專利名稱：一種利用顛茄外植體誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特指一種利用顛茄(Atropa belladonna L .)無菌苗誘導(dǎo)胚性細(xì)胞以及胚性細(xì)胞再生植株的方法。
背景技術(shù)：
東莨菪堿(scopolamine，C17H21O4N)和莨菪堿(hyoscyamine，C17H23O3N)(其外消旋體為阿托品)均為莨菪烷類生物堿(Tropane alkaloids, TAs是)，是在臨床上廣泛使用的兩種重要的基本藥物。主要用于鎮(zhèn)痛、麻醉、抗暈動藥、治療帕金森癥、改善微循環(huán)、戒毒脫癮、治療農(nóng)藥中毒等，市場需求十分巨大。隨著TAs是新功能的不斷開發(fā)，其需求還在迅速增長。TAs 是主要從茄科植物顛茄belladonna ),^^^ {Hyoscyamus niger )、曼陀羅(J)atura stramonium)中提取，產(chǎn)量有限。其中顛茄是TAs是最主要的商業(yè)栽培藥源， 我國藥典規(guī)定的唯一 TAs是是藥源植物。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是體細(xì)胞向胚胎發(fā)生途徑轉(zhuǎn)變的發(fā)育再建過程，也是植物全能性預(yù)言的最好說明。體細(xì)胞胚發(fā)生現(xiàn)象被看作是開展生物學(xué)理論研究的良好模型。研究顛茄體細(xì)胞胚發(fā)生對于闡明植物發(fā)育的分子機(jī)理，促進(jìn)中草藥的遺傳工程改良，無論在基礎(chǔ)理論還是在實(shí)際應(yīng)用價值上都具有極其重要的意義。通過顛茄胚性再生植株，可以快速大量繁殖顛茄脫毒苗，胚性細(xì)胞也可創(chuàng)造、篩選優(yōu)良無性系，獲得TAs是含量相對較高而穩(wěn)定的植株，也可作為轉(zhuǎn)基因的受體培育高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因顛茄，為TAs是的生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)新型藥源，目前除了本實(shí)驗(yàn)室的研究成果外，尚無相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種利用顛茄外植體誘導(dǎo)胚性細(xì)胞以及胚性細(xì)胞再生植株的方法。通過建立適合顛茄的胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，該體系通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株，達(dá)到以顛茄胚性細(xì)胞為受體，建立快速、高效的轉(zhuǎn)基因顛茄以及利用胚性細(xì)胞突變篩選優(yōu)良無性系的目的。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種以顛茄胚性細(xì)胞為受體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其以顛茄莖尖或側(cè)芽、種子為材料，以附加2，4-D 3. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基(MSA)誘導(dǎo)胚性細(xì)胞；胚性細(xì)胞的擴(kuò)繁繼代將胚性細(xì)胞在以附加2，4-D 2. 0mg/L的MS固體培養(yǎng)基(MSB)上篩選、繼代培養(yǎng)。在附加2，4_D 2. 0mg/L、0. 2mg/mL 6-芐氨基嘌呤(6_BA)、2. 2g/L KCl、40g/L 蔗糖的 MS 液體培養(yǎng)基(LMS) 上懸浮培養(yǎng)；最后將胚性細(xì)胞在MS培養(yǎng)基上再生完成植株重建。胚性細(xì)胞可用作轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良受體以及使用遺傳物質(zhì)誘變劑處理的受體。具體包括
1)顛茄無菌外植體的獲得
利用顛茄成熟葉片、莖段或種子，消毒處理后接種后于MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，獲得材
3料，適時繼代，繼代時將其剪成帶有兩片展開葉的節(jié)段接種。2)胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立
剝?nèi)☆嵡亚o尖或側(cè)芽分生組織，以及種子消毒滅菌后突破種皮的胚切成數(shù)段后，接種于附加2，4-D 3. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基(MSA)中，光照培養(yǎng)，4_6周后，即可獲得胚性細(xì)胞。 在Mkon SMZ800體視顯微鏡下，放大觀察，篩選誘導(dǎo)出來的典型胚性細(xì)胞，在附加2，4-D 2. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基(MSB)上純化保存、擴(kuò)繁，每月一次。3)胚性細(xì)胞的液體培養(yǎng)
胚性愈傷在擴(kuò)繁6-8周后，將胚性愈用篩網(wǎng)破碎成均勻的小細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到加有適當(dāng)體積的附加 2，4-D 2. Omg/L,0. 2mg/mL 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2. 2g/L KCl、40g/L蔗糖的MS 液體培養(yǎng)基(LMS)中懸浮培養(yǎng)，3-10d繼代一次，細(xì)胞團(tuán)較大時用0. 5mm篩網(wǎng)進(jìn)行破碎。4)植株再生
