專(zhuān)利名稱(chēng)：人體唾液保存固定液及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種人體唾液保存固定液的配方、 制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)科研中，血樣中的DNA提取在基因工程和分子生物學(xué)研究中占有重要地位。通常用于PCR反應(yīng)和其他分子測(cè)試的DNA主要從抗凝血中提取，但保存時(shí)間較長(zhǎng)的血樣，即使添加枸櫞酸鈉或EDTA抗凝劑，也會(huì)形成血塊，給提取帶來(lái)不便。同時(shí)，由于采集血液對(duì)人體能造成一定的創(chuàng)傷而且需要一定的專(zhuān)業(yè)技能才能完成，限制了血液作為DNA 來(lái)源的廣泛應(yīng)用。人體唾液中含有口腔黏膜脫落細(xì)胞，收集唾液作為DNA樣本來(lái)源有以下優(yōu)點(diǎn)① 無(wú)穿刺、無(wú)傷害取樣，避免了采血的痛苦和取尿的尷尬；②一些人群并不適合采血，如小孩、 老人。另一些人群則抗拒取血，如某些精神疾病患者，患者的親屬；③簡(jiǎn)便易行，唾液收集只需離心管④廉價(jià)、高效，不需要配備注射器、消毒用具，也不用培訓(xùn)專(zhuān)業(yè)的抽血人員.節(jié)省了大量人力物力；即使經(jīng)過(guò)2周的室溫存放，依然能提取出完整的基因組DNA。當(dāng)大范圍收集樣本時(shí)，唾液樣本適合在各地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室和收集點(diǎn)之間傳遞。人體的唾液中99%是水，有機(jī)物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等， 無(wú)機(jī)物有鈉、鉀、鈣、氯等離子，同時(shí)還含有多種細(xì)菌、口腔脫落細(xì)胞等。因此，如何避免唾液腐敗、保持脫落細(xì)胞內(nèi)基因組DNA完整，對(duì)唾液作為基因組DNA來(lái)源的應(yīng)用至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人體唾液保存固定液及其制備及應(yīng)用。本發(fā)明的人體唾液保存固定液包括如下組分蔗糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、 MgCl 2、異硫氰酸胍及水。以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為 0. 05mol/L 0. 5mol/L，MgCl2 為 0. 5mmol/L 20mmol/ L，pH 為 7 10 的 Tris-HCl 為 lmmol/L 30mmol/L，異硫氰酸胍為 0. 5mol/L 10mol/L。較佳的，以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為0. lmol/L 0. 4mol/L, MgCl2為mol/L 15mmol/L, pH 為 7 10 的 Tris-HCl 為 3m mol/L 20m mol/L，異硫氰酸胍為 lmol/L 6mol/L。優(yōu)選的，以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為0. 2mol/L 0. 4mol/L, MgCl2為mol/L 10mmol/L, pH 為 7 9 的 Tris-HCl 為 5m mol/L 15m mol/L,異硫氰酸胍為 2mol/L 5mol/L。最佳的，蔗糖為0. 25mol/L 0. 35mol/L, MgCl2 為 3m mol/L 8m mol/L, pH 為 7 8. 5 的 Tris-HCl 為 8m mol/L 12m mol/L，異硫氰酸胍為 2. 5mol/L 3. 5mol/L。本發(fā)明人體唾液保存固定液的配制方法包括下列步驟(1)分別配制Tris-HCl緩沖液、蔗糖、MgCl2及異硫氰酸胍的水溶液并滅菌；
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(2)無(wú)菌條件下，將經(jīng)步驟1獲得溶液與無(wú)菌水一起按比例混合配制獲得人體唾液保存固定液。本發(fā)明的人體唾液保存固定液可用于保存人體唾液。該固定液能夠殺滅唾液中含有的細(xì)菌、抑制核酶的活性，保存基因組DNA的完整性。保存及基因組DNA抽提實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明顯優(yōu)于使用單一組分保存唾液，且成本較低，配制方便，有望成為唾液作為基因組DNA來(lái)源的廣泛應(yīng)用所必需的較佳固定液。


圖1實(shí)施例1抽提的唾液基因組DNA電泳圖1為基因組DNA圖2實(shí)施例2固定液固定后放置于不同溫度、不同時(shí)間的唾液樣本基因組DNA抽提瓊脂糖凝膠電泳圖1為4°C放置2周2為25°C放置2周3為37 °C放置2周4為37°C放置1個(gè)月圖3實(shí)施例3固定液處理后提取的唾液基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖條帶為擴(kuò)增片段DNA圖4實(shí)施例4不同成分的固定液固定后的唾液樣本基因組DNA抽提瓊脂糖凝膠電泳圖固定液1無(wú)異硫氰酸胍；固定液2中無(wú)Mgcl2 ；固定液3中無(wú)Tris ；固定液4中無(wú)蔗糖圖5實(shí)施例5不同成分對(duì)提取唾液基因組DNA的因素效應(yīng)6實(shí)施例5固定液處理后提取的唾液基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖編號(hào)1-9分別對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)方案中的實(shí)驗(yàn)編號(hào)。
