專(zhuān)利名稱(chēng)：防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病害是影響農(nóng)業(yè)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的主要因素之一，每年農(nóng)業(yè)上因病害 而造成的損失占到總產(chǎn)值20%左右，每年因病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50億以上，長(zhǎng)期 以來(lái)都是使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但化學(xué)農(nóng)藥一直存在著耐藥性、污染環(huán)境、農(nóng)藥殘留、生 物多樣性降低、人畜毒害等諸多無(wú)法克服的弊端。生物農(nóng)藥由于其對(duì)人畜毒性小，環(huán)境兼容性好，病蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)而符合 現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)藥的要求，具有廣闊的發(fā)展空間。絕大多數(shù)生產(chǎn)生物農(nóng)藥的菌 株是從植物根際土壤微生物中分離篩選得到，由于這些土壤生防菌易受外界環(huán)境條件的影 響，在與土壤、植物根際或葉圍習(xí)居微生物的競(jìng)爭(zhēng)中不易長(zhǎng)期定殖并占優(yōu)勢(shì)，防病效果不理 想，因而極大地影響了它們的實(shí)際防病效果。植物內(nèi)生細(xì)菌是一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物豐富、應(yīng)用前景廣闊的資源微生物，具有在植 物體內(nèi)快速定殖、傳導(dǎo)和繁殖功效，許多內(nèi)生細(xì)菌具有固氮、促生、抗旱、防病等生物學(xué)功 能，內(nèi)生細(xì)菌作為潛在的生防資源，可以彌補(bǔ)土壤來(lái)源的生防菌田間防效不穩(wěn)定的缺陷，是 最具發(fā)展?jié)撃艿男滦蜕谰辍?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，它為防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌 TF28，為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4038，保藏日 期為2010年7月26日；防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28為革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，為 桿狀，長(zhǎng)為1. 5 μ m 2. 5 μ m，寬為0. 5 μ m 1. 5 μ m，內(nèi)生芽孢，無(wú)鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊，菌落中心突起呈脊?fàn)?。本發(fā)明中防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28葡萄糖發(fā)酵試樣陽(yáng)性、淀粉水 解試驗(yàn)陽(yáng)性、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性、V. P反應(yīng)陽(yáng)性、接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性、甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性、硝酸鹽 還原試驗(yàn)陽(yáng)性、檸檬酸鹽利用陽(yáng)性、好養(yǎng)生長(zhǎng)、生長(zhǎng)PH值為6. 5 8. 5，生長(zhǎng)溫度為30 37 °C。本發(fā)明中防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，菌株號(hào)為T(mén)F28，為解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4038，保藏日期為2010年7月26日。防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用一、取-70°C冷凍保存的防病促生植 物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28的菌液，劃線(xiàn)接種于LB固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱中培養(yǎng) 18 20h，挑取單菌落接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)18 20h，得到活化菌液；二按2% 5%接種量將活化菌液接種于裝有100ml NYD培養(yǎng)液的500ml三角瓶中， 30°C培養(yǎng)32 50h，轉(zhuǎn)速為150 250r/min，發(fā)酵結(jié)束菌液濃度達(dá)到20 40億/ml，即為 防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28菌株發(fā)酵液；三、待防治的種子預(yù)先用水浸泡5 7d,再浸泡于防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28菌株發(fā)酵液的50倍稀釋液中2d即完 成種子的防病。本發(fā)明防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28，是從大豆根部分離的對(duì)大豆根腐 病、水稻惡苗病等多種植物病原真菌具有較高防效的生防菌株，具有在大豆、水稻等多種作 物根部定殖能力，是一株極具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值的生防菌株。本發(fā)明中菌株TF28能在植物體內(nèi)定殖、繁殖和傳導(dǎo)，該菌株可以同時(shí)產(chǎn)生抗菌蛋 白和脂肽類(lèi)抗生素兩種抗菌物質(zhì)，具有防病促生、增產(chǎn)提質(zhì)、抑菌譜廣等多重功效；本發(fā)明防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用中，制劑生產(chǎn)成本低廉，操作簡(jiǎn) 單，易于實(shí)施，可批量生產(chǎn)和推廣應(yīng)用；菌株TF28的菌劑有利于保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，減少農(nóng) 藥殘留，適合于我國(guó)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的要求；采用菌株TF28發(fā)酵液的50倍稀釋液處理水 稻種子，對(duì)水稻惡苗病溫室防效達(dá)到84. 6%以上，同時(shí)，對(duì)三種大豆根腐病菌(鐮刀菌根腐 病、腐霉根腐病和疫霉根腐病)、黃瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病 菌、辣椒早疫病菌、大豆菌核病菌、黃瓜立枯病菌、水稻惡苗病菌、水稻稻瘟病菌均具有較強(qiáng) 抑制作用。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，它為防病促生 植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28，為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens，屬于芽 孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編 號(hào)為CGMCC No.4038，保藏日期為2010年7月26日；防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌 TF28為革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，為桿狀，長(zhǎng)為1. 