專利名稱：防治連作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能防治連作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集 約化生產(chǎn)技術(shù)，專用于克服和消除連作辣椒疫病問題。
背景技術(shù)：
辣椒原產(chǎn)于中南美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)在在我國(guó)各地普遍栽培，成為我國(guó)栽 培面積最大的蔬菜作物之一，更是重要的出口創(chuàng)匯優(yōu)勢(shì)經(jīng)濟(jì)作物。隨著栽培年限的增加，辣 椒種植區(qū)土傳病害大規(guī)模發(fā)生，特別是設(shè)施生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化、專一化、規(guī)模化等經(jīng)營(yíng)模式的出 現(xiàn)，使土傳病害更趨嚴(yán)重。辣椒疫病由卵菌病原體辣椒疫霉引起，是辣椒生產(chǎn)上最嚴(yán)重的土 傳性病害，從苗期到結(jié)果期都有發(fā)生。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法會(huì)對(duì)環(huán)境及人類造成負(fù)面影響， 如果沒有防治該病害的有效方法與途徑，這對(duì)中國(guó)的辣椒產(chǎn)業(yè)和人民的生活將產(chǎn)生很大影 響。我們的研究結(jié)果表明，連作作物疫病的關(guān)鍵問題不是養(yǎng)分缺乏或不平衡，也不是土壤次 生鹽漬化問題，而是土壤中的微生物區(qū)系及其次生物質(zhì)的致毒問題。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規(guī)?；B(yǎng)殖后的畜禽糞便 隨地棄置等不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，也極大地浪費(fèi)了能作為有機(jī)肥和生物有機(jī)肥產(chǎn)品的原 料；大量的養(yǎng)分資源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，明顯地削弱了 我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力。如何將從土壤中因作物收獲而取走的營(yíng)養(yǎng)元素最大限度地歸 還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機(jī)廢棄物制成商品有機(jī)肥料再施入土壤。如 果將這些固體有機(jī)廢棄物經(jīng)過高溫發(fā)酵合成高品位的有機(jī)堆肥，再用作功能菌的載體，所 制成的微生物有機(jī)肥料功能明確，將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
1.技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種能防治連作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料， 使連作辣椒疫病的防治效率達(dá)到80%以上，使大量的設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤和露地辣椒連作障礙土 壤得到生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案—株能克服或消除連作辣椒疫病的拮抗菌N幾Z-8，該微生物屬革蘭氏染色陽(yáng)性的 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，2009年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為 CGMCC NO. 3182，主要生物學(xué)特性為主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽(yáng)性(G+)，產(chǎn)芽孢。細(xì) 胞為桿狀，好氧或兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，淀粉水解陰性，V. P.反應(yīng)陽(yáng)性， 甲基紅試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，不能利用檸 檬酸鹽，硝酸還原酶陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性，卵磷脂酶陰性，不分解纖維素。用上述拮抗菌生產(chǎn)的防除連作辣椒疫病的微生物有機(jī)肥料，該肥料中含有IXlO8 個(gè)/g以上的拮抗菌NJLZ-8，全氮質(zhì)量比含量為4 5% (90%以上為有機(jī)氮)、總氮磷鉀養(yǎng)分為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量為30 35%。所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1)將拮抗菌NJLZ-8接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為 PH生長(zhǎng)范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期 形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IXlOici個(gè)/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配 制IL培養(yǎng)基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾 液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調(diào)至7. 2-7. 4，121°C滅菌20min。2)將拮抗菌^LZ-S發(fā)酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進(jìn) 行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固 體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌NJLZ-8含量達(dá)到1 X IO8個(gè)/g以上， 獲得豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥，所用腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽 指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2%，含水量質(zhì)量比 25-30%。其中菜粕的微生物酶解混合物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽 寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調(diào)節(jié) 含水量55-65%和pH 6. 0-7. 5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開始 翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會(huì)不斷 上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發(fā) 酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5. 0左右，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼 干，即為菜粕的微生物酶解混合物。3)然后將固體發(fā)酵的豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥按 體積比60 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30% 的含水量，包裝出廠即為能防治連作辣椒疫病的微生物有機(jī)肥。