專利名稱：一種堅強芽孢桿菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于益生菌領域，具體涉及一種堅強芽孢桿菌菌株及其應用。
背景技術：
抗生素的發(fā)現(xiàn)促進了人類醫(yī)學的巨大進步，抗生素也是動物養(yǎng)殖業(yè)尤其是水產養(yǎng) 殖業(yè)抗菌治病的首選藥物。但隨著高密度、集約化、規(guī)?；⒐S化養(yǎng)殖模式的迅速發(fā)展，病 害大量傳播、抗生素肆意濫用、養(yǎng)殖環(huán)境惡化、病原耐藥性增強、養(yǎng)殖動物藥物殘留等問題 也日益為人們所關注。開拓和發(fā)展符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的病害防治技術和產品 已經成為水產養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。拮抗是微生物之間普遍存在的自然現(xiàn)象。在同一生態(tài)位中微生物通過營養(yǎng)競爭、 空間競爭或分泌抗生素、細菌素等毒素抑制其他微生物的生長。微生物控制技術便是應用 這一原理，將具有拮抗特性的益生菌添加到飼料中或直接施入養(yǎng)殖水體，殺死或抑制病原 微生物，可為養(yǎng)殖動物營造良好的生存環(huán)境。益生菌作為抗生素的替代品，對養(yǎng)殖產品無毒 副作用、無殘留和抗藥性，提高了水產動物生產性能和健康水平，保證水產品質量及促進水 產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，能夠獲得較好的社會效益和經濟效益。目前雖然許多商品益生菌制劑也用于水產養(yǎng)殖，但其菌株多來源于陸生環(huán)境或動 物，并不適合在水產動物消化道和養(yǎng)殖水體中增殖，因此在篩選益生菌應著重考慮養(yǎng)殖水 體和動物消化道中的土著菌。芽孢桿菌(Bacillus sp.)屬于芽孢桿菌科，廣泛分布于海水 養(yǎng)殖內外環(huán)境中，芽孢桿菌屬細菌對水產動物極少有致病性，是較好的益生菌候選菌株。芽 孢桿菌具有較強的腸道粘附能力，不僅能降低腸道內NH3濃度、促進淀粉和纖維素的分解， 還能產生抗菌肽、提高宿主動物的免疫活性。此外，芽孢桿菌能夠生存于高溫和干燥等惡劣 環(huán)境，是一種耐酸、耐鹽、耐高溫和耐擠壓的高穩(wěn)定性細菌。目前應用較多的有枯草芽孢桿 菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. Iincheniformis)、蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)、堅強芽 孢桿菌(B. firmus)等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種堅強芽孢桿菌菌株及其應用，即來源于對蝦消化道的一 種內源性的堅強芽孢桿菌菌株，該菌株可用于增強對蝦細胞和體液的免疫水平，特別是提 高對蝦抗病毒感染能力。本發(fā)明所涉及的菌株信息如下堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus) SSL065菌株分離自健康中國對蝦消化道，經高 劑量注射或投喂實驗確定對中國對蝦(Penaeus chinensis)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、日本對蝦(Penaeus japonicus)等安全，無病原性。菌株于2010年7月30日 在武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 2010192。堅強芽孢桿菌SSL065菌株的形態(tài)特征菌落特征在普通營養(yǎng)平板上菌落近圓形，較平坦，呈淡灰黃色、半透明、表面較濕潤、較光滑、邊緣裂片狀。TCBS培養(yǎng)基上可生長，菌落呈綠色，在副溶血弧菌檢測培養(yǎng)基上不 生長。細胞特征革蘭氏染色陽性，桿狀，兩端稍鈍圓，無莢膜，大小為 0. 6-0. 7ymX0. 8-1. 0 μ m，周生鞭毛。芽孢特征卵圓形，近中生，孢囊不膨大。