專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花轉(zhuǎn)基因方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花基因工程，尤其涉及一種通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花的方法轉(zhuǎn)化棉花的 轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
植物基因工程是應(yīng)用重組DNA技術(shù)，將外源基因?qū)氲绞荏w植物細(xì)胞內(nèi)，使受體 植物獲得新的遺傳性狀。20世紀(jì)80年代，在細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)研究領(lǐng)域取得一 系列重大進展的基礎(chǔ)上，植物基因工程到得到了迅猛的發(fā)展。棉花是我國重要的經(jīng)濟作物， 對農(nóng)業(yè)和棉紡行業(yè)的發(fā)展具有舉足輕重的作用，但傳統(tǒng)的育種方法多限于品種間或種間的 染色體重組，具有很大的局限性。因此利用基因工程技術(shù)培育棉花新品種具有十分重要的 意義。我國棉花生物技術(shù)研究起始于20世紀(jì)70年代，近年來隨著植物轉(zhuǎn)基因研究的蓬勃 發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷改進和完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于棉花抗蟲、抗除草劑、抗病、提 高產(chǎn)量和品質(zhì)改良育種的實踐中，并得到了抗蟲、抗除草劑、抗病等轉(zhuǎn)基因新品種(系)，有 些已經(jīng)進入商品化生產(chǎn)，取得了顯著的經(jīng)濟效益和社會效益，特別是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院郭三 堆等科學(xué)家培育成功的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大面積推廣，極大地促進了我國棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展， 不僅使棉花產(chǎn)量得到了顯著提高，也大量減少了殺蟲劑的使用，充分體現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因作物在 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟與社會價值。因此，充分運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的棉花品種 上，進一步導(dǎo)入抗病蟲、抗除草劑、耐鹽堿、耐干旱等基因，獲得抗逆性優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因棉花種 質(zhì)新材料，對轉(zhuǎn)基因棉花新品種具有重要的現(xiàn)實意義。應(yīng)用于棉花的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的外源基因?qū)敕椒ê屯庠椿蛑苯訉?dǎo)入的花粉管通道法、基因槍法，這3種方 法也是應(yīng)用最廣泛的植物遺傳轉(zhuǎn)化手段。自從1987年Umbeck和Firoozababy等通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得第一個表 達外源基因的轉(zhuǎn)基因植物以來，該方法在棉花遺傳轉(zhuǎn)化中得到了迅速應(yīng)用。當(dāng)前通過各種 轉(zhuǎn)基因技術(shù)已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物，其中80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法獲得 的。該方法以轉(zhuǎn)基因低拷貝、遺傳穩(wěn)定性好、能夠轉(zhuǎn)化大片段的DNA、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點倍受 人們的關(guān)注，是目前轉(zhuǎn)化機理研究最清楚，應(yīng)用最廣泛的方法。棉花的遺傳轉(zhuǎn)化采用的是根 癌農(nóng)桿菌，為土壤喜居菌，革蘭氏染色呈陰性(李俊蘭，2002)。