專利名稱：一種節(jié)水型海參養(yǎng)殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海參類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高海參成活率和免疫力，促 進海參快速生長、改善水質(zhì)、節(jié)水節(jié)能、綠色低碳的海參無公害養(yǎng)殖新方法。
背景技術(shù)：
海參，學(xué)名仿刺參(Apostichopus japonicus)，具有很高的食用價值，名列“八
珍”之中。我國年消費干海參約達5000噸，供求缺口巨大。為此，我國在90年代掀起 了刺參養(yǎng)殖的熱潮。隨著海參養(yǎng)殖的逐年遞增，養(yǎng)殖密度過大，養(yǎng)殖容量超載以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡 化，海參疾病也在頻繁爆發(fā)，常見的是養(yǎng)成期的腐皮病，腫嘴病等。目前，海參疾病的 預(yù)防和治療主要靠抗生素藥浴的方法來處理。長期使用抗生素，不僅使病原菌抗藥性增 加，疾病更頻繁發(fā)生，過量的抗生素和化學(xué)藥品的使用也造成海參體內(nèi)的抗生素殘留超 標，影響海參的商品品質(zhì)，對人的使用安全造成威脅。其它類化學(xué)類消毒劑的使用嚴重污染水質(zhì)，破壞環(huán)境。中草藥雖然能夠具有無 藥物殘留、經(jīng)濟效益高的優(yōu)點，但見效慢，短期內(nèi)解決不了流行性疾病。另一方面，目前海參的養(yǎng)殖模式需要大量的換水和頻繁的倒池，不僅浪費了人 力物力資源，污染水環(huán)境，而且大量的用水容易引起海岸帶海水入侵，導(dǎo)致土地鹽堿 化，給生態(tài)環(huán)境造成了危害。按照常用的方法對廢水進行處理，循環(huán)使用，則需要較高 的投資，增加了養(yǎng)殖成本。因而尋求一種更高效、更經(jīng)濟的辦法來提高海參的成活率和免疫力，顯得極為 迫切?！熬G色養(yǎng)殖”不但克服了抗生素濫用帶來的副作用，還能夠改善水質(zhì)，增強苗 種免疫力，提高海參的成活率和質(zhì)量，促進海參生長，成為近年來國家的重大需求。目 前，用蛭弧菌游泳體來進行海參養(yǎng)殖的方式在國內(nèi)外尚未見報道。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell(1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz R.W.，Hespell R.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology, 1978, 119(3) 245-248]。在國內(nèi)，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對 魚類細菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌BDH2102對魚 類細胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報，2006，33(1) 7-11]。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有養(yǎng)殖技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種節(jié)水型的 海參養(yǎng)殖方法；該方法通過在飼料和水體中添加蛭弧菌游泳體菌液實現(xiàn)，具體包括養(yǎng)殖 水源選擇，池水的處理，飼料的處理，換水周期的控制，其特征按照養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)原理， 海洋生物的生長環(huán)境要求，生物之間的相互關(guān)系及無公害養(yǎng)殖標準，人工創(chuàng)造養(yǎng)殖環(huán)境，減少投入成本，改善水質(zhì)，提高海參免疫力，促進海參快速生長，提高經(jīng)濟效益。本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，包括以下操作 步驟(1)取海域無污染的海水作為養(yǎng)殖用水；養(yǎng)殖用水經(jīng)砂濾、沉淀后，注入養(yǎng)殖 池；養(yǎng)殖池中放置經(jīng)過消毒的波紋板(用于海參的附著生長)；(2)在養(yǎng)殖池中加入蛭弧菌游泳體菌液，并加大曝氣，攪拌均勻，使池水中的蛭 弧菌游泳體的濃度達10 107pfu/mL ；(3)向養(yǎng)殖池中投放海參苗；(4)養(yǎng)殖期間正常曝氣，控制水溫在15 30°C，池水的鹽度保持在23%。
