專利名稱：蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種菌類的應用，特別涉及蛭弧菌蛭質(zhì)體在制 備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用。
背景技術：
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原產(chǎn)于歐洲的一種名貴鲆鰈類，隸屬于鰈
形目，鲆科，菱鲆屬。主要分布于大西洋沿岸、北海、黑海及地中海一帶。由于它具 有適應低水溫生活，生長速度快，肉質(zhì)鮮美，容易接受人工飼料，易于集約化養(yǎng)殖等優(yōu) 點，相繼成為歐洲及南美智利等許多國家的主要養(yǎng)殖開發(fā)對象。自1992年大菱鲆被引 入我國以來，其養(yǎng)殖已從山東快速輻射到北方沿海各省，成為我國海水養(yǎng)殖的一個支柱 產(chǎn)業(yè)，取得了良好的社會和經(jīng)濟效益。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，大菱鲆的疾病 問題日漸突出，大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻繁發(fā)生，藥物殘留問題也日漸嚴重，給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè) 的健康發(fā)展帶來極為不利的影響。紅嘴病就是其中一種，給養(yǎng)殖業(yè)者造成了慘重的經(jīng)濟 損失。紅嘴病的主要癥狀表現(xiàn)為病魚吻端及腹面上頌出血，部分魚鰓蓋有出血的潰 爛小凹洞，口腔內(nèi)出血，部分病魚眼睛腫大突出、挑破外膜內(nèi)有大量膿液，腸道充血無 食物，腸道末端有少量粘稠液體，肝臟充血、色暗淡呈糜散狀，脾臟腫大發(fā)紅。在治療 過程中，養(yǎng)殖戶為追求經(jīng)濟效益，胡亂用藥等現(xiàn)象時有發(fā)生，致使農(nóng)藥殘留問題日趨嚴 重。目前，防止病害主要的方法是采用的殺菌消毒藥物，但其本身存在著諸多缺點，如 抗生素的使用導致的耐藥性及藥物殘留，2006年發(fā)生的大菱鲆呋喃類藥物藥殘事件就非 常具有代表性。因此，如何進行健康養(yǎng)殖，便成為的水產(chǎn)界亟待解決的問題。蛭弧菌是寄生于其他細菌，并能導致宿主細菌裂解的一類細菌。比一般細菌 小，能通過細菌濾器，有類似噬菌體的作用。單細胞，呈弧形或逗點狀，有時呈螺旋 狀，大小0.2-0.6X0.8-1.2微米，端生鞭毛，多為一根。革蘭氏染色呈陰性，可裂解致病 或潛在致病性細菌。蛭弧菌的生活史分兩個階段自由生活，能運動，不進行增殖的游 泳體階段和在特定宿主細菌的周質(zhì)空間內(nèi)進行生長繁殖的蛭質(zhì)體階段。蛭弧菌在游泳體 階段，識別并與宿主發(fā)生不可逆結(jié)合，然后侵入宿主。蛭弧菌蛭質(zhì)體則是蛭弧菌在特定 宿主細菌的周質(zhì)空間內(nèi)進行生長繁殖的形式。蛭弧菌進入宿主菌細胞周質(zhì)空間后，主要 通過降解宿主細胞的大分子成為單體，然后攝入用于其生物大分子的合成。隨著細胞增 殖和水解酶產(chǎn)生，使宿主細胞壁被破壞，從而裂解釋放出蛭弧菌。蛭弧菌游泳體是指蛭弧菌侵入宿主細菌前的生長形式。蛭弧菌游泳體侵入宿主 細菌的過程非常快，一般幾秒鐘內(nèi)即可完成。相對于蛭弧菌蛭質(zhì)體而言，雖然存在著 制備繁瑣、不易保存的弱點，但用蛭弧菌游泳體控制和消除養(yǎng)殖池中的致病菌具有起效 快、活力強的優(yōu)點。這些優(yōu)點使得蛭弧菌游泳體同樣適合作為抑止或清除生物體及其環(huán) 境中致病菌的生物凈化因子，從而克服了抗生素濫用帶來的副作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服魚類養(yǎng)殖中濫用抗生素導致各種食品安全問題的不足之處，本發(fā)明提 供一種蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用。所述蛭弧菌游泳體的制備方法為接種宿主于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在35°C和 200rpm搖床培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液經(jīng)4°C，5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至 DNB液體培養(yǎng)基中，接入蛭弧菌BDM01，在溫度25 35°C下，以150 300rpm搖床培養(yǎng) 36 48h，得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和蛭弧菌游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min后，上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB 液體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或0.2mol/LpH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度 為IO6 109pfo/mL的蛭弧菌游泳體菌液，該菌液即為防治大菱鲆紅嘴病菌劑。所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDMOl，于2008年4月28日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO : M208066。