專利名稱：優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海藻資源高值化開(kāi)發(fā)利用技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種利用在優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件情況下，培養(yǎng)出具有高含量藻紅蛋白的紫菜絲狀藻體的技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
海洋藻類資源及天然活性產(chǎn)物的高值化開(kāi)發(fā)和利用是當(dāng)今海洋生物科學(xué)研究的重要主題。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，光合色素對(duì)于所有光合作用的自營(yíng)養(yǎng)型生物是至關(guān)重要的。 各種海洋植物、藻類能通過(guò)自身存在的光合系統(tǒng)，有效地利用環(huán)境中的CO2,即海藻的光合色素能把(X)2轉(zhuǎn)化為有機(jī)物并釋放氧氣，它們是海洋中其它生物賴以生存、持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。海洋紅藻和藍(lán)藻，除了含有植物常見(jiàn)的葉綠素a外，還含有一類特殊的輔助性采光色素，稱為藻膽蛋白(Wiycobiliprotein)，主要包括藻紅蛋白(Wiycoerythrin，PE)，藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)和別藻藍(lán)蛋白(Allo-phycocyanin，APC)。紅藻和藍(lán)藻所特有的藻膽蛋白，最早是由henbeck于1836年首次發(fā)現(xiàn)的。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外的許多科研人員已對(duì)各種海洋藻類藻膽蛋白的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、光譜吸收特征、光合生理以及它們?cè)诠夂线^(guò)程中的作用等方面進(jìn)行過(guò)大量的理論性研究，而且在探索藻膽蛋白的應(yīng)用性研究方面也做了許多的探索。相關(guān)的研究表明，藻膽蛋白在臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。它們可作為單克隆物與特異的抗體發(fā)生耦合作用，當(dāng)這種結(jié)合態(tài)抗體附到細(xì)胞或組織的特異受體位點(diǎn)時(shí)，很容易通過(guò)它們發(fā)出的特異性熒光而進(jìn)行跟蹤觀察，可作為效果良好的生物性示蹤物，而且這種結(jié)合態(tài)物對(duì)生物體本身無(wú)任何毒性副作用和損害，這是放射性物以及其他一些化學(xué)染料示蹤法所根本無(wú)法相比的，其它潛在的應(yīng)用還包括DNA探針的熒光標(biāo)志，分子物和細(xì)胞的熒光免疫測(cè)試。藻膽蛋白也可和其它生物性大分子物或非生物性大分子物耦合，例如酶，其它蛋白質(zhì)物，多肽， 激子，核酸，藥物，維生子等，因此在分子或細(xì)胞水平上，對(duì)研究分子的轉(zhuǎn)移、代謝，疾病的診斷和治療方面，具有重要的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用價(jià)值。最近的研究表明，藻膽蛋白可作為有效的光敏劑，用于治療腫瘤、癌癥等。已有許多報(bào)道指出，藻膽蛋白能有效清除體內(nèi)的各種有害自由基，提高機(jī)體免疫力，具有抗輻射、 抗衰老、抗腫瘤作用，其產(chǎn)品市場(chǎng)大，是目前極有發(fā)展?jié)摿Φ慕】当＝∑?。另外，藻膽蛋白也可作為添加劑，廣泛應(yīng)用于各類食品和化妝品行業(yè)。根據(jù)全球生物化學(xué)產(chǎn)品最大的供應(yīng)商 Sigma公司的標(biāo)價(jià)，高純度的藻膽蛋白目前的市場(chǎng)售價(jià)已達(dá)75-500美元/毫克不等，而某些生物分子與藻膽蛋白結(jié)合物的現(xiàn)成品的售價(jià)更高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，這類產(chǎn)品目前在國(guó)際市場(chǎng)上大約有超過(guò)100億美元的市場(chǎng)機(jī)會(huì)。因此，隨著藻膽蛋白的價(jià)值逐步為人們所認(rèn)識(shí)，藻膽蛋白的開(kāi)發(fā)利用已成為研發(fā)的熱點(diǎn)，但昂貴的價(jià)格成為制約其開(kāi)發(fā)利用的瓶頸。如何高效獲取藻紅蛋白主要取決于如下幾個(gè)方面用于分離提取藻紅蛋白所需的藻源材料是否容易得到，藻源材料的藻紅蛋白含量高低，分離提取方法步驟的難易程度，藻源材料中存在的干擾分離純化成分量的多少等方面。目前，能利用于分離提取藻紅蛋白的藻源材料雖然有許多種，例如紫菜葉狀體，紅毛藻，石花菜，麒麟菜，江籬，叉枝藻，角叉藻，多管藻等，但這些藻普遍存在藻紅蛋白含量較低、干擾物多等問(wèn)題，而且?guī)追N藻膽蛋白的混雜存在，加大了獲取單一型藻紅蛋白的困難，造成藻紅蛋白分離純化的程序和步驟繁瑣復(fù)雜，且萃取、回收率低，成本高。有些用于分離提取藻紅蛋白的藻源材料很不容易獲取，例如珊瑚藻。