30%。，日投餌量為海參體重的質(zhì)量百分數(shù)的3 5%，餌料在投入前，用濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡15 30min ；每隔5 40天換掉池水(全池)一 次，每次換(全池)水后加入蛭弧菌游泳體菌液，使池水中的蛭弧菌游泳體菌液濃度達到 10 107pfu/mL。步驟(1)所述養(yǎng)殖池在注入養(yǎng)殖用水之前清洗消毒干凈；所述養(yǎng)殖池中3m2 4m2布置1個散氣石(用于充氣)。步驟⑵和(4)所述加入蛭弧菌游泳體菌液的方法為用養(yǎng)殖池中的池水稀釋菌 液后，均勻潑灑全池。步驟(2)所述加大曝氣的曝氣量為90 100L/h/m3 ；步驟(4)所述正常曝氣的 曝氣量為70 80L/h/m3。步驟(3)所述投放海參苗在水溫15 30°C時按照以下標準海參苗規(guī)格為400 頭/kg時，投放密度為600頭/m2;海參苗規(guī)格為200頭/kg時，投放密度為400尾/m2; 海參苗規(guī)格為100頭/kg時，投放密度為300尾/m2。步驟(4)所述餌料為配合餌料，每天投餌兩次；每隔5 7天采用虹吸法進行養(yǎng) 殖池底的吸污。步驟⑵和⑷所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.Strain) BDMOl，所述蛭弧菌 于2008年4月28日保藏于湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO M 208066。BDMOl由蛭弧菌BDJOl (保藏編號為CCTCC M 208011)進行紫外誘變得到，對其進行負染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDMOl 呈單細胞，弧形，大小為1.7X1.0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為3.5μιη;將其以雙層平板 法于28°C培養(yǎng)三天可形成直徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按照以下方法制備得到接種0.5mL濃度為107cfo/mL嗜 水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.172) 于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，26 30°C培養(yǎng)20h，培養(yǎng)液經(jīng)5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀用ImL生理鹽水懸浮后，加入至DNB液體培養(yǎng)基中，再接入ImL含 103pfu/mL蛭弧菌BDMOl的菌液，于28 °C培養(yǎng)36 48h，培養(yǎng)液在4°C下經(jīng)6000 8000rpm離心15 20min后，將含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或0.2mol/L pH值為7.2 7.6的磷酸 鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO9CfuAnL的蛭弧菌游泳體菌液。所述DNB液體培養(yǎng)基是將營養(yǎng)肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物O.lg溶于IOOOml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2 7.6。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果發(fā)展無公害養(yǎng)殖，提高海參的免疫力，促進海參的快速生長，降低生產(chǎn)成本， 提高經(jīng)濟效益，是我國海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必由之路；蛭弧菌能改善海參胃腸道環(huán)境，提 高免疫力，促進海參生長，且對海參類無毒性作用，對人類無致病性。蛭弧菌的生活史可分為脫離宿主細菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體狀態(tài)和在 宿主細菌內(nèi)生長發(fā)育的蛭質(zhì)體狀態(tài)。蛭弧菌游泳體侵入宿主時，在宿主細胞壁上產(chǎn)生一 個孔隙，當蛭弧菌侵入到宿主的周質(zhì)空間后孔隙重新封閉。游泳體失去鞭毛，和宿主細 胞一起被稱為“蛭質(zhì)體”。接下來，宿主周質(zhì)空間水解，蛭弧菌細胞變長，并分裂成多 個短節(jié)段，長出鞭毛，通過釋放溶解性酶從宿主細胞中脫離出來，重新形成游泳體。游泳體蛭弧菌侵入宿主細菌的過程非?？?，一般幾秒鐘內(nèi)即可完成。相對于蛭 弧菌蛭質(zhì)體而言，雖然存在著制備繁瑣、不易保存的弱點，但用游泳體蛭弧菌控制和消 除致病或潛在致病菌起效快、活力強。用游泳體蛭弧菌浸泡飼料，并在池水中潑灑一定 濃度的游泳體蛭弧菌菌液，既能促進海參的生長，提高免疫力，又能控制致病菌，凈化 水質(zhì)，且最長可40天換(全池)水一次，從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和大量養(yǎng) 殖廢水排放污染環(huán)境，節(jié)省人力物力，為人類提供安全、綠色、無公害的水產(chǎn)品，提高 養(yǎng)殖戶的收入。