所述蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用是向水體中潑灑防治 大菱鲆紅嘴病菌劑，每次換水之后向水體中均勻潑灑菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體終濃 度為 10-107pfu/mL。所述蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用是將飼料用防治大菱 鲆紅嘴病菌劑浸泡15 45min，菌劑中蛭弧菌游泳體濃度為10-107pfu/mL，每天投飼料 三次，早、中、晚各一次(7:00，12:00, 17:00),每次投喂過程持續(xù)30min。日投餌量與 魚平均體重的質(zhì)量分數(shù)的4%，灑遍全池。蛭弧菌BDMO1由蛭弧菌BDJO1 (CCTCC M 208011)進行紫外誘變得到，對
其進行負染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDMOl呈單細胞，弧形，大小為 1.7X1.0ym,端生鞭毛，鞭毛長度為3.5μιη;將其以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成 直徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用能有效預 防和治療大菱鲆紅嘴病。如表1-2所示，本發(fā)明中所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中 的應用能有效降低大菱鲆患紅嘴病的概率，在治療紅嘴病上效果顯著，與常規(guī)的使用抗 生素的方法相比，它是一種綠色環(huán)保的方法。大菱鲆紅嘴病系一種細菌性疾病，細菌性疾病以氣單胞菌(Aeromonas)、假單胞 菌屬(Pseudcmmonas)、弧菌屬(Vibrio)中的某些菌種為主要病原菌。蛭弧菌具有類噬菌 體的作用，它對魚類常見致病菌有裂解作用，能起到消除水體致病菌的作用。另外，蛭 弧菌對水中的氨氮也有一定的降解作用，可以凈化水體，提高透明度，對防治魚類疾病 有一定作用。因此，蛭弧菌可用于大菱鲆紅嘴病的預防及治療。2、本發(fā)明所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用在水產(chǎn)動 物養(yǎng)殖的應用中安全性好。3、本發(fā)明所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用有效、環(huán)保、不產(chǎn)生病原菌抗性，應用前景良好。具體實施措施下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于 此。實施例1菌劑的制備使用的蛭弧菌菌株為蛭弧菌BDM01。所述蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDMOl于 2008年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 208066 ； 對其進行負染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDMOl呈單細胞，弧形，大小為 1.7X1.0ym,端生鞭毛，鞭毛長度為3.5μιη;將其以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成 直徑3-4_的透明圓形噬菌斑。在裝有IOOmL普通營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉 5g，蒸餾水lOOOmL，pH7.4)的錐形瓶中接種ImL濃度為109cfu/mL的嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila,購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.172)，200rpm、 28°C搖床培養(yǎng)18小時，培養(yǎng)液分別于4°C、5000rpm離心15min，棄上清。將沉淀加入 到裝有IOOmL DNB (dilute nutrient broth)液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物 0.5g,酵母精提物O.lg，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7.4)的錐形瓶中，再加入ImL 濃度為103pfu/mL的蛭弧菌BDM01的噬菌斑。恒溫搖床250rpm、28°C培養(yǎng)36h。培養(yǎng) 液于4°C 6000rpm離心20min，取上清液，再將上清液分別于4°C 16000rpm離心20min， 保留沉淀，加入ImL生理鹽水懸浮，可得到濃度為108pfo/mL的蛭弧菌游泳體菌劑。實施例2挑選體質(zhì)健康、個體大小均勻的幼魚，平均體重為55士2.5g，按照300尾/m2的 養(yǎng)殖密度投入池中，每個養(yǎng)殖池的實驗周期為4個月。實施例2.1正常流水(采用外排水，每晝夜換水量為8個流水量)，投放常規(guī)大菱鲆顆粒飼 料(工廠生產(chǎn)的養(yǎng)殖方式)，不加菌劑。實施例2.2每40天換一次水，投放常規(guī)大菱鲆顆粒飼料，不加菌劑。實施例2.3在水中潑灑實施例1得到菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體濃度達到lOpfu/mL，喂 食常規(guī)大菱鲆顆粒飼料，每40天換一次水后加菌。實施例2.4在水中潑灑實施例1得到的菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體濃度達到102pfu/mL， 喂食常規(guī)大菱鲆顆粒飼料，每40天換一次水后加菌。實施例2.5喂食經(jīng)實施例1得到的菌劑浸泡30min的常規(guī)大菱鲆顆粒飼料，所用菌劑中 蛭弧菌游泳體濃度達到10pfu/mL，每天投餌三次，早、中、晚各一次(7:00，12:00， 17:00),每次投喂過程持續(xù)30min。日投餌量與魚平均體重的質(zhì)量分數(shù)為4 %，灑遍全 池，每40天換一次水。實施例2.6