所述微生物有機(jī)肥料可專用于防治連作辣椒疫病。3.有益效果本發(fā)明涉及一種能克服或消除連作辣椒疫病的微生物有機(jī)肥料及其生產(chǎn)方法，利 用豬糞堆肥和菜粕微生物酶解氨基酸混合物，再與拮抗菌液混合后制成微生物有機(jī)肥料， 其產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上的產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1)肥料產(chǎn)品中含有抑制辣椒疫病病原卵菌生長(zhǎng)的專一性高效菌株(短小芽孢桿 菌^LZ-S)，其抑制效果非常顯著，肥料中該高效菌株的含量達(dá)到1 X IO8個(gè)/g以上，施入土 壤后能形成優(yōu)勢(shì)群，并在土壤中存活下來(lái)。2)肥料產(chǎn)品中含有豐富的可溶性有機(jī)碳和有機(jī)氮，能給功能菌提供十分優(yōu)越的生 長(zhǎng)環(huán)境，極大地提高了拮抗菌在土壤中的定殖和發(fā)揮功能的能力。3)本發(fā)明產(chǎn)品有機(jī)磷和有機(jī)氮含量特別高，均達(dá)到4%。本產(chǎn)品原料之一為豬糞， 總磷含量很高，而且生物有效性特別高，在該微生物有機(jī)肥料產(chǎn)品中無(wú)需添加任何含磷化 肥，使用本產(chǎn)品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物 有效性較差；本產(chǎn)品中有機(jī)氮能達(dá)到4%以上(大部分為氨基酸和小分子多肽)，確保了肥 料氮素持續(xù)穩(wěn)定的供應(yīng)，使所種作物生長(zhǎng)和抗逆能力大大增強(qiáng)。4)研究結(jié)果表明，在連作辣椒的土壤上施用本產(chǎn)品后，能顯著降低辣椒疫病的發(fā) 病率，生物防治率達(dá)80%以上，并且植株長(zhǎng)勢(shì)良好(圖2)。連續(xù)施用本肥料的土壤，對(duì)連作辣椒疫病的生物防治率更高。
四

圖1拮抗菌株NJLZ-8的平板拮抗效果圖2盆栽效果注1.CK (有連作辣椒疫病土壤)2. CK+常規(guī)有機(jī)肥3. CK+拮抗 菌NJLZ-8菌液4. CK+拮抗菌NJLZ-8經(jīng)二次發(fā)酵的有機(jī)肥(本發(fā)明肥料產(chǎn)品)
五具體實(shí)施例方式(一 )菌株的分離和鑒定采集已經(jīng)發(fā)生辣椒疫病的植株，采用疫霉選擇性培養(yǎng)基從發(fā)病辣椒的莖的病健交 界部位分離獲得病原菌，并驗(yàn)證其致病性。然后以辣椒疫病病原菌為指示菌，從連作辣椒疫 病發(fā)病田塊中的健康植株根際土壤中分離拮抗菌。然后通過盆栽試驗(yàn)復(fù)篩高效拮抗菌株， 最終獲得拮抗菌^LZ-S并進(jìn)行鑒定，菌種于30%甘油中-70°C保存。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果發(fā) 現(xiàn)拮抗菌NJLZ-8對(duì)病原菌的抑制率達(dá)到68% (如圖1)。拮抗菌NJLZ-8屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，其主要生物學(xué)特性為革 蘭氏染色陽(yáng)性(G+)，產(chǎn)芽孢。細(xì)胞為桿狀，好氧或兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性， 淀粉水解陰性，V. P.反應(yīng)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能發(fā)酵木糖、 L-阿拉伯糖、甘露醇，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性，卵磷脂酶陰性， 不分解纖維素。( 二 )菌劑生產(chǎn)1)將拮抗菌NJLZ-8接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為 PH生長(zhǎng)范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期 形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IXlOici個(gè)/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配 制IL培養(yǎng)基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾 液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調(diào)至7. 2-7. 4，121°C滅菌20min。2)將拮抗菌^LZ-S發(fā)酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物分 別進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次， 使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1 X IO8個(gè)/g以上，獲得 固體發(fā)酵的豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥。所用腐熟后的豬糞堆 肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2%，含水量 質(zhì)量比25-30% ο其中菜粕的微生物酶解混合物制備方法為(公知公用，見發(fā)明專利 ZL200610086126.0，一種農(nóng)用氨基酸的生物制取方法及其肥料產(chǎn)品)，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入 到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH 6. 0-7. 5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升 至50°C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開 始后，堆物的PH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在 55-65%和6. 0-7. 0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5. 0左右，再進(jìn) 行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解混合物(含氨基酸的混合材料)。
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3)然后將豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥按體積比 60 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30%的含水 量，包裝出廠即為能防治連作辣椒疫病的微生物有機(jī)肥產(chǎn)品。上述防除連作辣椒疫病微生物有機(jī)肥料，該肥料產(chǎn)品中含有IXlO8個(gè)/g以上的 拮抗菌NJLZ-8、全氮質(zhì)量比含量為4 5% (90%以上為有機(jī)氮)、總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為 6 10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30 35%。(三)盆栽試驗(yàn)盆栽試驗(yàn)中，辣椒品種為蘇椒五號(hào)，采用健康水稻土育苗至6 8片真葉時(shí)，移栽 至小塑料盆中。連作辣椒疫病嚴(yán)重的土壤采自安徽阜南縣。每盆裝連作辣椒疫病嚴(yán)重的土 壤3kg，拮抗菌NJLZ-8菌液處理以108cfu/g 土均勻拌入連作辣椒疫病土壤中，本發(fā)明肥料 產(chǎn)品以2%的使用量(w/w)均勻拌入病土中。每個(gè)處理3組重復(fù)，每組重復(fù)6株辣椒。培養(yǎng) 時(shí)保持各處理土壤中濕度、溫度一致。