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于 此。本發(fā)明的具體實施地點為山東某海參養(yǎng)殖場，海參種類為仿刺參(Apostichopus japonicus)。實施時間為4個月。試驗地海域的水源水質(zhì)符合中華人民共和國國家標準 漁業(yè)水質(zhì)標準(GBl 1607-89)要求，海水經(jīng)過砂濾、沉淀處理后進入養(yǎng)殖池，符合農(nóng)業(yè) 部《無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要求。海參的養(yǎng)殖池建在養(yǎng)殖大棚 內(nèi)，挑選體質(zhì)健康、個體大小均勻的幼參，平均體長3 5cm，采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計， 按照60 80頭/m2的養(yǎng)殖密度投入池中。平均分為A-D 4個試驗組，B、C、D每個 試驗組有 8 個小組，分別為 Bi、Cl、Dl; B2、C2、D2 ；、B3、C3、D3 ； B4、C4、 D4 ； B5、C5、D5 ； B6、C6、D6 ； B7、C7、D7 ； B8、C8、B8 ； B1-D8 每小組再分為 4組，即Bl-I Β1-4··· 8-1 D8-4，每組2個重復(fù)。試驗的處理如下A組正常流水，投喂配合飼料飼料(工廠生產(chǎn)的養(yǎng)殖方式)B組在水中潑灑蛭弧菌游泳體菌液，使水體中蛭弧菌游泳體濃度分別達到 10、ΙΟ3、105、107pfo/mL，投喂配合飼料；C組投喂?jié)舛葹?0、ΙΟ3、105、107pfo/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡后的配合 飼料；D組在水中加入蛭弧菌游泳體菌液，使菌體濃度分別達到10、ΙΟ3、105、 107pfu/mL,同時分別投喂?jié)舛葹?0、ΙΟ3、105、107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡后 的配合飼料； Bi、Cl、Dl組每5天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B2、C2、D2組每10天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B3、C3、D3組每15天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B4、C4、D4組每20天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B5、C5、D5組每25天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B6、C6、D6組每30天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B7、C7、D7組每35天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B8、C8、D8組每40天換(全池)水-一次，換水后I■新加菌Bl-U Cl-U Dl-I'"DS-I 投放的菌液濃度為 10pfo/mL ；B 1-2、C1-2、01-2夂08-2投放的菌液濃度為10^\1/11^;Bl-3、C1-3、01-3夂08_3投放的菌液濃度為1(^份/11^;Bl-4、C1-4、Dl-4... D8-4 投放的菌液濃度為 107pfu/mL ；所用飼料符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《無公害食品漁用配合飼料安全限 量》(NY5072-2002)的規(guī)定。試驗期間，每日投喂2次，早上、晚上各一次。試驗結(jié) 束測量海參的生長指標、免疫指標及微生物情況。1、海參生長指標的測定方法如下喂養(yǎng)4個月后，統(tǒng)計最終每口池子所存活的海參數(shù)目，分別從每口池子各隨機 抽取100頭海參，用游標卡尺測量其體長(mm)，電子天平測其重量(g)，計算以下參 數(shù)(1)成活率(% ) = Nt/N。X 100% ；(2)增重率(％ ) = (WrW0) W0X 100% ；(3)體長增長率(% ) = (LrL0)/L0X 100% ；式中N。為試驗開始時海參總頭數(shù)；Nt為試驗結(jié)束時海參總頭數(shù)；W。為試驗開 始時海參體重；Wt為試驗結(jié)束時海參體重；L。為試驗開始時海參體長；Lt為試驗結(jié)束時 海參體長；2、海參的免疫指標的測定堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用Krazel(1982)磷酸苯二鈉 法，從海參的腹面口后1/3穿刺抽取血液，置于離心管中，于4°C，3000r/min離心 IOmin,取上清，即為海參的血清。置于冰盒中保存。酸性磷酸酶(ACP)的測定采用磷酸苯二鈉法。