喂食經(jīng)實施例1得到的菌劑浸泡30min的飼料，所用菌劑中蛭弧菌游泳體濃度達 到102pfu/mL，每天投餌三次，早、中、晚各一次(7:00，12:00，17:00)，每次投喂過程 持續(xù)30min。日投餌量與魚平均體重的質(zhì)量分數(shù)為4%，灑遍全池，每40天換一次水。實施例2.7在水中潑灑實施例1得到的菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體濃度達到10pfo/mL， 每40天換一次水后加菌劑，同時喂食經(jīng)實施例1得到的菌劑浸泡30min的常規(guī)大菱鲆顆 粒飼料，每天投餌三次，早、中、晚各一次(7:00，12:00, 17:00),每次投喂過程持續(xù) 30min。日投餌量與魚平均體重的質(zhì)量分數(shù)為4%，灑遍全池。所用菌劑中蛭弧菌游泳 體濃度達到10pfu/mL。實施例2.8在水中潑灑實施例1得到的菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體濃度達到102pfu/mL， 每40天換一次水后加菌，同時喂食經(jīng)蛭弧菌游泳體浸泡30min的常規(guī)大菱鲆顆粒飼料， 每天投餌三次，早、中、晚各一次(7:00，12:00, 17:00),每次投喂過程持續(xù)30min。日 投餌量與魚平均體重的質(zhì)量分數(shù)為4%，灑遍全池。所用菌劑中蛭弧菌游泳體濃度達到 102pfu/mL。
實驗結(jié)果表1.紅嘴病發(fā)生率
權(quán)利要求
1.蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用，其特征 在于所述蛭弧菌游泳體制備方法為接種宿主于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在35°C和200rpm搖床培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液經(jīng) 4°C, 5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至DNB液體培養(yǎng)基中，接入蛭弧 菌BDM01，在溫度25 35°C下，以150 300rpm搖床培養(yǎng)36 48h，得到含蛭弧菌蛭 質(zhì)體和蛭弧菌游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min 后，上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、水、生理 鹽水或0.2mol/L pH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO6 109pfu/mL的 蛭弧菌游泳體菌液，該菌液即為防治大菱鲆紅嘴病菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用，其特 征在于所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01,于2008年4月28日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO : M 208066。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用，其特征 在于所述蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用是向水體中潑灑防治大 菱鲆紅嘴病菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體終濃度為10-107pfU/mL。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用，其特征 在于所述蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用是將飼料用防治大菱鲆 紅嘴病菌劑浸泡15 45min，菌劑中蛭弧菌游泳體濃度為10-107pfo/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用，所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，該菌劑的應用方法為向水體中潑灑防治大菱鲆紅嘴病菌劑，使水體中蛭弧菌游泳體終濃度為10-107pfu/mL，或者將飼料用防治大菱鲆紅嘴病菌劑浸泡15～45min，菌劑中蛭弧菌游泳體濃度為10-107pfu/mL，本發(fā)明所述蛭弧菌游泳體在制備防治大菱鲆紅嘴病菌劑中的應用能有效預防和治療大菱鲆紅嘴病，在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖的應用中安全性好，環(huán)保、不產(chǎn)生病原菌抗性，應用前景良好。
文檔編號A01P1/00GK102007941SQ201010268459
公開日2011年4月13日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者蔡俊鵬, 鮑星 申請人:華南理工大學