專利名稱：建立可控突變率突變庫的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及建立可控突變率突變庫的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌，是一種對(duì)害蟲毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對(duì)16個(gè)目3000多種害蟲有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)，也稱 δ -內(nèi)毒素(delta-endotoxin) [Bravo. Α. , Gill S. S.，Soberon Μ. Bacillus thuringiensis Mechanisms and Use. Comprehensive Molecular Insect Science Elsevier, 2005,175 206.]，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系[Schn印f. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775_806.]。從 1981 年，Schn印f 和 Whiteley 克隆了第一個(gè)編碼 S -內(nèi)毒素的crylAal基因，截止2008年6月已發(fā)現(xiàn)和克隆了 412種ICPs基因。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、對(duì)人畜無害[DeMaagd R. A. ,Bravo A. ,Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world. Trends Genet, 2001,17 :193 199.]，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。但隨著Bt制劑的大量使用及轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植，靶標(biāo)昆蟲逐漸產(chǎn)生抗性， 繼續(xù)從自然界中分離具有高毒力的新型Bt cry基因難度不斷增加，通過分子設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)工程等新的技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的Cry毒素進(jìn)行改造成為了研究熱點(diǎn)。但目前尚沒有一個(gè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)Cry蛋白的定向進(jìn)化。定點(diǎn)突變和結(jié)構(gòu)域互換，需要在已知?dú)⑾x晶體蛋白蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的前提下進(jìn)行設(shè)計(jì)；通過隨機(jī)突變和基因重組建立突變庫，突變率和重組率難于控制，導(dǎo)致突變體少，無有益突變，或者突變庫龐大，無法進(jìn)行生物活性測定。因此，建立一個(gè)突變率可控的cry蛋白定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)于獲得高毒力的cry基因具有重要意義。2000年，本實(shí)驗(yàn)室的宋福平等人從Bt菌株Bt c007中克隆了一種新類型的cryll 基因。crylle基因(專利號(hào)CN1401772)該基因編碼分子量為81kD的蛋白質(zhì)，由719個(gè)氨基酸組成(Song et al.，2003)。作為國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Bt模式cry基因，crylle對(duì)玉米螟、小菜蛾等鱗翅目害蟲活性較高，與目前全球廣泛商業(yè)化應(yīng)用的CrylA等蛋白無交互抗性，現(xiàn)在正在用于國內(nèi)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的研制，具有良好的應(yīng)用前景。但CrylIe蛋白的毒力與實(shí)際應(yīng)用仍有一定差距。因此，通過分子設(shè)計(jì)的方法提高CrylIe對(duì)鱗翅目害蟲活性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域中的不足，依據(jù)Taq DNA聚合酶在合成堿基時(shí)的固有誤差和突變特性，建立一種突變率可控的隨機(jī)突變文庫的方法。通過對(duì)蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白CrylIe的定向進(jìn)化進(jìn)行的研究，得到活性顯著提高的突變株，并且占整個(gè)突變體庫的 13. 16%。針對(duì)高毒力突變株突變位點(diǎn)人工合成的突變體，殺蟲活性是來突變CrylIe的 1000 倍。建立可控突變率突變庫的方法，步驟如下A、確定突變條件(1)確定替換率將起始模板進(jìn)行梯度稀釋，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，最低濃度的指數(shù)擴(kuò)增最大循環(huán)數(shù)下可以得到最多的突變體；挑取最低濃度下的若干克隆測序，得到每個(gè)克隆平均突變堿基數(shù)，按式(I)計(jì)算替換率，替換率=每個(gè)克隆平均突變堿基數(shù)/(突變目的片段堿基數(shù)X最大循環(huán)數(shù))；(I)(2)確定預(yù)替換堿基數(shù)目所需的指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Cl、C2、C3......，按式(II)計(jì)
算循環(huán)數(shù)=預(yù)期替換堿基數(shù)目/(突變目的片段堿基數(shù)X替換率)(II)其中Cl、C2、C3分別代表預(yù)替換堿基數(shù)目為1、2、3時(shí)所需指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，(3)確定所需起始模板量實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增處于指數(shù)擴(kuò)增的最大循環(huán)數(shù)與
步驟⑵中確定的循環(huán)數(shù)C1、C2、C3......相比較，最接近的該P(yáng)CR擴(kuò)增所用模板量確定為
所需起始模板量T1、T2、T3......其中Tl、Τ2、Τ3分別代表預(yù)替換堿基數(shù)目為1、2、3時(shí)PCT擴(kuò)增所需起始模板量，B、可控突變率突變庫的建立按照確定的循環(huán)數(shù)Cl、C2、C3......和對(duì)應(yīng)確定