將胚性愈傷細(xì)胞再轉(zhuǎn)移至MS固體培養(yǎng)基上，25°C光照(16L/8D)篩選培養(yǎng)。在2_6周間將平皿上出現(xiàn)愈傷變綠，每月轉(zhuǎn)移到新鮮MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)再生，體胚會逐漸成熟， 最終形成叢生芽和小植株。在本發(fā)明中，獲得的胚性細(xì)胞可用于脫毒苗，也可以利用遺傳物質(zhì)誘導(dǎo)突變產(chǎn)生新的新品系，也可以作為轉(zhuǎn)化受體獲得了高產(chǎn)TAs是的顛茄轉(zhuǎn)化子，為TAs是的生產(chǎn)提供了一種新型優(yōu)質(zhì)的可持續(xù)使用的藥源。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1
顛茄無菌外植體的獲得
方法一利用葉片建立顛茄無菌外植體
采取顛茄成熟葉片，或帶節(jié)的莖段，流水沖洗1小時；75%乙醇處理30秒，然后用2% (M/V) NaClO溶液或0. 1% (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在添加叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基于121 滅菌20分鐘后分裝于培養(yǎng)瓶或平皿中)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加植物生長調(diào)節(jié)物2.0 mg/L BAP (芐基腺嘌呤)，0.3 mg/L NAA (萘乙酸)，3(^/1蔗糖，？!1值為5.8，再添加5(%瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顛茄的幼芽，培養(yǎng)條件為25°C，12小時光照，光照強(qiáng)度為55μπι01. πΓ2. s—1。40天后，即可獲得無菌的顛茄無菌外植體，接種繼代于MS培養(yǎng)基中，等到5個節(jié)以上時可用于剝離莖尖或側(cè)芽分生組織。方法一利用莖段建立顛茄無菌外植體
采取顛茄帶節(jié)的莖段，流水沖洗1小時；75%乙醇處理30秒，然后用2% (M/V) NaClO 溶液或0. 1% (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在MS培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)成苗，培養(yǎng)條件為25°C，12小時光照，光照強(qiáng)度為 55ymol. πΓ2. s—1。10天后，即可獲得無菌的顛茄無菌外植體，等到5個節(jié)以上時可用于剝離莖尖或側(cè)芽分生組織。
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方法二 利用顛茄種子在無菌條件下萌發(fā)獲得無菌外植體
水選法篩選成熟飽滿的種子，流水沖洗1小時；75%乙醇處理30秒，然后用2% (M/V) NaClO溶液或0. 1 % (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在MS 培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)成苗，培養(yǎng)條件為25°C，12小時光照，光照強(qiáng)度為55μπι01. πΓ2. s—1。30天后，即可獲得無菌的顛茄無菌外植體，等到5個節(jié)以上時可用于剝離莖尖或側(cè)芽分生組織。實(shí)施例2
胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立
方法一利用顛茄無菌苗莖尖或側(cè)芽誘導(dǎo)獲得胚性細(xì)胞
在Nikon SMZ800體視顯微鏡下，放大觀察，用注射器針頭剝?nèi)￠L約0. 5mm的顛茄莖尖或側(cè)芽分生組織，接種于附加2，4-D 3. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基(MSA)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 25°C，光照培養(yǎng)，4-6周后，即可誘導(dǎo)胚性細(xì)胞。在體視顯微鏡放大600-800倍的條件下篩選誘導(dǎo)出來的胚性細(xì)胞，誘導(dǎo)出來的體胚可通過繼代到新的附加2，4-D 2. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基(MSB)繼代保存。方法一利用顛茄種子誘導(dǎo)獲得胚性細(xì)胞
水選法篩選成熟飽滿的種子，流水沖洗1小時；75%乙醇處理30秒，然后用2% (M/V) NaClO溶液或0. 1 % (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在MS 培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，胚芽突破種皮后取出胚體，切成數(shù)段，轉(zhuǎn)至 MSA培養(yǎng)基中，25°C，光照培養(yǎng)，4-6周后，即可誘導(dǎo)胚性細(xì)胞。在體視顯微鏡放大觀察的條件下篩選誘導(dǎo)出來的胚性細(xì)胞接種于MSB保存?zhèn)溆?。?shí)施例3
胚性細(xì)胞的篩選、擴(kuò)繁、繼代
