專利名稱：誘導(dǎo)海帶幼苗體細(xì)胞產(chǎn)生二倍雌雄配子體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海帶雌雄配子體的生產(chǎn)方法，尤其是一種誘導(dǎo)海帶幼苗體細(xì)胞產(chǎn) 生二倍雌雄配子體的方法。
背景技術(shù)：
海帶(Laminaria japonica)屬于褐藻門、褐子綱、海帶目、海帶科、海帶屬，屬于經(jīng) 濟(jì)價(jià)值較高的大型冷水性藻類，在亞洲主要分布在日本列島、朝鮮半島和我國的高緯度海 區(qū)沿海，在我國主要分布在遼寧和山東兩省。海帶味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有包括全部人體 必需氨基酸的19種氨基酸，蛋白質(zhì)、膳食纖維、糖份、維生素和礦物質(zhì)含量較高，特別是膳 食纖維和碘含量較高，是深受消費(fèi)者歡迎的健康食品，同時(shí)還是生產(chǎn)褐藻膠的原料，為此海 帶已是我國進(jìn)行大規(guī)模栽培的主要藻類之一。目前，在我國北方沿海浮筏栽培海帶使用的苗種為夏苗，每年10月上旬藻體長度 為1cm左右的幼苗出庫，經(jīng)過1個(gè)月海區(qū)暫養(yǎng)，當(dāng)幼苗長度達(dá)到10cm左右后分苗進(jìn)入栽培 階段，至第二年的5月中旬藻體長度達(dá)到3 4m。隨后，藻體葉片表面形成孢子囊斑，在7 月初孢子囊成熟放散出游孢子進(jìn)入繁殖期，孢子放散后藻體潰爛流失死亡。由于海帶葉片 表面形成孢子囊斑后產(chǎn)品價(jià)值降低，生產(chǎn)單位被迫將收獲期提前，海帶生長周期短，商品海 帶個(gè)體小、產(chǎn)量低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種誘導(dǎo)海帶幼苗體細(xì)胞 產(chǎn)生二倍雌雄配子體的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種誘導(dǎo)海帶幼苗體細(xì)胞產(chǎn)生二倍雌雄配子體的方 法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行a.將長度4 6mm的無菌海帶幼苗鋪在滅菌的載玻片上自柄部將假根切下，再將 幼苗葉片移到燒瓶中并添加培養(yǎng)液，將燒瓶靜置于溫度20°C、照度2000LX條件下培養(yǎng)，光 照時(shí)間為12小時(shí)/日，培養(yǎng)液每10天全量交換1次，培養(yǎng)2 3個(gè)月；b.將長成的絲狀體藻團(tuán)從葉片上剝下，按照粗大細(xì)胞絲狀體藻團(tuán)及細(xì)長細(xì)胞絲狀 體藻團(tuán)在載玻片上切碎后分別置于不同培養(yǎng)皿中，添加培養(yǎng)液后置于溫度10 20°C、照度 2000LX、光照12小時(shí)/日的條件下分別增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)至雌、雄配子體長滿培養(yǎng)皿底面，用 毛刷將配子體刷下，分別移到燒瓶內(nèi)添加培養(yǎng)液后保存。本發(fā)明是以海帶幼苗為材料，采用切除假根的方法誘導(dǎo)其體細(xì)胞產(chǎn)生配子體，由 于幼苗是二倍體，所產(chǎn)生的雌雄配子體為二倍雌配子體和二倍雄配子體。因所產(chǎn)生的配子 體與其來源藻體具有相同遺傳性狀，可與不同品種海帶的正常單倍雌雄配子體雜交獲得大 量的海帶三倍體幼苗，自交則可產(chǎn)生海帶四倍體幼苗，其倍化率可達(dá)100%，經(jīng)海區(qū)暫養(yǎng)和 分苗后在浮筏上栽培為海帶多倍體成體。多倍體海帶將用于發(fā)育的能量轉(zhuǎn)化為生長，生長 速度快，可大幅度延長生長周期，商品海帶個(gè)體大、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。
