專利名稱：早春短命植物綿果薺的高效再生植株獲得的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
短命植物是對(duì)生長(zhǎng)在干旱荒漠地帶的一類生活周期或年生長(zhǎng)期很短的特殊植物 類群的總稱(Risser and Cottam，1968 ； Mulroy and Rundel, 1977 ；張立運(yùn)，1985;黃培 祜，2002)。主要分布在中亞、西亞、北非、北美、南美和地中海沿岸等地的荒漠地帶 (Went, 1948 ； Shreve, 1951 ；阿略興，1954 ；謝尼闊夫，1954 ； Rooyen et al., 1992 ； Telenius，1993 ； Hegazy and Elamry, 1998 ； Wilby and Shachak, 2000 ； Gutterman, 2001)，中亞為其分布中心之一(毛祖美和張佃民，1994;黃培祜，2002)。我國(guó)短命植 物只分布于新疆北部荒漠(尤其是準(zhǔn)噶爾荒漠)及其毗鄰的草原帶(潘偉斌和黃培祜， 1991)。每年春季3月下旬開(kāi)始大量短命植物萌動(dòng)破土，到5月有些地方短命植物蓋度可 以達(dá)到50%以上，能夠有效地阻止地表風(fēng)沙流動(dòng)，即春季新疆北部地區(qū)沙漠穩(wěn)定沙面的 主要貢獻(xiàn)者和沙漠受干擾破壞后植被入侵的先鋒植物，在荒漠植物群落中具有重要地位 和生態(tài)價(jià)值(王雪芹等，2003)。短命植物還是一類很有價(jià)值的資源，它們是新疆春秋季 牧場(chǎng)中的優(yōu)良春季牧草。很多種類是我國(guó)北方地區(qū)早春花卉及園林綠化美化的優(yōu)良種質(zhì) 資源，少數(shù)種又是傳統(tǒng)中藥藥材。此外，據(jù)張立運(yùn)(2002)的報(bào)道，短命植物是一類光合 效率高、物質(zhì)積累快、營(yíng)養(yǎng)周期短的植物資源。但是，到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)短命植物 組織培養(yǎng)方面的研究尚未報(bào)道。綿果薺(Lachnolomalehnannii Bge.)是十字花科綿果薺屬(LachnolomaBge.)，
該屬為單種屬。是分布于亞洲中部的干旱、半干旱沙荒地和鹽堿地的一年生早春短命 植物，在我國(guó)僅分布于新疆北部?；ㄆ?月，果期6月，植株較小，株高約10-20cm， 全珠多毛，果實(shí)為短角果四棱狀卵形，果皮厚而硬及果皮外有綿毛(馬素卿和潘秀敏， 1987)。此外，綿果薺具有生活周期短、萌發(fā)期早、基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(2n = &= 14)、較強(qiáng) 的抗鹽、耐旱性等特性(劉嫫心，1987)，是一種特殊的潛在遺傳資源。人類可以應(yīng)用高 生物技術(shù)(體細(xì)胞雜交、原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)基因等)手段、利用這一潛在遺傳資源，培育 生長(zhǎng)期短，具有較強(qiáng)的抗逆性的糧食作物、蔬菜、牧草、花卉新品種和新種類。組織培養(yǎng)是植物生物技術(shù)的必要前提和最理想手段。它一方面可為遺傳工程提 供理想的受體材料，另一方面可為常規(guī)的植物改良程序提供一種新的手段，從而使很多 用傳統(tǒng)方法難以解決的問(wèn)題迎刃而解，更多更快更好地創(chuàng)造出各種林木、農(nóng)作物和園藝 植物的新品種、新類型和新種類，是一類新資源開(kāi)發(fā)利用和種質(zhì)資源保存的先鋒手段。 這不僅能解決資源短缺的困難，而且具有許多農(nóng)業(yè)栽培所不具備的優(yōu)點(diǎn)(Trigianoand Gray, 2000 ； Razdan, 2002)。因此，在人類面臨能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日益嚴(yán) 重的情況下發(fā)揮著重要的作用。所以，本發(fā)明以短命植物綿果薺為研究材料，建立它的高效再生體系具有如下重要意義一是可為以短命植物為材料，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行新資源開(kāi)發(fā)利用及短命 植物種質(zhì)保存提供研究材料和重要理論依據(jù)。二是“生命與地球環(huán)境的協(xié)同演化”是當(dāng)今世界地球科學(xué)與生命科學(xué)相互交叉 的重大前沿科學(xué)主題。近年來(lái)，隨著我國(guó)西部荒漠生態(tài)環(huán)境的不斷惡化以及生態(tài)建設(shè)問(wèn) 題的日益突出，短命植物以其獨(dú)特的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)有關(guān)部門及學(xué) 者的高度重視。但目前為止，該類在植物組織培養(yǎng)方面尚未報(bào)到。因此，研究短命植物在組織培養(yǎng)方面研究具有重大而賦予現(xiàn)實(shí)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)短命植物在組織培養(yǎng)方面研究空白的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種早春 短命植物綿果薺高效再生體系建立的方法，填補(bǔ)了短命植物在現(xiàn)有技術(shù)中組織培養(yǎng)方面 的技術(shù)空白，解決綿果薺的自然繁殖率低而面臨滅絕威脅的問(wèn)題，更加縮短生長(zhǎng)發(fā)育周 期，獲得人工培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基下的離體再生植株。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以綿果薺為研究材料，通過(guò)不同的外植體、 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、糖濃度和培養(yǎng)條件對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)及其增殖、芽的分化和根誘導(dǎo)的影 響研究，并不同的基質(zhì)和再生苗的前處理對(duì)再生苗移栽成活率的影響進(jìn)行比較，建立綿 果薺愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的最佳體系，從而得到早春短命植物綿果薺的高校再生植 株的方法。