以每IOOmL血清在37°C與底物 磷酸苯二鈉作用60min，產(chǎn)生Img酚者定義為一個酶活力單位。堿性磷酸酶(AKP)的測定采用磷酸苯二鈉法。以每IOOmL血清在37°C與底物 磷酸苯二鈉作用15min，產(chǎn)生Img酚者定義為一個酶活力單位。3、水質(zhì)的測定氨態(tài)氮用次溴酸納氧化法測定(GB12763.4-91)；亞硝酸鹽氮用重氮-偶氮光度法測定(GB12763.4-91)4、弧菌總數(shù)的測定用TCBS培養(yǎng)基檢測弧菌總數(shù)具體步驟為用磷酸緩沖鹽(PBS)對所取水樣進行10稀釋，至10_4。取原液和各濃度的稀釋液(10—1、10_2、10_3、10_4)0.5mL，涂布于TCBS固體培養(yǎng)基上，菌落計 數(shù)，計算水體中的弧菌總數(shù)。海參的生長指標、免疫活性指標及水質(zhì)情況的測定結(jié)果見表一 表四從表中 可以看出，A組成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP) 最高分別達到 82.14 %、830.56 274.65 0.031U/mL、0.034U/mL，弧菌總數(shù)為 6.78X IO2CFUAnL ；與工業(yè)生產(chǎn)的A組相比，C、D、E組的成活率、增重率、體長增 長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性都有明顯的升高，而弧菌總數(shù)明顯降 低。說明在常規(guī)的養(yǎng)殖方式下，不換水會影響海參的成活率、增重率、體長增長率、酸 性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活力。在相同的換水周期下，隨著蛭弧菌游泳體 的濃度升高，成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力在逐漸的升 高，弧菌總數(shù)明顯降低；說明蛭弧菌游泳體的濃度越高，海參的免疫力越強，成活率越 高，患病機率越小。Bl-I Β8-1··· 1_4 D8-4之間的成活率、增重率、體長增長率、 酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、弧菌總數(shù)幾乎無明顯差異，說明在水中或者是 在飼料中添加濃度為10 107pfo/mL蛭弧菌游泳體菌液，5-40天換(全池)水一次，對 海參的育苗成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、弧 菌總數(shù)影響不大，均可達到提高成活率和免疫力，促進生長的目的。經(jīng)過測定，A組水池中的各項水質(zhì)測定值均高于試驗組B、C、D組的。其中， A組氨態(tài)氮的檢測結(jié)果為0.279mg/L，高于B組的0.124 0.211mg/L、C組的0.129 0.234mg/L、D組的0.096 0.199mg/L ； A組的亞硝酸鹽氮的檢測結(jié)果為0.077mg/L，高 于 B 組的 0.025 0.057mg/L、C 組的 0.030 0.061mg/L、D 組的 0.018 0.035mg/L。 由以上結(jié)果分析可知，應(yīng)用濃度為10-107pfU/mL蛭弧菌游泳體菌液可有效改善養(yǎng)殖水體 環(huán)境，調(diào)節(jié)水中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮的含量，從而提供有利于海參生存的水體環(huán)境，并 且在水體和飼料中同時添加，效果最佳。由此可見，無論在水中還是在飼料中添加濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌游泳 體菌液，40天換(全池)水一次，都能夠達到提高海參的免疫力和成活率，促進生長，且 可控制水中弧菌數(shù)量，改善水質(zhì)。在水中和飼料中同時添加，效果更佳。即能夠節(jié)約地 下水資源，保護環(huán)境，又能夠節(jié)省成本，提高經(jīng)濟效益，促進養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。表一海參的生長指標、免疫指標及弧菌總數(shù)的測定
權(quán)利要求
1.一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)取海域無污染的深海水作為養(yǎng)殖用水；養(yǎng)殖用水經(jīng)砂濾、沉淀和消毒后，注入 養(yǎng)殖池；養(yǎng)殖池中放置經(jīng)過消毒的波紋板；(2)在養(yǎng)殖池中加入蛭弧菌游泳體菌液，并加大曝氣，攪拌均勻，使池水中的蛭弧菌 游泳體的濃度達10 l(fpfu/mL ；(3)向養(yǎng)殖池中投放海參苗；(4)養(yǎng)殖期間正常曝氣，控制水溫在15 30°C，池水的鹽度保持在23%。 30%。