紫菜葉狀體作為分離提取藻紅蛋白的材料，雖然來(lái)源方便，但紫菜經(jīng)加工后本身就已經(jīng)是一種好商品，若用來(lái)分離提取藻紅蛋白，就要耗費(fèi)大量紫菜(因紫菜葉狀體藻紅蛋白含量低)，分離提取藻紅蛋白后，紫菜就失去利用價(jià)值，而且大量的廢渣容易造成環(huán)境問(wèn)題，另外，紫菜葉狀體存在的大量胞外產(chǎn)物(例如粘多糖等)，也很不利于藻紅蛋白的分離提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)上面所述的背景技術(shù)，采用適宜的處理程序和條件，使成熟的壇紫菜葉狀體釋放果孢子，果孢子萌發(fā)后生長(zhǎng)成絲狀藻體；通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案[采用正交表L27 (313)]，考察三因子(溫度、光照、鹽度)及各個(gè)因子三水平(低、 中、高)的調(diào)控培養(yǎng)條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量的數(shù)值變化，從而確定優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件。通過(guò)優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件的培養(yǎng)，獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體。本發(fā)明采用的方法具有簡(jiǎn)便易行，效果好的優(yōu)點(diǎn)，使用獲得的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體作為藻源材料， 可用于進(jìn)一步分離提取藻紅蛋白，達(dá)到藻類材料高值化利用的目的，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。 目前，尚無(wú)采用優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件，獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明采用的研究材料和方法紫菜果孢子釋放與萌發(fā)的操作過(guò)程為于紫菜收成季節(jié)從現(xiàn)場(chǎng)海區(qū)采收成熟的紫菜葉狀體。用鑷子夾紗布，蘸滅菌海水小心清洗葉狀體表面，然后用滅菌海水淋洗3-5遍， 置于10-18°C環(huán)境陰干4-10小時(shí)。用滅菌剪刀剪下葉狀體的成熟部位，放于裝有滅菌海水的500-2000毫升的燒杯中。IO-M小時(shí)后，取出葉狀體。在已有果孢子釋放的燒杯中加入滅菌過(guò)的f/2營(yíng)養(yǎng)液，鹽度范圍在10-30ppt，置于10-20°C，光照強(qiáng)度lOO-lOOOlux，光照周期(L:D = 16:8)的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至培養(yǎng)長(zhǎng)出具有簇棕紅色的絲狀體藻絲。果孢子萌發(fā)長(zhǎng)成的初期絲狀體藻絲按正交實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置的條件下調(diào)控培養(yǎng)， PH保持適宜的數(shù)值，采用適宜的經(jīng)改良后的f/2營(yíng)養(yǎng)液，配方成分為NaN03，NaH2PO4H2O, FeCl36H20, FeSO4, Na2EDTA. 2H20, NaHCO3, NaMoO4. 2H20, ZnSO4. 7H20, CuSO4. 5H20, MnCl2. 4H20, CoCl2. 6H2O, VitaminB1, VitaminB2, VitaminB6, VitaminB12, VitaminC, VitaminD, Biotin。 絲狀藻體為全時(shí)光照的靜態(tài)培養(yǎng)。培養(yǎng)15-30天后，取出絲狀體藻絲，用濾紙吸去水分， 絲狀體藻絲放入研缽研磨成藻漿狀，加入0. 05M的磷酸鹽沖液置于暗處4°C萃取10-20小時(shí)，樣品液用離心機(jī)10000-12000rpm離心20-30分鐘，取上層藻紅蛋白萃取液，用分光光度計(jì)測(cè)定其在565、620、730nm波長(zhǎng)的吸光值，同時(shí)測(cè)定濾紙吸去水分的絲狀體藻絲的重量以及置于80°C干燥12小時(shí)后的藻體干重，確定出濕藻體和干藻體重量比值，最后按 Sampath-Wiley and Neefus方法Q007)計(jì)算絲狀體藻絲的藻紅蛋白含量，表達(dá)為毫克藻紅蛋白/克干重藻體(mg/g. dw)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為采用了三因子、三水平并具有可做交互作用分析的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(正交表 L27 (313))，設(shè)置調(diào)控培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)運(yùn)用方差分析方法，重點(diǎn)考察關(guān)鍵性因子溫度、光照強(qiáng)度和鹽度對(duì)絲狀藻體藻紅蛋白含量的影響，分析這些關(guān)鍵性因子的主次順序、交互作用的影響及確定優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件。以下是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析。 表一、絲狀藻體藻紅蛋白含量實(shí)驗(yàn)因子水平表
