中性粒細胞(圖5)。腦部微血管內(nèi)皮腫脹,管腔變窄,血管周間隙擴張,神經(jīng)元、線粒體空化(圖6)。(五)病理診斷1、肝細胞彌漫性變性,部分壞死,伴匯管區(qū)慢性炎細胞浸潤;2、部分腎小管上皮水變性,少量腎小管上皮壞死;3、輕度腦水腫。實施例21材料與方法1. 1材料選取成年食蟹猴,雄性,7歲齡,體重6. 8kg,未曾用于其他實驗,單籠飼 養(yǎng),水和食物不限。1. 2 方法1. 2. ID-氨基半乳糖溶液的配制同實施例1的程序。1. 2. 2ALF模型的建立同實施例1的程序,只是在IOmin內(nèi)把20. 4ml D-氨基半乳 糖溶液經(jīng)頸外靜脈一次性輸入實驗猴體內(nèi)。
1. 3觀察項目1. 3. 1術(shù)后觀察生存情況1. 3. 2生存時間從給藥時開始記錄動物的存活時間1. 3. 3生化指標術(shù)前及術(shù)后每天定時抽血,用于測定肝功能、腎功能、血氨、凝血 項、支鏈氨基酸和芳香族氨基酸比等。1. 3. 4尸檢及病理檢查動物死后作詳細尸檢并取肝臟、腎臟、腦組織,染色、切片后 作光鏡檢查和電鏡檢查,程序同實施例1。2 結(jié)果2. 1生存時間及生存情況食蟹猴給藥后存活時間為117小時,給藥后出現(xiàn)納差、疲 倦乏力,繼而出現(xiàn)嗜睡、肝昏迷。2. 2生化指標食蟹猴的生化指標如上表22. 3尸檢及病理檢查(一 )體腔檢查從頌下沿胸骨中線直至恥骨聯(lián)合,按常規(guī)做“ | ”字形切口,切開皮膚、皮下及肌肉 等各層,暴露胸腔和腹腔,檢查如下胸腔暴露胸腔,心臟左位,外觀無明顯異常,剪開心包,心包腔內(nèi)無明顯積液,各 大血管走向正常。腹腔暴露腹腔,未發(fā)現(xiàn)血性腹水,臟器位置基本正常。顱腔顱腔內(nèi)腦組織無明顯出血、壞死。(二)臟器檢查腦腦組織灰白色。大腦大小為6. 5X6X3cm,小腦大小為3X3X1. 3cm。肺雙肺發(fā)育健全,質(zhì)實,表面光滑,無明顯淤血,呈灰白、灰紅色。左肺大小為 10X7X3cm,右肺大小為 12X7X2. 5cm。心臟心臟左位,大小為6cmX4. 5cmX 2cm,心外膜光滑,未見出血及滲出。心包無 粘連及出血點,無積液。肝肝臟被膜光滑,質(zhì)軟,邊緣鈍,顏色灰紅、灰白色,大小為13CmX7CmX3Cm。后 緣無膽汁浸染區(qū),切面無出血壞死。胰腺灰白色,大小為llcmXl. 5cmX0. 8cm,未見出血灶。脾臟呈灰紅色,大小為5. 5cmX3. 3cmX0. 5cm。表面光滑,切面暗紅色,未見出
血、壞死。腎雙腎包膜光滑,灰紅色。左腎大小為4. 5CmX3CmX1.6Cm,右腎大小為 4. 5cmX3cmXlcm0切開后可見皮、髓質(zhì)分界清楚。腎盂無明顯擴張。胃呈灰白、灰紅色,大小為8X4Xlcm,胃小彎長5cm,大彎長12cm,賁門周徑3cm, 幽門周徑10cm。粘膜面未見糜爛、出血、壞死。腸小腸長120cm,直徑1 1. 6cm。大腸長51cm,直徑1 3. 7cm。(三)光鏡檢查肝臟肝細胞彌漫性腫脹,肝竇受壓變窄。肝細胞胞漿疏松化、空泡變性。部分肝 細胞壞死、崩解。匯管區(qū)可見大量淋巴細胞、漿細胞浸潤和少量中性粒細胞浸潤。局部區(qū)域 肝血竇高度擴張、充血(圖7)。