，日 投餌量為海參體重的質(zhì)量百分數(shù)的3 5%，，餌料在投入前，用濃度為10 l(fpfu/mL 的蛭弧菌游泳體菌液浸泡15 30min ；每隔5 40天換掉池水一次，每次換水后加入蛭 弧菌游泳體菌液，使池水中的蛭弧菌游泳體濃度達到10 107pfu/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(1)所述養(yǎng) 殖池在注入養(yǎng)殖用水之前清洗消毒干凈；所述養(yǎng)殖池中3m2 4m2布置1個散氣石。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷ 所述加入蛭弧菌游泳體菌液的方法為用養(yǎng)殖池中的池水稀釋菌液后，均勻潑灑全池。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟( 所述加大 曝氣的曝氣量為90 100L/h/m3 ；步驟(4)所述正常曝氣的曝氣量為70 80L/h/m3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟C3)所述 投放海參苗在水溫15 30°C時按照以下標準海參苗規(guī)格為400頭/kg時，投放密度為 600頭/m2 ；海參苗規(guī)格為200頭/kg時，投放密度為400尾/m2 ；海參苗規(guī)格為100頭 /kg時，投放密度為300尾/m2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(4)所述餌 料為配合飼料，每天投餌兩次；每隔5 7天采用虹吸法進行養(yǎng)殖池底的吸污。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷ 所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDMOl，所述蛭弧菌于2008年4月觀日保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO : M208066。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷ 所述所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按照以下方法制備得到接種0.5mL濃度為IO7CfuAnL嗜水 氣單胞菌(Aeromonashydrophila)于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，^ 30°C培養(yǎng)20h，培養(yǎng)液 經(jīng)5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀用ImL生理鹽水懸浮后，加入至DNB液 體培養(yǎng)基中，再接入蛭弧菌BDM01，于培養(yǎng)36 48h，培養(yǎng)液在4°C下經(jīng)6000 8000rpm離心15 20min后，將含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20η ι后，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或0.2mol/LpH值為7.2 7.6的磷酸 鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO9CfuAnL的蛭弧菌游泳體菌液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種節(jié)水型的海參育苗方法，其特征在于所述DNB液體 培養(yǎng)基是將營養(yǎng)肉湯0.相、酪蛋白酸水解物0. 和酵母精提物O.lg溶于IOOOrnl蒸餾水 中，調(diào)節(jié)pH值至7.2 7.6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種節(jié)水型的海參養(yǎng)殖方法。該方法包括養(yǎng)殖水源選擇，池水的處理，飼料的處理，換水周期的控制，按照養(yǎng)殖水體生態(tài)學(xué)原理，海洋生物的生長環(huán)境要求，生物之間的相互關(guān)系及無公害養(yǎng)殖標準，采用生物生態(tài)學(xué)的方法控制養(yǎng)殖環(huán)境。關(guān)鍵技術(shù)是在水體中添加蛭弧菌游泳體菌液，同時飼料也用蛭弧菌游泳體菌液浸泡，養(yǎng)殖期間可達到40天換掉池水一次。本發(fā)明為生物養(yǎng)殖方法，綠色、安全、無污染，效果顯著，能夠改善水質(zhì)，促進海參攝食，提高免疫力，促進生長，并提高成活率，有極好的發(fā)展前景。對提高經(jīng)濟效益和食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義。
文檔編號A01K61/00GK102017908SQ201010271009
公開日2011年4月20日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者何偉杰, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學(xué)