堅強芽孢桿菌SSL065菌株的生理生化特征堅強芽孢桿菌SSL065菌株的β -半乳糖苷酶反應ONPG陰性，精氨酸雙水解酶反 應ADH陰性，賴氨酸脫羧酶反應LDC陰性，鳥氨酸脫羧反應ODC陰性，檸檬酸利用CIT陰性， H2S產生H2S陰性，脲酶反應URE陰性，色氨酸脫氨酶反應TDA陰性，吲哚產生IND陰性，3-羥 基丁酮產生乙酰甲基甲醇反應VP陽性，明膠酶反應GEL陽性，葡萄糖反應GLU陰性，甘露醇 反應MAN陰性，肌醇反應INO陰性，山梨醇反應SOR陰性，鼠李糖反應RHA陰性，蔗糖反應SAC 陰性，蜜二糖反應MEL陰性，苦杏仁苷反應AMY陰性，阿拉伯糖反應ARA陰性，N2O產生陰性， 還原到N陰性。氧化酶實驗陰性，過氧化氫酶實驗陽性。三糖鐵瓊脂實驗無顏色變化，不產堅強芽孢桿菌SSL065菌株的16rDNA堿基序列如SEQ ID NO 1所示。堅強芽孢桿菌SSL065菌株可用于制備堅強芽孢桿菌SSL065菌粉堅強芽孢桿菌SSL065菌粉制備方法如下從_8(TC保存的菌種挑取少量劃線于 2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于堅強芽孢桿菌種子培養(yǎng) 液中，37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于堅強芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)， 發(fā)酵溫度控制在30-38°C ；當發(fā)酵液0D600值達到1. 5 2. 0時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液。 取發(fā)酵菌液離心濃縮80-100倍制得菌泥，在菌泥中加入質量比為6%的市售海藻糖保護 劑，混合均勻后行冷凍干燥，制得堅強芽孢桿菌SSL065菌粉，其中堅強芽孢桿菌SSL065活 菌濃度達彡IO12CFU/克。其中，堅強芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液成分質量百分比為糊精1.5%，蛋白胨0.5%， 硫酸亞鐵0. 05%。，pH值為5. 7。堅強芽孢桿菌的發(fā)酵液成分質量百分比為蛋白胨0.5%，酵母提取物0. 1%，硫 酸亞鐵0. 02%O本發(fā)明的堅強芽孢桿菌SSL065菌株可直接施用于對蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中，也可以添 加到對蝦飼料原料中，堅強芽孢桿菌SSL065菌粉，用于增強對蝦細胞和體液的免疫水平。本發(fā)明的堅強芽孢桿菌SSL065菌株篩選自對蝦消化道，是一種內源性的菌株，具 有維護對蝦消化道良好微生態(tài)平衡，促進對蝦對飼料的消化能力，提高對蝦非特異性免疫 水平，增強養(yǎng)殖對蝦抗病原菌感染力，特別是可以顯著提高對蝦抵御病毒病原感染能力等 多種生物學功能。
具體實施例方式實施例1 堅強芽孢桿菌SSL065菌粉制備堅強芽孢桿菌SSL065菌粉制備方法如下從_8(TC保存的菌種挑取少量劃線于 2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落后接種于種子液中搖瓶培養(yǎng)，再把種子液接種于發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在30-38°C ；當發(fā)酵液0D600值達到1. 5 2. 0時， 終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液。取發(fā)酵液進行離心濃縮80-100倍制得菌泥，在菌泥中加入質量 比為6%海藻糖保護劑，混合均勻后進行冷凍干燥，制得活菌濃度高于IO12CFU/克的堅強芽 孢桿菌SSL065菌粉。實施例2 堅強芽孢桿菌SSL065菌粉的應用將制得的堅強芽孢桿菌菌粉20克和輔助保護載體玉米淀粉75克均勻混合制成復 合益生菌制劑。將該復合益生菌制劑添加在基礎對蝦飼料10公斤中(含魚粉30%、蝦粉10%、豆 粉25 %、花生粉25 %、面粉3 %、玉米粉3 %、復合維生素1 % )，配制成含復合益生菌制劑的 免疫飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，準確稱重后逐級充分混勻，以褐藻酸鈉作為粘合 劑，加適量水用小型絞肉機擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘干至水分含量10%以下， 分袋包裝，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩＝】捣布{濱對蝦600余尾，實驗對蝦初始體長為(5. 