本發(fā)明具體提供了一種早春短命植物綿果薺高效再生體系建立的方法，包括以 下步驟1)無(wú)菌材料的備用；2)在愈傷組織的誘導(dǎo)中，選用子葉為外植體，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方為MS+l.Omg/1 IBA+O.lmg/IBAP,在黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，蔗糖濃度為3%或4%;3)在愈傷組織的增殖中，選用子葉為誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織的增殖對(duì)象，生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)劑配方為 MS+l.Omg/1 IBA+O.lmg/1 BAP ；4)在不定芽的分化中，子葉愈傷組織分化的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合方式為MS+0.5mg/ L IBA+l.Omg/L KT和MS+O.lmg/L IBA+2.0mg/L BAP,下胚軸的愈傷組織分化的生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)劑配合方式為 MS+O.lmg/L IAA+1.0mg/L BAP ；5)在不定根的誘導(dǎo)中，選用配方為l/2MS+0.1mg/LNAA ；6)在植株再生培養(yǎng)中，選在分化培養(yǎng)基里分化的愈傷組織接種到已篩選出的分 化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察植株再生情況，培養(yǎng)溫度22°C-24°C、光照強(qiáng)度2000Lx、光照時(shí) 間為16h/d。本發(fā)明中，選用現(xiàn)有技術(shù)中常用的不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IAA，2，4-D，NAA， IBA和BAP都為本領(lǐng)域熟知的，可以通過(guò)公眾途徑獲得，其中，IAA代表吲哚乙酸，2， 4-D代表2，4-二氯苯氧乙酸，NAA代表奈乙酸，IBA代表吲哚丁酸，BAP代表芐基氨
基嘌呤。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下效果1.發(fā)明彌補(bǔ)了短命植物在現(xiàn)有技術(shù)中組織培養(yǎng)方面的技術(shù)空白，解決綿果薺的自然繁殖率低而面臨滅絕威脅的問(wèn)題，更加縮短生長(zhǎng)發(fā)育周期，獲得真正人工培養(yǎng)條件 和培養(yǎng)基下的離體再生植株。本發(fā)明并為以短命植物為材料，應(yīng)用植物生物技術(shù)，進(jìn)行 新資源開(kāi)發(fā)利用及短命植物種質(zhì)保存提供了研究材料和重要技術(shù)方案。2.在本發(fā)明提供的早春短命植物綿果薺再生體系中，選用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合為 MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP,該配合的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到了 100%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈 傷組織的手感為松脆(易碎)、顏色為綠色、產(chǎn)生量大、誘導(dǎo)期很早(6_9d)。3.在本發(fā)明提供的早春短命植物綿果薺再生體系中，選用的子葉愈傷組織分化 的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合方式為 MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT 和 MS+0.1mg/LIBA+2.0mg/ LBAP,該配方的不定芽誘導(dǎo)率分別為80.00(士8.16) %和77.78(士 11.11) %，平均每塊 愈傷組織誘導(dǎo)芽數(shù)分別為5.33 (士0.62) %和5.00 (士0.37) %。 下胚軸的為MS+O.lmg/L IAA+1.0mg/L BAP,該處理的分化率為 91.67 (士8.33) %，平均芽數(shù)為 6.45 (士0.68)。4.在本發(fā)明提供的早春短命植物綿果薺再生體系中，選用的不定根誘 導(dǎo)中，發(fā)根率最佳的配方選用l/2MS+0.1mg/LNAA，該處理不定根的誘導(dǎo)率為 80.00 (士 13.33) %，平均根長(zhǎng)為 4.05 (士 0.42) cm。
具體實(shí)施例方式下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在 下述的說(shuō)明中，如無(wú)特別說(shuō)明，％皆指質(zhì)量百分比。本發(fā)明以現(xiàn)有的組織培養(yǎng)技術(shù)為發(fā)明基礎(chǔ)。本發(fā)明所使用的生長(zhǎng)調(diào)劑是日本 Sigma公司的、瓊脂粉是美國(guó)Sanland公司的，MS培養(yǎng)基所使用的試劑和蔗糖是中國(guó)天 津化學(xué)試劑有限公司和上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的分析純。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí) 施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。實(shí)施例一無(wú)菌材料的備用培養(yǎng)基選用10X大量元素母液、100X鐵鹽母液、100X微量元素母液、 100 X有機(jī)物(維生素)母液不同培養(yǎng)基，配制MS (Murashige and Skoog, 1962)培養(yǎng)基， 不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，所述培養(yǎng)基包含3%蔗糖和0.6%瓊脂粉，pH值均調(diào)為6.0，用 150mL三角瓶分裝，每瓶約50mL。分裝后放入滅菌鍋，在1.2X 104kg/m2(121°C )下滅 菌20min，取出，放平，冷卻備用。無(wú)菌苗的培育成熟的綿果芥果實(shí)采集于新疆阜康彩南。果實(shí)采摘后，在室溫 下貯藏備用。取粒大飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的種子先自來(lái)水沖2-3min，然后在無(wú)菌條件下70% 乙醇浸泡l.Omin，無(wú)菌水沖4-5次，0.1 %升汞消毒1.5min，無(wú)菌水沖3_5次，接種MS基 本培養(yǎng)基。先培養(yǎng)在溫度為5-15°C白天/晚上、光照為16h、濕度為70-80%的培養(yǎng)箱 4-5d，種子萌發(fā)出來(lái)了以后轉(zhuǎn)移到溫度為23士 1°C、光照為16h、濕度為70-80%的培養(yǎng) 室培養(yǎng)10d。培育的14-15d的健康無(wú)菌苗選用愈傷組織誘導(dǎo)。實(shí)施例二愈傷組織的誘導(dǎo)本試驗(yàn)以建立一個(gè)綿果薺愈傷組織誘導(dǎo)的最佳體系為目的，把綿果薺下胚軸與子 葉作為外植體，把現(xiàn)有技術(shù)中常用的不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(IAA，2，4-D, NAA，IBA， BAP)的不同濃度和組合方式對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)及其生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了比較研究。