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腎臟結(jié)構(gòu)層次清楚。腎間質(zhì)血管明顯擴張、充血。部分腎小管水樣變性,胞體變大,胞漿疏松呈顆粒狀,少量腎小管上皮壞死脫落(圖8)。腦部大腦部分血管和神經(jīng)元周圍出現(xiàn)組織空隙,少量神經(jīng)元細胞發(fā)生變性,可見 胞漿內(nèi)有小膠質(zhì)細胞侵入。腦膜下及腦實質(zhì)內(nèi)可見散在多灶性鈣化(以腦膜下鈣化為主, 局部侵入腦實質(zhì)內(nèi))。腦膜血管擴張、充血。小腦結(jié)構(gòu)層次清楚,可見腦膜血管擴張、充血。 腦干結(jié)構(gòu)層次未見明顯異常(圖9)。(四)電鏡檢查肝臟肝細胞壞死,細胞核消失,結(jié)構(gòu)不清,細胞質(zhì)可見有較多脂滴,線粒體結(jié)構(gòu)模 糊,脊模糊不清,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少,部分擴張,光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少(圖10)。腎臟腎小管上皮胞漿空泡多,小管內(nèi)線粒體空化,RER,微絨毛排列紊亂,腎小球, 袢內(nèi)見中性粒細胞(圖11)。腦部微血管內(nèi)皮腫脹,管腔變窄,血管周間隙擴張,神經(jīng)元、線粒體空化(圖12)。(四)病理診斷1、肝細胞彌漫性變性,部分壞死,伴匯管區(qū)慢性炎細胞浸潤;2、部分腎小管上皮水變性,少量腎小管上皮壞死;3、輕度腦水腫,伴腦膜下鈣化;重復進行上述實施例中描述的過程多次,發(fā)現(xiàn)所得到的結(jié)果大致相同。通過上述 實驗可以看出通過給食蟹猴頸外靜脈注射D-氨基半乳糖,可導致大量肝細胞壞死,從血液 生化檢測、尸體解剖、光鏡檢查及病理檢查多方面證明了食蟹猴最終死于肝功能衰竭,也從 而證明了能夠通過這一方法成功建立食蟹猴急性肝衰模型,本發(fā)明將可用于探討生物人工 肝治療急性肝衰竭的方法以及評價生物人工肝的安全性和有效性。
權(quán)利要求
一種食蟹猴急性肝衰模型的建立方法,所述方法包括經(jīng)食蟹猴頸外靜脈注射D-氨基半乳糖的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述D-氨基半乳糖為0.lg/ml的D-氨 基半乳糖的葡萄糖溶液的形式。
3.如權(quán)利要求2所述的建立方法,其特征在于,所述D-氨基半乳糖的葡萄糖溶液的pH 為 6. 8。
4.如權(quán)利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述D-氨基半乳糖的葡萄糖溶液在10 分鐘內(nèi)被注射完畢。
5.如權(quán)利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述D-氨基半乳糖以0.3g/kg體重的 劑量被注射進入食蟹猴。
6.如權(quán)利要求1所述的建立方法,其特征在于,在注射之前,在頸外側(cè)中段且與頸外靜 脈垂直處作2 3cm的橫切口,切開皮膚皮下組織,結(jié)扎出血點,并用彎血管鉗沿靜脈方向 分離皮膚組織,將靜脈游離1. 5 2cm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食蟹猴急性肝衰模型的建立方法,所述方法包括經(jīng)食蟹猴頸外靜脈注射D-氨基半乳糖的步驟。通過食蟹猴頸外靜脈注射D-氨基半乳糖溶液,以實驗手段誘導出食蟹猴的急性肝功能衰竭,建立的急性肝衰模型能夠很好地用于生物人工肝系統(tǒng)的安全性和有效性的臨床前評價。
文檔編號A01K67/027GK101869091SQ20101022647
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者周煥城, 張志 , 潘明新, 簡國登, 高森, 高毅 申請人:南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院