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移外源基因的 過程一般是(1)將目的基因?qū)刖哂兄虚g載體或二元載體。(2)將帶有目的基因的中間載 體或二元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌。(3)使農(nóng)桿菌感染寄主(受體)植物細(xì)胞或組織。(4)篩選轉(zhuǎn) 化細(xì)胞并誘導(dǎo)其再生植株。(5)對轉(zhuǎn)基因植株進行分子檢測。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移所適 用的外植體非常廣泛，包括葉片、莖段、胚軸、葉柄、子葉、幼胚或成熟種子。在棉花上常用的 為下胚軸。郭三堆等(1999)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因?qū)胫忻匏?2、泗棉3號等主栽品 種中，獲得了高抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉株。孟釗紅(2001)等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含GUS基因、 NPT基因、Bt基因的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞中，結(jié)果表明，GUS基因在轉(zhuǎn)化愈傷組織細(xì)胞有絲 分裂增殖過程中能穩(wěn)定遺傳給后代細(xì)胞。李寶平等(2001)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因融
3合tfdA基因?qū)朊藁?，獲得再生植株；焦改麗等(2002)以新陸地品種Cok-er312和晉棉 7號的IOmm側(cè)根切斷和發(fā)育8 12天的無菌苗為轉(zhuǎn)化受體材料，成功獲得了轉(zhuǎn)基因棉株。 李曉等(2002)轉(zhuǎn)化棕色棉雄性不育的恢復(fù)系“G007”，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體不存在轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化 細(xì)胞間的嵌合現(xiàn)象。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其它轉(zhuǎn)基因方法相比，具有轉(zhuǎn)化機理清楚，轉(zhuǎn)化率高，方法成熟， 簡便易行，轉(zhuǎn)移基因明確(T-DNA左右邊界之間序列)，能夠轉(zhuǎn)化大片段的DNA，轉(zhuǎn)化的外源 基因以單或低拷貝整合到植物基因組中，遺傳穩(wěn)定性好，符合孟德爾定律等特點，成為棉花 等作物常用的基因轉(zhuǎn)化方法。但是，影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的因素較多，主要有外植體類型和生理狀態(tài)、外植體是否 進行預(yù)培養(yǎng)、Vir基因活化狀況、pH值、溫度、滲透壓、肌醇濃度以及一些糖類。棉花農(nóng)桿菌 介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法，由于其轉(zhuǎn)化受體材料嚴(yán)格受基因型的限制、通過再生途徑獲得的轉(zhuǎn)基 因苗周期長、獲得轉(zhuǎn)基因苗由于其脫分化和再分化導(dǎo)致體細(xì)胞變異而突變率高等因素，制 約了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法在棉花基因工程中的應(yīng)用。花粉管通道途徑(pollen tube pathway)是周光宇等人(1978)提出DNA片段雜交 理論之后設(shè)計的自花授粉后外源DNA導(dǎo)入植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。棉花胚珠在授粉之前，珠心 是一個封閉的體系，授粉后隨花粉管的伸入，從珠孔到胚囊的一些珠心細(xì)胞退化形成一條 通道，以利于花粉管進入胚囊，外源DNA可以通過花粉管通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常 細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞從而參與到新形成的種子中。