1.愈傷組織誘導(dǎo)中不同外植體和不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的篩選綿果芥種子萌發(fā)到14-15d后，把無(wú)菌苗的下胚軸和子葉分別切成0.5cm長(zhǎng)、 0.5X0.3cm2面積，并接種附加現(xiàn)有技術(shù)中不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(IAA，2，4_D，NAA, IBA，BAP)的MS培養(yǎng)基及無(wú)加任何植物激素的MS基本培養(yǎng)基作為對(duì)照(CK)，參見(jiàn) 見(jiàn)表1。所有培養(yǎng)基包含3%蔗糖和0.6%瓊脂粉，PH值均調(diào)為6.0，在1.2X104kg/ m2(121°C)下進(jìn)行了滅菌20min(Shirinetal.，2007)。培養(yǎng)基放在溫度為23 士 1°C、濕度為 70-80%的黑暗條件下進(jìn)行25d的培養(yǎng)。每18d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基更換中把褐化的、污 染外植體或愈傷組織被去掉(Kabiretal.，2008)。25d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和分析質(zhì)量。表1.生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的不同濃度及其配合方式
權(quán)利要求
1. 一種早春短命植物綿果薺再生體系建立的方法，其特征在于，所述的通過(guò)選用不 同外植體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，選用不同的糖濃度和培養(yǎng)條件，對(duì)早春短命植物綿果薺的愈傷 組織的誘導(dǎo)、增殖、芽的分化和根的誘導(dǎo)培養(yǎng)和植株的再生，具體包括以下步驟1)無(wú)菌材料的備用；2)在愈傷組織的誘導(dǎo)中，選用愈傷組織的外植體為子葉，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方為 MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP,在黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，蔗糖濃度為3%或4% 時(shí)；3)在愈傷組織的增殖中，選用子葉為誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織的增殖對(duì)象，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 配方為 MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP ；4)在不定芽的分化中，子葉愈傷組織分化的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合方式為MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT和MS+O.lmg/L IBA+2.0mg/L BAP,下胚軸的愈傷組織分化的生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 劑配合方式為 MS+O.lmg/L IAA+1.0mg/L BAP ；5)在不定根的誘導(dǎo)中，選用配方為l/2MS+0.1mg/LNAA;6)在植株再生培養(yǎng)中，選在分化培養(yǎng)基里分化的愈傷組織接種到已篩選出的分化培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察植株再生情況，培養(yǎng)溫度22°C-24°C、光照強(qiáng)度2000Lx、光照時(shí)間為 16h/d。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種早春短命植物綿果薺再生體系建立的方法，通過(guò)以不同的外植體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、糖濃度和培養(yǎng)條件對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)及其增殖、芽的分化和根誘導(dǎo)的影響，并以不同的基質(zhì)和再生苗的前處理對(duì)再生苗移栽成活率的影響進(jìn)行比較，確定選用愈傷組織的外植體為子葉，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配伍為MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP，在黑暗條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)，蔗糖濃度為3％或4％，建立綿果薺愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的最佳體系，從而得到早春短命植物綿果薺的高效再生植株的方法。解決綿果薺的自然繁殖率低而面臨滅絕威脅的問(wèn)題，更加縮短生長(zhǎng)發(fā)育周期，獲得真正人工培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基下的離體再生植株，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102007868SQ201010274418
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者廖康, 滿蘇爾, 譚敦炎 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)