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征在于通過(guò)采收成熟的紫菜葉狀體，得到釋放的果孢子，果孢子萌發(fā)后生長(zhǎng)成絲狀體。采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，考察多因子水平的調(diào)控培養(yǎng)條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量的數(shù)值變化，從而確定可達(dá)到獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的紫菜種類為壇紫菜，但也可適用于其它形式的紫菜種類。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的紫菜果孢子釋放與萌發(fā)的操作過(guò)程為于紫菜收成季節(jié)從現(xiàn)場(chǎng)海區(qū)采收成熟的紫菜葉狀體。用鑷子夾紗布，蘸滅菌海水小心清洗葉狀體表面，然后用滅菌海水淋洗3-5遍，置于10-18°C環(huán)境陰干4-10小時(shí)。用滅菌剪刀剪下葉狀體的成熟部位，放于裝有滅菌海水的500-2000毫升的燒杯中。IO-M小時(shí)后，取出葉狀體。在已有果孢子釋放的燒杯中加入滅菌過(guò)的f/2營(yíng)養(yǎng)液，鹽度范圍在10-30ppt，置于10-20°C，光照強(qiáng)度 lOO-lOOOlux，光照周期(L:D= 16:8)的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至培養(yǎng)長(zhǎng)出具有簇棕紅色的絲狀體藻絲。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的可達(dá)到獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的確定，是通過(guò)通過(guò)相應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案獲得的。
5.按照權(quán)利要求1或4所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的高含量藻紅蛋白的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的溫度范圍值為 8-30 "C。
6.按照權(quán)利要求1或4所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的光照強(qiáng)度范圍值為 lOO-lOOOlux。
7.按照權(quán)利要求1或4所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的鹽度范圍值為 10-30ppt。
8.按照權(quán)利要求1或4所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的PH范圍值為 7. 0-8. 5。
9.按照權(quán)利要求1或4所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件是采用靜態(tài)培養(yǎng)。
10.按照權(quán)利要求1或4所述的一種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特征是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件是采用適宜的經(jīng)改良后的f/2營(yíng)養(yǎng)液，配方成分為NaNO3, NaH2PO4H2O, FeCl3. 6H20, FeSO4, Na2EDTA. 2H20, NaHCO3, NaMoO4. 2H20, ZnSO4. 7H20, CuSO4. 5H20, MnCl2. 4H20, CoCl2. 6H20, VitaminB1, VitaminB2, VitaminB6, VitaminB12, VitaminC, VitaminD, Bioitn。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件，獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體。屬于海藻資源高值化開(kāi)發(fā)利用技術(shù)領(lǐng)域.具體操作過(guò)程為采用適宜的處理程序和條件，使成熟的壇紫菜葉狀體釋放果孢子，果孢子萌發(fā)后生長(zhǎng)成絲狀藻體；通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案[采用正交表L27(313)]，考察三因子(溫度、光照、鹽度)及各個(gè)因子三水平(低、中、高)的調(diào)控培養(yǎng)條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量的數(shù)值變化，從而確定優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件。在優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量值高，最高可達(dá)64.73毫克/克干重藻體(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為58.24±5.07)。本發(fā)明采用的方法具有簡(jiǎn)便易行，效果好的優(yōu)點(diǎn)，使用獲得的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體作為藻源材料，可用于進(jìn)一步分離提取藻紅蛋白，達(dá)到藻類材料高值化利用的目的，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G33/02GK102334443SQ201010229370
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者林汝榕, 柯秀蓉, 邢炳鵬 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所