由于這些細(xì)胞不具備正常 的細(xì)胞壁，可作為天然的原生質(zhì)體，易于DNA轉(zhuǎn)化，受精后細(xì)胞DNA復(fù)制活躍，易于外源DNA 的整合。用同位素示蹤技術(shù)已經(jīng)證實外源DNA是通過花粉管通道而不是通過花粉管進入胚 囊的(龔蓁蓁，1988;黃國存，1998)。黃駿麒等(1981)應(yīng)用花粉管通道法成功地將抗病基 因?qū)敫弋a(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、感病的棉花品種中，獲得耐黃萎病、抗枯萎病的棉花3118新品種。倪萬 朝等(1998)通過花粉管通道法將Bt基因?qū)脬裘?號，選育出了我國第一批通過審定的 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GKl?；ǚ酃芡ǖ婪☉?yīng)用于棉花基因工程，不僅打破了轉(zhuǎn)化受體材料的基因型限制，無 需大型儀器設(shè)備，而且整個轉(zhuǎn)化過程在大田中實施、對轉(zhuǎn)化條件要求比較簡單、由轉(zhuǎn)基因材 料培育出新品種的周期短，可直接獲得正常種子，因此在國內(nèi)棉花遺傳轉(zhuǎn)化中得到了廣泛 的應(yīng)用。但是，該方法轉(zhuǎn)化后對子房機械損傷大，單棉鈴的得籽率較低(單棉鈴可收10粒 以下種子)，轉(zhuǎn)化效率較低(按照轉(zhuǎn)化的花朵數(shù)算，其轉(zhuǎn)化效率0. 03 % 0. 1 %左右)，工作 量大，轉(zhuǎn)化用的載體骨架結(jié)構(gòu)也整合于棉花基因組中，獲得的轉(zhuǎn)基因材料中外源DNA—般 為多拷貝，后代純合速度較慢。^ΗΙε^ (particle gun) Χ^Ι ^^φ^ (Microprojectile bombardment ； Particlebombardment ；Biolistics)。是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細(xì)胞的 一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。其基本原理是通過火藥爆炸高壓放電或高壓氣體作為動力加速帶有基因的 金屬顆粒、金?；蜴u粒，并使其進入帶壁細(xì)胞。在此過程中質(zhì)粒首先沉淀在微彈(金?；蜴u 粒)表面，結(jié)合有DNA分子的微彈經(jīng)加速而獲得足夠的動量，進而穿透植物細(xì)胞壁進入靶細(xì) 胞，隨后釋出DNA分子并隨機的整合到寄主的基因組內(nèi)。Finer和Mullen (1990)以棉花胚 性懸浮細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體最先用基因槍法將GUS和NPT II基因?qū)氲矫藁ㄖ?，成功地獲得了 轉(zhuǎn)基因棉花；吳敬音等(1994)應(yīng)用基因槍轟擊法將CPTI基因和NPT II基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到棉花莖尖分生組織，培養(yǎng)獲得卡那霉素抗性植株；劉傳亮等(2003)采用基因槍導(dǎo)入技 術(shù)將外源導(dǎo)入受體棉花品種的莖尖或莖尖分生組織，成功地育成轉(zhuǎn)基因棉花品種(系)。基因槍法由于將整個質(zhì)粒表達載體通過金屬顆粒引入細(xì)胞中，獲得的轉(zhuǎn)基因材料 外源DNA —般為多拷貝，表達載體骨架結(jié)構(gòu)序列也整合于基因組中；該方法也需要受體材 料通過組織培養(yǎng)過程獲得再生苗，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化受體材料嚴(yán)格受基因型的限制、通過再生途徑 獲得的轉(zhuǎn)基因苗周期長、獲得轉(zhuǎn)基因苗由于其脫分化和再分化引起體細(xì)胞變異而突變率 高；轉(zhuǎn)化用的金屬顆粒比較昂貴，技術(shù)成本較高。因此該方法在棉花遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較少?；ㄆ鞴俳蒉D(zhuǎn)化是一種植物原位轉(zhuǎn)基因方法，即一種不需要組織或細(xì)胞培養(yǎng)手段 而達到植物在活體而非離體狀態(tài)下的遺傳轉(zhuǎn)化方法。該方法是利用受體材料花序與農(nóng)桿菌 接觸，在活體條件下完成細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化，并通過后代篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。