誘導(dǎo)出來的胚性細(xì)胞可通過繼代到新的胚性細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基上保存，每月繼代一次， 同時將非胚性愈傷去除以純化體胚，體胚經(jīng)純化和擴(kuò)繁以便保存和提供懸浮培養(yǎng)的材料。胚性愈傷細(xì)胞在擴(kuò)繁6-8周后，將胚性愈傷細(xì)胞過0.5mm的篩網(wǎng)破碎成小細(xì)胞團(tuán)， 轉(zhuǎn)移到加有30-50ml的MS懸浮培養(yǎng)基的三角瓶或者塑料瓶中懸浮培養(yǎng)，3-10d繼代一次，需要在繼代時用0. 5mm篩網(wǎng)進(jìn)行破碎。懸浮培養(yǎng)條件為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm。實(shí)施例4
胚性細(xì)胞再生獲得植株
1、將過篩后懸浮培養(yǎng)10-30d的細(xì)胞培養(yǎng)液去除，并可以用新鮮培養(yǎng)基清洗愈傷一次；
2、吸干細(xì)胞，轉(zhuǎn)至新鮮的MS固體培養(yǎng)基上，25°C光照(16L/8D)培養(yǎng)。每培養(yǎng)20-30天轉(zhuǎn)移到新鮮MS培養(yǎng)基上，在2-6周間將平皿上出現(xiàn)的綠色胚狀體，體胚會逐漸成熟，最終形成叢生芽和小植株。
權(quán)利要求
1.一種利用顛茄外植體誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的方法，特征在于附加2，4-D 3.0mg/L的MS固體培養(yǎng)基MSA誘導(dǎo)胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞在以附加2，4-D 2. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基MSB上篩選、繼代培養(yǎng)，其過程包括(1)在顛茄無菌苗長側(cè)芽誘導(dǎo)胚性細(xì)胞，誘導(dǎo)胚性細(xì)胞，以附加2，4-D3. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基MSA誘導(dǎo)胚性細(xì)胞；(2)胚性細(xì)胞的擴(kuò)繁繼代將胚性細(xì)胞在以附加2，4-D2. Omg/L的MS固體培養(yǎng)基MSB 上篩選、繼代培養(yǎng)，在附加2，4-D 2. Omg/L,0. 2mg/mL 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2. 2g/L KC1、 40g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基LMS上懸浮培養(yǎng)；(3)胚性細(xì)胞誘導(dǎo)植株再生將胚性細(xì)胞在MS培養(yǎng)基上再生完成植株重建。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用顛茄無菌苗誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的方法，其特征在于無菌苗或者繼代苗長至5片葉以上時，去除頂芽和葉片，繼續(xù)培養(yǎng)2天以上，誘導(dǎo)側(cè)芽發(fā)生后，在體視顯微鏡下剝離莖尖，接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用顛茄無菌苗誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的方法，其特征在于所述顛茄胚性細(xì)胞要不斷進(jìn)行純化，其方法是在體視顯微鏡放大篩選誘導(dǎo)出來的典型胚性細(xì)胞， 在新的MSB培養(yǎng)基上繼代、保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用顛茄無菌苗誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(3)中的利用胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)使用較高濃度的KCl和蔗糖的液體培養(yǎng)基，即附加2，4-D 2. Omg/L、0. 2mg/mL 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2. 2g/L KCl、40g/L 蔗糖的 MS 液體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)顛茄胚性細(xì)胞的方法。涉及包含離體培養(yǎng)系統(tǒng)建立，胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)、胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，以及利用胚性細(xì)胞獲得植株再生。其過程是用顛茄無菌苗長誘導(dǎo)胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞的擴(kuò)繁繼代，胚性細(xì)胞誘導(dǎo)植株再生。該方法誘導(dǎo)獲得的胚性細(xì)胞可用于生產(chǎn)脫毒苗，也可以利用遺傳物質(zhì)誘導(dǎo)突變產(chǎn)生新的新品系，也可以作為轉(zhuǎn)化受體獲得了產(chǎn)莨菪烷類生物堿的顛茄轉(zhuǎn)化子。
文檔編號A01H4/00GK102396417SQ20101027624
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者唐克軒, 廖志華, 張磊, 楊春賢, 陳敏 申請人:西南大學(xué)