的起始模板量Tl、Τ2、Τ3......，將起始模板PCR擴(kuò)增得到可控突變率突變庫Li、L2、
L3......，所述L1、L2、L3分別代表平均替換堿基數(shù)為1、2、3的突變庫。所述起始模板為含有編碼CrylIe蛋白的核苷酸片段的載體。所述起始模板為含有編碼CrylIe蛋白的核苷酸片段的質(zhì)粒。所述質(zhì)粒為pAclIe，由pUC19克隆載體，crylAc啟動(dòng)子，crylle基因全長組成。所述預(yù)期替換堿基數(shù)目為1、2、3，可控突變率突變庫為L1、L2、L3。上述方法得到的可控突變率突變庫Li、L2、L3.......上述突變庫中的突變體，所述突變體的核苷酸序列為SEQ ID N01，其氨基酸序列為 SEQ ID N012 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN02，多1；氨基酸t(yī)序列為 SEQ ID N013 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN03，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N014 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN04，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N015 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN05，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N016 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN06，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N017 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN07，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N018 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN08，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N019 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN09，多1；氨基酸？序列為 SEQ ID N020 ；
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN010,其氨基—f 序列為 SEQ ID N021
或突變體的核苷酉I序列為SEQIDNOl 1，其氨基—f 序列為 SEQ ID N022。 一個(gè)人工突變體，其氨基酸序列為將上述任一兩個(gè)以上突變體中的氨基酸的替換位疊加后得到。所述人工突變體的其氨基酸序列為SEQ ID N024 ；其核苷酸序列為SEQ ID N023, 或者其氨基酸序列為SEQ ID N026，核苷酸序列為SEQ ID N025 ；其氨基酸序列為SEQ ID N028，核苷酸序列為SEQ ID N027。上述突變體在殺害鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明依據(jù)Taq DNA聚合酶在合成堿基時(shí)的固有誤差和突變特性，針對(duì)預(yù)期替換不同堿基數(shù)目，建立了一種突變率可控的突變文庫。采用本發(fā)明方法建立的文庫Li、L2、 L3……是按堿基突變數(shù)目的不同來區(qū)分的，因此可以根據(jù)客戶的需求來定制不同堿基突變數(shù)目的文庫，使突變文庫的適應(yīng)性和目的性增強(qiáng)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于Cry蛋白，獲得活性提高的突變體，關(guān)鍵點(diǎn)在于如何選擇合適的突變頻率，一般有益突變的頻率很低，絕大多數(shù)突變是有害的。突變頻率過高，會(huì)導(dǎo)致無義突變；突變頻率偏低，則野生型將占據(jù)突變?nèi)后w的優(yōu)勢，很難篩選到理想的突變體。根據(jù)本發(fā)明建立可控突變文庫的方法，計(jì)劃建立3個(gè)低的、不同堿基替換率的隨機(jī)突變庫，分別是文庫I含1個(gè)堿基的替換；文庫II含2個(gè)堿基的替換；文庫III含3個(gè)堿基的替換；隨機(jī)挑選100個(gè)單克隆測序，總計(jì)得到，文庫I中的平均突變堿基為0. 86個(gè)，文庫II中的平均突變堿基個(gè)數(shù)為2. 1個(gè)，文庫III中平均突變堿基個(gè)數(shù)為2. 79個(gè)，3個(gè)文庫中平均突變堿基個(gè)數(shù)符合預(yù)期設(shè)計(jì)，表明本發(fā)明建立可控突變率突變文庫的方法是可行的。本發(fā)明的實(shí)施例中雖然采用的是CrylIe蛋白來說明本發(fā)明建立突變文庫的方法，但從上面敘述的原理來看，它采用的是Taq DNA聚合酶在合成堿基時(shí)的固有誤差和突變特性來實(shí)現(xiàn)的，因此對(duì)于其它核苷酸片段來說，同樣是可以適用的。本發(fā)明的實(shí)施例得到的突變文庫中，活性顯著提高的突變株(其核苷酸序列如 SEQ ID而1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)，高毒力突變株占整個(gè)突變庫的11.96%，其中文庫 III高毒力突變株的比例達(dá)到13. 16%，表明該隨機(jī)突變文庫的方法篩選到活力顯著提高的突變株的幾率很高；針對(duì)高毒力突變株突變位點(diǎn)人工合成的突變體(其核苷酸序列如 SEQ ID N023)，殺蟲活性是未突變CrylIe蛋白的1000倍。


圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增/循環(huán)2隨機(jī)突變文庫建立流程3文庫I、II、III中的平均突變率圖4突變文庫蛋白表達(dá)分析其中1.未突變的CrylIe ；2. pUC19載體；B. BSA ；3-7為突變文庫中的單克隆蛋白圖5合成序列蛋白表達(dá)分析B. BSA ；1. pUC19 載體；2. MSll 蛋白；3. M157&667 蛋白；4. M157&311 蛋白
具體實(shí)施例方式1確定突變條件1. 1突變率的測定取1 μ 1質(zhì)粒pAclIe (pUC19克隆載體，cry IAc啟動(dòng)子，cry lie基因)經(jīng)微量分光光度計(jì)NaroDrop定量，濃度為290ng/μ 1。進(jìn)行梯度稀釋，分別取1 μ 1，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系2 X Taq DNA polymerase Mix10 μ 1上游引物(10μ Μ)1μ 1下游引物(10μ Μ)1μ 120 X SYBRGreenI1 μ 1模板1 μ 1ddH20to 20 μ 1反應(yīng)條件94°C5min