5 μ m 2. 5 μ m，寬為0. 5 μ m 1. 5 μ m，內(nèi)生芽 孢，無(wú)鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊，菌落中心突起呈 脊?fàn)?。本?shí)施方式中防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌是根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初 步判定為芽孢桿菌屬，然后經(jīng)過(guò)SHERLOCK微生物系統(tǒng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28抑菌譜采用對(duì)峙培養(yǎng)方法確定菌株抑 菌譜，供試病原菌有12種，為F. oxysporum soybean (引起大豆根腐病的尖孢鐮孢菌)、 Rhizoctonia solani soybean (引起大豆根腐病的立枯絲核菌)、Phythium spp.(引起大豆 根腐病的腐霉菌)> F. oxysporum cucumber (黃瓜枯萎病菌)、F. oxysporum melonis (舌甘瓜 枯萎病菌)、Fusarium oxysporum niveum(西瓜枯萎病菌)、Botrytis cinerea tomato (番 爺灰霉病菌)、Alternaria solani pepper (辣椒早疫病菌)、Sclerotinia sclerotiorum soybean(大豆Tift亥病菌)、Fusariummoniliforme sheld(水稻惡苗病菌)、Pyricularia oryzae cay.(水稻稻癌病菌)和R. solani cucumber (黃瓜立枯病菌)，取一環(huán)活化菌液十 字劃線(xiàn)于PDA平板上，在距接種線(xiàn)3cm處接種病原菌(菌塊直徑5mm) 28°C培養(yǎng)7d，測(cè)量抑 菌帶寬度，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，可見(jiàn)菌株TF28對(duì)上述病原菌均具有較強(qiáng)抑制作用，抑菌帶 寬度為8. 4mm 15. 2_。
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表 權(quán)利要求
防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，其特征在于它為防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28，為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.4038，保藏日期為2010年7月26日；防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28為革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，為桿狀，長(zhǎng)為1.5μm～2.5μm，寬為0.5μm～1.5μm，內(nèi)生芽孢，無(wú)鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊，菌落中心突起呈脊?fàn)睢?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，其特征在于防病促生 植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性、淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng) 性、V. P反應(yīng)陽(yáng)性、接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性、甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性、檸檬酸鹽利用 陽(yáng)性、好養(yǎng)生長(zhǎng)、生長(zhǎng)pH值為6. 5 8. 5，生長(zhǎng)溫度為30 37°C。
3.如權(quán)利要求1中所述防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于防病促 生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用一、取-70°C冷凍保存的防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽 孢桿菌TF28的菌液，劃線(xiàn)接種于LB固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，挑取單菌 落接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)18 20h，得到活化菌液；二按2% 5% 接種量將活化菌液接種于裝有100ml NYD培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，30°C培養(yǎng)32 50h，轉(zhuǎn) 速為150 250r/min，發(fā)酵結(jié)束菌液濃度達(dá)到20 40億/ml，即為防病促生植物內(nèi)生解淀 粉芽孢桿菌TF28菌株發(fā)酵液；三、待防治的種子預(yù)先用水浸泡5 7d,再浸泡于防病促生 植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28菌株發(fā)酵液的50倍稀釋液中2d即完成種子的防病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于步驟 一中LB固體培養(yǎng)基每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg的NaCl 和余量的水組成，pH值為7. 0 8. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于步驟 一中LB液體培養(yǎng)基每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCI和余量的水 組成，PH值為7.0 8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于步驟 二中NYD培養(yǎng)液每IOOOmL由8g牛肉膏、5g酵母膏、IOg葡萄糖和余量的水組成，pH值為 7. 0 8. O0
全文摘要
防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用，它涉及解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28，為解淀粉芽孢桿菌，屬于芽孢桿菌屬，保藏編號(hào)為CGMCC No.4038，保藏日期為2010年7月26日。應(yīng)用一、制備活化菌液；二活化菌液接種于NYD培養(yǎng)液中培養(yǎng)得菌株發(fā)酵液；三、種子浸泡于菌株發(fā)酵液的50倍稀釋液中即完成。本發(fā)明中菌株TF28能在植物體內(nèi)定殖、繁殖和傳導(dǎo)，該菌株可同時(shí)產(chǎn)生抗菌蛋白和脂肽類(lèi)抗生素兩種抗菌物質(zhì)，具有防病促生、增產(chǎn)提質(zhì)、抑菌譜廣等多重功效；采用菌株TF28發(fā)酵液的50倍稀釋液處理水稻種子，對(duì)水稻惡苗病溫室防效達(dá)到84.6％以上。
文檔編號(hào)A01N63/02GK101948771SQ201010264520
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者孟利強(qiáng), 張?jiān)坪? 張先成, 張淑梅, 李晶, 王玉霞, 趙曉宇 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所