70 士 1. 18) cm,隨機為實驗組 和對照組2個處理組，每個處理組有3個平行，每個平行組放養(yǎng)對蝦60尾。每日換水1次， 日換水量為1/3 ；每日投喂飼料4次，日投餌量約為0. 9-1. 2克/10尾，投喂Ih后吸去剩余 飼料，并根據殘餌的多少調節(jié)投餌量；其中免疫實驗組采用間隔投喂方法，即連續(xù)4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎飼料，7天一個循環(huán)，直至實驗結束。水溫24-26°C，連續(xù)充氣，實驗 前暫養(yǎng)7d。對照組在整個實驗階段一直投喂基礎飼料。分別在0、5、10、15和20d進行取 樣，測定抗病微生物制劑對凡納濱對蝦非特異性免疫水平的影響。結果顯示與對照組相 比，抗病微生物制劑經口服可顯著提高對蝦血清中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧 化酶和溶菌酶等免疫相關酶的活性，即提高了對奸的免疫水平。
權利要求
1.堅強芽孢桿菌(Bacillusf irmus) SSL065 菌株，保藏編號為CCTCC M2010192。
2.如權利要求1所述的堅強芽孢桿菌SSL065菌株，其16srDNA堿基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.權利要求1所述的堅強芽孢桿菌SSL065菌株，用于制備堅強芽孢桿菌SSL065菌 粉，制備步驟如下將-80°C保存的堅強芽孢桿菌SSL065菌種劃線于2216E固體培養(yǎng)基， 在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于堅強芽孢桿菌種子培養(yǎng)液中，37°C搖瓶 培養(yǎng)獲得種子液，再把種子液接種于堅強芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在 30-380C ；當發(fā)酵液0D_值達到1. 5 2. 0時，終止發(fā)酵獲得發(fā)酵菌液；取發(fā)酵菌液進行離 心濃縮80-100倍制得菌泥，在菌泥中加入質量比為6%的海藻糖保護劑，混合均勻后進行 冷凍干燥即制成堅強芽孢桿菌SSL065菌粉。
4.如權利要求3所述的制備堅強芽孢桿菌SSL065菌粉，其特征在于上述的堅強芽孢 桿菌種子培養(yǎng)液成分質量百分比為糊精1.5%，蛋白胨0.5%，硫酸亞鐵0. 05%。，pH值為 5. 7。
5.如權利要求3所述的制備堅強芽孢桿菌SSL065菌粉，其特征在于上述的堅強芽孢桿 菌發(fā)酵液成分質量百分比為蛋白胨0. 5%，酵母提取物0. 1%，硫酸亞鐵0. 02%。。
6.權利要求3所述的堅強芽孢桿菌SSL065菌粉，用于增強對蝦細胞和體液的免疫水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種堅強芽孢桿菌菌株及其應用。其特征在于堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)SSL065菌株，保藏編號為CCTCC M 2010192。該菌株制備的堅強芽孢桿菌SSL065菌粉，可用于增強對蝦細胞和體液的免疫水平。本發(fā)明的堅強芽孢桿菌SSL065菌株篩選自對蝦消化道，是一種內源性的菌株，具有明顯的提高養(yǎng)殖對蝦非特異性免疫水平，大大增強養(yǎng)殖對蝦抗病原菌感染力，特別是可以顯著提高對蝦抵御病毒病原感染能力等多種生物學功能。
文檔編號A23K1/16GK101993843SQ20101025491
公開日2011年3月30日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權日2010年8月17日
發(fā)明者劉莉, 宋曉玲, 楊冰, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所