具體實(shí)施例方式a.在海帶的繁殖期內(nèi)，取浮筏栽培成熟種藻生有孢子囊斑的葉片，經(jīng)陰干刺激后 放入添加消毒海水的燒杯內(nèi)，當(dāng)觀察到有大量孢子放散孢子水呈淺褐色時(shí)撈出葉片，用吸 管取少量孢子水移到有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，2小時(shí)后，可見培養(yǎng)皿底面有圓形的胚孢子附 著，將培養(yǎng)皿移到溫度10°C、照度2000Lx條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液每天全量交換1次；培養(yǎng)2天 后，附著在培養(yǎng)皿內(nèi)的裙帶菜胚孢子萌發(fā)形成雌雄配子體，培養(yǎng)半個(gè)月后，可見雌配子體形 成卵囊并排出卵；雄配子體形成精子囊并放出精子，卵受精后經(jīng)細(xì)胞橫分裂成為2個(gè)細(xì)胞 的幼孢子體；在溫度10°C、照度2000Lx條件下幼孢子體進(jìn)行旺盛的的細(xì)胞縱橫分裂，藻體 長度快速增加，培養(yǎng)20天后達(dá)到1mm以上，已肉眼可見，培養(yǎng)40天后藻體長度已達(dá)到4 6mm以上，成為無菌海帶幼苗；亦可將外購的海帶幼苗經(jīng)消毒海水漂洗、浸泡為無菌海帶幼 苗。將長度4 6mm的無菌海帶幼苗鋪在滅菌的載玻片上自柄部將假根切下，再將幼苗葉片 移到燒瓶中并添加培養(yǎng)液，將燒瓶靜置于溫度20°C、照度2000Lx條件下培養(yǎng)，光照時(shí)間為 12小時(shí)/日，培養(yǎng)液每10天全量交換1次。切去假根的葉片失去極性，脫離藻體束縛的體 細(xì)胞向多方向分裂使葉片失去原來的形態(tài)呈多角形。切去假根15天后觀察，可見葉片部分 細(xì)胞體積增大呈圓形，細(xì)胞內(nèi)色素體增大呈褐色。培養(yǎng)20天后，可見圓形細(xì)胞長生突起并 向外延伸，經(jīng)細(xì)胞分裂后形成單列細(xì)胞的絲狀體。培養(yǎng)2 3個(gè)月，絲狀體藻團(tuán)已長成2 5mm。所述培養(yǎng)液為向1L加熱至80°C經(jīng)過濾后的自然海水中添加NaN03100mg、 NaH2P04 12H20 20mg 及 PI 溶液 1ml。PI溶液公開于西澤一俊，千原光雄。藻類研究法[M]東京共立出版株式會(huì)社， 1979 281 293.b.將長成的絲狀體藻團(tuán)從葉片上剝下，在顯微鏡下觀察，按照粗大細(xì)胞絲狀體藻 團(tuán)及細(xì)長細(xì)胞絲狀體藻團(tuán)在載玻片上切碎后分別置于不同培養(yǎng)皿中，添加培養(yǎng)液后置于溫 度10 20°C、照度2000Lx、光照12小時(shí)/日的條件下分別增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)至雌、雄配子體 長滿培養(yǎng)皿底面，用毛刷將配子體刷下，分別移到燒瓶內(nèi)添加培養(yǎng)液后可進(jìn)一步增殖培養(yǎng) 和保存。實(shí)驗(yàn)例1.取本發(fā)明實(shí)施例分離培養(yǎng)的二倍雌、雄配子體和正常單倍雌、雄配子體各 5mg(濕重)，按照2n ？ Xn $ X 2n J雜交組合混合，添加300ml培養(yǎng)液后用組織搗