該方法操作簡 單、直接在大田環(huán)境條件下操作、具備了農(nóng)桿菌介導(dǎo)通過再生途徑獲得轉(zhuǎn)基因苗的遺傳轉(zhuǎn) 化方法的全部優(yōu)點，自1998年作者報道了在實驗室條件下通過浸花法成功用于擬南芥遺 傳轉(zhuǎn)化以來，該方法得到了廣泛應(yīng)用，但是在棉花遺傳轉(zhuǎn)化中未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上現(xiàn)有技術(shù)條件，本發(fā)明提供一種改進的噴花法轉(zhuǎn)化棉花的方法。該方法 參考擬南芥轉(zhuǎn)化方法，依據(jù)棉花花器官大、雌雄同花、開花后授粉等特征，對噴花法的轉(zhuǎn)化 用農(nóng)桿菌稀釋液配方、轉(zhuǎn)化時間、轉(zhuǎn)化方法方面進行優(yōu)化。轉(zhuǎn)化方法上采用大田環(huán)境條件下 將農(nóng)桿菌懸液直接噴霧于棉花花蕊上，比花器官浸泡轉(zhuǎn)化方法操作更簡便，而且也避免了 浸泡操作過程對植物造成的意外傷害。本發(fā)明提供的棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法遺傳轉(zhuǎn)化方法具體如下1)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用懸浮液稀釋至0. 3 0. 50D,所述的懸浮液含有蔗 糖和 SilwetL-77。2)在活體條件下進行轉(zhuǎn)化在大田中利用微型噴壺，將農(nóng)桿菌懸浮液噴霧于棉花 散粉前的花朵上或者雌蕊和柱頭上，利用農(nóng)桿菌將目的基因整合于棉花基因組中。待轉(zhuǎn)化 的棉鈴成熟后收取棉花種子，播種于大田，利用篩選標(biāo)記基因篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明中的農(nóng)桿菌懸浮液含有5 10%蔗糖或者5 10%蔗糖加20 50 μ L/L 的SilwetL-77，其中最關(guān)鍵的因素是蔗糖，糖的粘性能夠使農(nóng)桿菌充分棉花花器官組織細(xì) 胞相結(jié)合。加入SilwetL-77可以增加棉花花器官細(xì)胞膜的通透性，可以更好的使農(nóng)桿菌與 棉花花器官組織細(xì)胞相結(jié)合。本發(fā)明采用直接將農(nóng)桿菌懸浮液噴霧于棉花花朵上的方法，每朵花大約噴霧 400 600 μ L懸浮液。經(jīng)過霧化的農(nóng)桿菌懸浮液均勻的覆蓋于柱頭及花藥等花器官上，保 證了農(nóng)桿菌和花器官組織充分接觸，同時不會由于濕度過大而影響授粉。上述含有目的基因的農(nóng)桿菌的獲得，是將含有目的基因的質(zhì)粒植物表達載體，通 過電擊或熱擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞中。所用的植物表達載體包括但不限于PBin系列載體 (如 pBinl9 等)、pBI 系列載體(如 pBI 121 等)、Gateway 系列載體(如 pH2GW7 等)、pCAMBIA 系列載體(如PCAMBIA1302等)；所用的農(nóng)桿菌包括但不限于LBA4404、EHA105等。本發(fā)明利用改進的噴花法轉(zhuǎn)化方法，已成功獲得了棉花轉(zhuǎn)基因植株。該轉(zhuǎn)化方法 簡單、條件要求粗放、轉(zhuǎn)化周期短、工作量小、對子房無機械損傷，轉(zhuǎn)化后單棉鈴的得種率高(單個棉鈴的種子基本上都能收獲)、轉(zhuǎn)化效率高(按照所轉(zhuǎn)化的花朵算轉(zhuǎn)化效率達到 4%，按照轉(zhuǎn)化獲得的TO代種子算轉(zhuǎn)化效率達到了 0. 2 0. 3% )。該方法轉(zhuǎn)化機理 清楚，打破了受體材料的基因型限制，可以直接對棉花育種材料進行轉(zhuǎn)化，具有較大的實用 價值。