移栽35d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果表明，連作土壤的發(fā)病率為88%，并且存活植株長(zhǎng)勢(shì)矮小，生長(zhǎng)緩慢；連作土 壤中接種拮抗菌NJLZ-8菌液處理的發(fā)病率為25 %，防治率達(dá)72 %，連作土壤中施用本發(fā)明 肥料產(chǎn)品處理的發(fā)病率為16%，防治率達(dá)82% (表1)，并且植株長(zhǎng)勢(shì)良好(圖2)。說明本 產(chǎn)品能有效的抑制辣椒疫病的發(fā)生，提高辣椒疫病的防治的防治效果。連作土壤中對(duì)照處理的辣椒產(chǎn)量?jī)H為4g · pot—1，而連作土壤中施用本發(fā)明肥料產(chǎn) 品處理的產(chǎn)量為為43. 92g TOtl增產(chǎn)達(dá)9. 95倍。連作土壤的辣椒地上部鮮重為19. 60g/ 株，干重為4. IOg/株，而連作土壤中施用本發(fā)明肥料產(chǎn)品處理的辣椒鮮重為43. 92g/株，干 重為12. 91g/株(表2)，生物量差異顯著；連作土壤中施用本發(fā)明肥料產(chǎn)品處理較對(duì)照處 理，葉片凈光合速率、蒸騰速率顯著增加(表3)，有利于植物光合產(chǎn)物的積累和儲(chǔ)藏，從而 提高辣椒產(chǎn)量和生物量。這些結(jié)果表明，本產(chǎn)品除了能有效的降低辣椒疫病的發(fā)生外，還能 降低或消除病原菌對(duì)辣椒生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用，顯著的促進(jìn)辣椒的生長(zhǎng)。表1盆栽試驗(yàn)辣椒疫病發(fā)病率及防治效果
權(quán)利要求
一種能防治連作辣椒疫病的拮抗菌NJLZ 8，屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，于2009年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.3182；LZ 8的主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽(yáng)性G+，產(chǎn)芽孢。細(xì)胞為桿狀，好氧或兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，淀粉水解陰性，V.P.反應(yīng)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能發(fā)酵木糖、L 阿拉伯糖、甘露醇，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性，卵磷脂酶陰性，不分解纖維素。
2.用權(quán)利要求1所述拮抗菌生產(chǎn)的防治連作辣椒疫病的微生物有機(jī)肥料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物有機(jī)肥料，其特征在于該肥料中含有IXIO8個(gè)/g以 上的拮抗菌NJLZ-8、全氮質(zhì)量比含量為4 5%、全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮、總氮磷 鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30 35%。。
4.權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1)將權(quán)利要求1所述的拮抗菌NJLZ-8接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生 產(chǎn)的條件為培養(yǎng)溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成 芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> 1 X IO10個(gè)/ml ；2)將拮抗菌^LZ-S發(fā)酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進(jìn)行固 體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入NJLZ-8發(fā)酵液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固 體發(fā)酵溫度不超過50°C，一般發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌NJLZ-8含量達(dá)到1 X IO8個(gè)/g以 上，獲得豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥；其中菜粕的微生物酶解 混合物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH 6. 0-7. 5，進(jìn) 行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維 持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié) 含水量和pH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑， 直至堆物PH調(diào)整為5. 0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解混合物；3)然后將固體發(fā)酵的豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥按體積 比60 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30%的含 水量，包裝出廠即為能防除連作辣椒疫病的微生物有機(jī)肥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟1)所用PDA培養(yǎng)液 配制方法為用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加 20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調(diào)至7. 2-7. 4，121°C滅菌20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟2)所用腐熟后的豬 糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)肥質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2%，含 水量質(zhì)量比25-30%。
7.權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料在防治連作辣椒疫病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及能克服或消除辣椒疫病的拮抗菌及其生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離到了對(duì)辣椒連作疫病病原卵菌有顯著拮抗作用的拮抗菌(短小芽孢桿菌NJLZ-8)，該拮抗菌與有機(jī)肥混合制成微生物有機(jī)肥料，肥料中含有1×108個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量、全氮含量為4～5％(90％以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～10％、有機(jī)質(zhì)含量為30～35％。試驗(yàn)表明，這種微生物有機(jī)肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優(yōu)勢(shì)群，在辣椒疫病嚴(yán)重的土壤中對(duì)辣椒疫病的生物防治率達(dá)80％以上。在還沒有形成連作障礙的土壤上長(zhǎng)期施用本微生物有機(jī)肥料能在很大程度上防止辣椒疫病的發(fā)生。
文檔編號(hào)C05F11/08GK101948780SQ20101026849
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者冉煒, 徐陽(yáng)春, 楊興明, 梅新蘭, 沈其榮 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)