碎機(jī)切碎至120 u m左右藻段，撒在纏繞維尼綸苗繩邊長15cm的苗簾上，靜置3天待配子體 附著牢固后，移到2000ml燒杯中，添加培養(yǎng)液后移到10°C、2000Lx、12小時(shí)/日溫度、光照 條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液每3天全量交換1次。2.附著在維尼綸繩上各組合雌雄配子體培養(yǎng)10天后陸續(xù)開始發(fā)育成熟，本發(fā)明 實(shí)施例的雌配子體和單倍雌配子體形成卵囊并排出卵，單倍雄配子體和本發(fā)明實(shí)施例的雄 配子體形成精子囊并放出精子，卵受精后萌發(fā)為海帶幼孢子體。經(jīng)過1個(gè)半月在室內(nèi)培育 成藻體長度5mm左右的海帶幼苗，在10月上旬將苗簾拆開，將生長幼苗的苗繩纏繞在直徑 3cm、長2m的聚乙烯繩上垂掛在海區(qū)浮筏上暫養(yǎng)。3.將藻體長度5mm左右的幼苗用醋酸酒精液固定后，用Wittman法檢查幼苗體細(xì)胞染色體數(shù)目，三倍體幼苗為66條，正常海帶為44條，三倍體幼苗的倍化率達(dá)到100 %。
4.經(jīng)過1個(gè)月左右的海區(qū)暫養(yǎng)，海帶三倍幼苗長度達(dá)到10cm以上，達(dá)到分苗標(biāo)準(zhǔn) 可分苗栽培，將幼苗從暫養(yǎng)繩上拔下，以10cm株距夾在長8m、直徑3cm栽培苗繩上后平掛在 海帶浮筏上進(jìn)入栽培階段，至第二年6月栽培為長度達(dá)到4. 8m、重量達(dá)到3. 0kg的海帶三倍 體成體。
權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)海帶幼苗體細(xì)胞產(chǎn)生二倍雌雄配子體的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行a.將長度4～6mm的無菌海帶幼苗鋪在滅菌的載玻片上自柄部將假根切下，再將幼苗葉片移到燒瓶中并添加培養(yǎng)液，將燒瓶靜置于溫度20℃、照度2000Lx條件下培養(yǎng)，光照時(shí)間為12小時(shí)/日，培養(yǎng)液每10天全量交換1次，培養(yǎng)2～3個(gè)月；b.將長成的絲狀體藻團(tuán)從葉片上剝下，按照粗大細(xì)胞絲狀體藻團(tuán)及細(xì)長細(xì)胞絲狀體藻團(tuán)在載玻片上切碎后分別置于不同培養(yǎng)皿中，添加培養(yǎng)液后置于溫度10～20℃、照度2000Lx、光照12小時(shí)/日的條件下分別增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)至雌、雄配子體長滿培養(yǎng)皿底面，用毛刷將配子體刷下，分別移到燒瓶內(nèi)添加培養(yǎng)液后保存。所述培養(yǎng)液為向1L加熱至80℃經(jīng)過濾后的自然海水中添加NaNO3100mg、NaH2PO4·12H2O 20mg及PI溶液1ml。
全文摘要
本發(fā)明公開一種誘導(dǎo)海帶幼苗體細(xì)胞產(chǎn)生二倍雌雄配子體的方法，是以海帶幼苗為材料，采用切除假根的方法誘導(dǎo)其體細(xì)胞產(chǎn)生配子體，由于幼苗是二倍體，所產(chǎn)生的雌雄配子體為二倍雌配子體和二倍雄配子體。因所產(chǎn)生的配子體與其來源藻體具有相同遺傳性狀，可與不同品種海帶的正常單倍雌雄配子體雜交獲得大量的海帶三倍體幼苗，自交則可產(chǎn)生海帶四倍體幼苗，其倍化率可達(dá)100％，經(jīng)海區(qū)暫養(yǎng)和分苗后在浮筏上栽培為海帶多倍體成體。多倍體海帶將用于發(fā)育的能量轉(zhuǎn)化為生長，生長速度快，可大幅度延長生長周期，商品海帶個(gè)體大、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。
文檔編號(hào)A01G33/00GK101940156SQ20101023947
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者張澤宇, 曹淑青, 李曉麗, 由學(xué)策 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)