圖1是實施例中質(zhì)粒pGBIF4ABC-EPSPS。圖2是實施例中PCR檢測Tl代轉(zhuǎn)基因植株Bt基因的電泳結(jié)果。圖3是實施例中PCR檢測Tl代轉(zhuǎn)基因植株EPSPS基因的電泳結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，通過實例對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何方式限制本發(fā)明的 范圍。實施例農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法轉(zhuǎn)化獲得棉花轉(zhuǎn)基因植株一、材料與方法1)棉花材料棉花材料選用自選品種Y18R。2)菌種農(nóng)桿菌 LBA4404。3)載體pGBIF4ABC_EPSPS (圖1)。本實驗室構(gòu)建的植物表達載體，含有兩個獨立 的表達盒，啟動子均為35S Promoter，終止子為Nos。第一個表達盒編碼基因為草甘膦抗性 基因EPSPS，第二個表達盒編碼基因為Bt基因和Cpti基因的融合基因。4)工具酶和修飾酶各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶購自TaKaRa公司、NEB公司及 Fermentas 公司。5)化學(xué)試劑化學(xué)藥品均為國內(nèi)外分析純。6)引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法轉(zhuǎn)化獲得棉花轉(zhuǎn)基因植株1.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化菌液的準(zhǔn)備挑取含有質(zhì)粒pGBIF4ABC-EPSPS的農(nóng)桿菌單克隆子，接種于50mL YEB (含卡那霉 素50mg/L、鏈霉素50mg/L)液體培養(yǎng)基中，28°C 250rpm過夜培養(yǎng)。吸取過夜培養(yǎng)菌液2mL 接種于200mL YEB (含卡那霉素50mg/L、鏈霉素50mg/L)液體培養(yǎng)基中(置于IL三角瓶中)， 280C 250rpm過夜培養(yǎng)，直至OD6tltl = 0. 8 1。將培養(yǎng)好的菌液在4500rpm離心15min，棄 上清，收集沉淀，用稀釋液(含有5 10%蔗糖或5 10%蔗糖加SilwetL-77的滅菌水溶 液)重懸至OD6tltl = 0. 4 0. 5，用于植物轉(zhuǎn)化。2.植株選擇準(zhǔn)備與轉(zhuǎn)化時間選取露天生長處于盛花期，生長健壯的植株，作為轉(zhuǎn)化株。第一天下午對第二天盛 開的花用自交夾子做自交(種植于隔離區(qū)內(nèi)的受體材料可以不做自交)，然后第二日上午5 點至10點(散粉前至剛散粉)進行轉(zhuǎn)化。3.農(nóng)桿菌菌液侵染棉花花朵采用了兩種稀釋液(含有5 10%蔗糖或5 10%蔗糖加SilwetL-77的滅菌水 溶液)稀釋的農(nóng)桿菌，利用微型噴壺噴霧于棉花花朵進行轉(zhuǎn)化，每噴一次大約為200 μ L懸 浮液，每朵花噴2 3次(約400 600 μ L懸浮液)。對轉(zhuǎn)化的花朵用自交夾子隔離(種
6植于隔離區(qū)內(nèi)的受體材料可以不做隔離)，然后掛牌標(biāo)記。4. TO代種子收獲及Tl代篩選種子成熟后將TO代種子混收，播種于大田，使用卡那霉素和除草劑篩選抗性植 株。卡那霉素篩選三次，第一次為子葉期，用毛筆將lmg/mL的卡那霉素溶液涂抹于子葉上， 于3 4日后檢查子葉是否有斑點出現(xiàn)，無斑點的植株即為轉(zhuǎn)基因候選植株。第二次篩選 在2 4片真葉時期，對第一次篩選獲得的候選植株的真葉涂抹lmg/mL的卡那霉素溶液， 無斑點出現(xiàn)的植株即為轉(zhuǎn)基因候選植株。第三次篩選在5 6片真葉時期，對第二次篩選 獲得的候選植株的真葉涂抹lmg/mL的卡那霉素溶液，無斑點出現(xiàn)的植株即為轉(zhuǎn)基因候選 植株。最后將三次篩選獲得的轉(zhuǎn)基因候選植株用草甘膦除草劑篩選，沒有死亡的即為Tl代 轉(zhuǎn)基因陽性植株。5. Tl代轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR檢測對表現(xiàn)卡那霉素和草甘膦抗性的植株，PCR檢測Bt基因和EPSPS基因，基因組提 取方法采用改良的CTAB法。設(shè)計引物序列如下Bt基因引物Bt-Fp (正向引物)GCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGBt-Rp (反向引物)GTTGCAGTAACTGGAATGAACTCGEPSPS基因引物EPSPS-Fp (正向引物)GCGAAATGGGCGTGCAGGTGAAATCEPSPS-Fp (反向引物)GGCGGCGACAGCGAGAATCGG利用Bt基因引物和EPSPS基因引物以抗性轉(zhuǎn)基因植株基因組為DNA模板，擴增Bt 基因和EPSPS基因，擴增體系為模板1 μ 1 (IOpg)PCR Buffer5μ 12. 5mM dNTP3 μ 1正向引物(10μ Μ) 1μ 1反向引物(10μ Μ) 1μ 1Taq 1 μ 1 (2. 5U)ddH2 38 μ 1。PCR 條件94 "C，5min ；94 "C，45Sec ；58 "C，45Sec ；72 °C，45Sec ；30cycle ；72 °C， IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果轉(zhuǎn)化成功可檢測到 1. 8kb的Bt基因片段和500bp的EPSPS基因片段(圖2，圖3)。本實驗共進行了 3次獨立的轉(zhuǎn)基因事件，每次轉(zhuǎn)化500朵花，最后共獲得了 33株 轉(zhuǎn)基因植株。以上實驗證明，利用該方法可以對棉花進行高效的遺傳轉(zhuǎn)化，對棉花基因工程及 分子育種具有重要意義。