權(quán)利要求
1.建立可控突變率突變庫的方法，步驟如下A、確定突變條件(1)確定替換率將起始模板進(jìn)行梯度稀釋，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，最低濃度的指數(shù)擴(kuò)增最大循環(huán)數(shù)下可以得到最多的突變體；挑取最低濃度下的若干克隆測序，得到每個(gè)克隆平均突變堿基數(shù)，按式(I)計(jì)算替換率，替換率=每個(gè)克隆平均突變堿基數(shù)/(突變目的片段堿基數(shù)X最大循環(huán)數(shù))；(I)(2)確定預(yù)替換堿基數(shù)目所需的指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Cl、C2、C3......，按式(II)計(jì)算循環(huán)數(shù)=預(yù)期替換堿基數(shù)目/(突變目的片段堿基數(shù)X替換率)(II)其中C1、C2、C3分別代表預(yù)替換堿基數(shù)目為1、2、3時(shí)所需指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，(3)確定所需起始模板量實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增處于指數(shù)擴(kuò)增的最大循環(huán)數(shù)與步驟⑵中確定的循環(huán)數(shù)C1、C2、C3......相比較，最接近的該P(yáng)CR擴(kuò)增所用模板量確定為所需起始模板量T1、T2、T3......其中Tl、Τ2、Τ3分別代表預(yù)替換堿基數(shù)目為1、2、3時(shí)PCT擴(kuò)增所需起始模板量，B、可控突變率突變庫的建立按照確定的循環(huán)數(shù)Cl、C2、C3......和對(duì)應(yīng)確定的起始模板量Τ1、Τ2、Τ3......，將起始模板PCR擴(kuò)增得到可控突變率突變庫L1、L2、L3......，所述Li、L2、L3分別代表平均替換堿基數(shù)為1、2、3的突變庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述起始模板為含有編碼 CrylIe蛋白的核苷酸片段的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述起始模板為含有編碼 CrylIe蛋白的核苷酸片段的質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述質(zhì)粒為pAclIe，由pUC19 克隆載體，crylAc啟動(dòng)子，crylle基因全長組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的建立可控突變率突變庫的方法，所述預(yù)期替換堿基數(shù)目為1、 2、3，可控突變率突變庫為L1、L2、L3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述方法得到的突變庫Li、L2、L3.......
7.權(quán)利要求6所述的突變庫中的突變體，所述突變體的核苷酸序列為SEQID N01，其氨基酸序列為SEQ IDN012 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN02，多1；氨基酸？序列為SEQIDN013 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN03，多1；氨基酸i序列為SEQIDN014 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN04，多1；氨基酸i序列為SEQIDN015 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN05，多1；氨基酸i序列為SEQIDN016 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN06，多1；氨基酸i序列為SEQIDN017 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN07，多1；氨基酸i序列為SEQIDN018 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN08，多1；氨基酸i序列為SEQIDN019 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN09，多1；氨基酸？序列為SEQIDN020 ；或突變體的核苷酉I序列為SEQIDN010,其氨基—f 序列為 SEQ ID N021或突變體的核苷酉I序列為SEQIDNOl 1，其氨基—f 序列為 SEQ ID N022。
8. —個(gè)人工突變體，其氨基酸序列為將權(quán)利要求7的突變體中的任一兩個(gè)以上氨基酸的替換位疊加后得到。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的人工突變體，其氨基酸序列為SEQID N024;其核苷酸序列為 SEQ ID N023，或者其氨基酸序列為SEQ ID N026，核苷酸序列為SEQ ID N025 ；其氨基酸序列為SEQ ID N028，核苷酸序列為SEQ ID N027。
10.權(quán)利要求7、8、9任一突變庫中的突變體或是人工突變體在殺害鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及“建立可控突變率突變庫的方法與應(yīng)用”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明依據(jù)TaqDNA聚合酶在合成堿基時(shí)的固有誤差和突變特性，針對(duì)預(yù)期替換不同堿基數(shù)目，確認(rèn)其循環(huán)數(shù)和起始模板量，建立了一種突變率可控的突變文庫。因此可以根據(jù)客戶的需求來定制不同堿基突變數(shù)目的文庫，使突變文庫的適應(yīng)性和目的性增強(qiáng)。本發(fā)明采用CrylIe蛋白建立的突變文庫中，活性顯著提高的突變株占整個(gè)突變庫的11.96％，其中文庫III高毒力突變株的比例達(dá)到13.16％，表明該隨機(jī)突變文庫的方法篩選到活力顯著提高的突變株的幾率很高；針對(duì)高毒力突變株突變位點(diǎn)人工合成的突變體，殺蟲活性是未突變CrylIe蛋白的1000倍。
文檔編號(hào)A01P7/04GK102345172SQ20101024255
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者劉明, 宋福平, 張 杰, 束長龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所