權(quán)利要求
棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟1)將含有目的基因的農(nóng)桿菌用懸浮液稀釋至0.3～0.5OD，所述的懸浮液含有蔗糖和SilwetL 77。2)在活體條件下進行轉(zhuǎn)化在大田中利用微型噴壺，將農(nóng)桿菌懸浮液噴霧于棉花散粉前的花朵上或者雌蕊和柱頭上，利用農(nóng)桿菌將目的基因整合于棉花基因組中。待轉(zhuǎn)化的棉鈴成熟后收取棉花種子，播種于大田，利用篩選標(biāo)記基因篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的農(nóng)桿菌懸浮液中含有 5 10%蔗糖或者5 10%蔗糖加20 50 μ L/L的SilwetL-77。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法采用 噴霧法，將農(nóng)桿菌懸浮液用微型噴壺均勻噴灑于棉花柱頭和花藥等花器官上，懸浮液每朵 花用量為400 600 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法轉(zhuǎn)化 時間為散粉前至剛散粉階段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述含有目的基因的農(nóng)桿菌的 獲得時將目的基因插入植物表達載體中，再將該表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所用的植物表達載體包括但不 限于PBin系列載體(如pBinl9等)、pBI系列載體(如pBI121等)、Gateway系列載體(如 PH2GW7 等)、pCAMBIA 系列載體(如 pCAMBIA1302 等)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所用的農(nóng)桿菌包括但不限于 LBA4404、EHA105 等。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的棉花植株為健壯的完 整開花植株，噴霧部位為棉花活體狀態(tài)下盛花期的花朵。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所用的轉(zhuǎn)化材料不僅可以是錦 葵科的棉花，還可以用于禾本科、豆科、十字花科、茄科、葫蘆科、傘型花科以及其他果樹、林 木、花卉、藥用等種子繁殖植物的遺傳轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花的轉(zhuǎn)基因方法。采用大田環(huán)境活體條件下將農(nóng)桿菌懸液直接噴霧于散粉前至散粉階段花蕊上的方法，不僅操作更簡便，同時也避免了對花器官造成的傷害，如按照出現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)/轉(zhuǎn)化花朵計算，在棉花中轉(zhuǎn)化效率可以達到10％。本發(fā)明在植物遺傳轉(zhuǎn)化、分子育種中具有重大的實際應(yīng)用價值。所用的轉(zhuǎn)化材料可以是錦葵科的棉花，也可以是水稻、玉米、小麥、大豆、油菜、黃瓜、西紅柿、煙草、果樹、林木、花卉、藥用等單、雙子葉種子繁殖的植物，在單、雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化和分子育種中具有一定的應(yīng)用價值。
文檔編號A01H5/00GK101984065SQ20101026844
公開日2011年3月9日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者孟志剛, 張銳, 石雅麗, 郭三堆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所;郭三堆