具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)施例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1固定液固定后唾液基因組DNA抽提人體唾液保存固定液的配方為0. 25mol/L蔗糖，8m mol/L Tris-HCl (pH為8)，3m mol/L MgCl2, 2. 5mol/L 異硫氰酸胍。人體唾液保存固定液的配制方法(1)先配制 IM 蔗糖，IM MgCl2,6M 異硫氰酸胍，IM Tris-HCl (pH 為 8. 0)和 dd H2O, 分別經(jīng)1. lkgf/cm2滅菌20分鐘；(2)以配制IOOml固定液為例，按下述比例混合各種試劑即可IM 蔗糖25mlIM Tris-Hcl (pH 為 8) 0. 8mlIM MgCl20. 3ml6M異硫氰酸胍41.7ml
dd H2O32. 2ml合計(jì)IOOml實(shí)驗(yàn)步驟(1)取500ul唾液樣本(含等體積固定液和唾液，已于一定溫度下放置一定時(shí)間)；(2)將 500ul 混合液放入 1. 5ml 離心管，12000g/5min ；(3)棄上清液，用漩渦振蕩器振蕩片刻；(4)加入 500ul 提取液(KCl、Tris、MgC12、白明膠和 NP40)和 6ul 10mg/ml 的蛋白酶K;(5)將混合液放置于60°C水浴箱，保溫Ih ；(6)加入等體積氯仿，振蕩混勻，于12000g/10min離心，取上清液于1. 5ml離心管內(nèi)；(7)加5M Nacl 6ul于上清液中，使其終濃度達(dá)到0. 1M，再加等體積的異丙醇，混勻后于-20°C冷凍Ih ；(8)離心15000g/15min，可見(jiàn)DNA沉淀，加入70%的酒精清洗DNA ；(9)離心l5000g/10min，棄上清夜；(10)加入TE SOul溶解DNA，4°C冰箱保存待用，如長(zhǎng)期保存放置于_20°C ；(11)準(zhǔn)備的瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠(EB)20ul/100ml凝膠液中；(12)在錫紙上將點(diǎn)樣緩沖液和DNA溶液混勻；(13)分別將樣品加入準(zhǔn)備好的凝膠電泳場(chǎng)電泳，電泳緩沖液為T(mén)BE ；(14)30min后取凝膠在凝膠成像系統(tǒng)中分析，觀察DNA條帶，如圖1。結(jié)果說(shuō)明如圖1顯示，用該固定液提取人類(lèi)唾液基因組DNA效率高，分子量大， DNA完整。實(shí)施例2固定液固定后放置于不同溫度、不同時(shí)間的唾液樣本基因組DNA抽提人體唾液保存固定液的配方同實(shí)施例1人體唾液保存固定液的配制方法同實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1，結(jié)果如圖2。如圖2顯示1號(hào)為固定液固定人類(lèi)唾液后，放置室溫(25°C ) 7天后提取基因組 DNA ；2號(hào)為固定液固定人類(lèi)唾液后，放置37°C 7天后提取基因組DNA;3號(hào)為固定液固定人類(lèi)唾液后，放置-20°C冰箱7天后提取基因組DNA ；4號(hào)為固定液固定人類(lèi)唾液后，放置4°C冰箱7天后提取基因組DNA.由圖中結(jié)果表明該固定液對(duì)人類(lèi)唾液樣本DNA保存具有明顯效果，無(wú)論是不同溫度下(37°C，25°C，4°C，-20°C )還是不同天數(shù)均具有有效的提取效果。實(shí)施例3固定液固定后室溫下放置一個(gè)月后的唾液樣本基因組DNA抽提及PCR擴(kuò)增人體唾液保存固定液的配方同實(shí)施例1人體唾液保存固定液的配制方法同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)步驟
1.抽提方法同實(shí)施例1 ；2. PCR擴(kuò)增條件1)95 "C 3min2)94°C 30s3) 50°C 30s4) 72°C 30s5)72°〇延伸5111土116)4°C 冷卻。步驟2)至步驟4)循環(huán)35次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3:圖3為采用本唾液固定液提取5個(gè)不同來(lái)源樣本基因組DNA，經(jīng)上述PCR擴(kuò)增后均有明顯產(chǎn)物，表明該固定液固定人類(lèi)唾液所提取的基因組DNA適合進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。(圖 3 是 L印tin 基因的 PCR 產(chǎn)物，引物分別為 5，-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3， 和5 ‘-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3，)實(shí)施例4不同成分的固定液固定后的唾液樣本基因組DNA抽提人體唾液保存固定液的配方為(1) 0. 25mol/L 蔗糖，8m mol/L Tris-Hcl (pH 為 8)，3m mol/L MgCl2 ；(2) 0. 25mol/L 蔗糖，8m mol/L Tris-Hcl (pH 為 8)，2. 5mol/L 異硫氰酸胍；(3) 0. 25mol/L 蔗糖，3m mol/L MgCl2, 2. 5mol/L 異硫氰酸胍；(4) 8m mol/L Tris-Hcl (pH 為 8)，3m mol/L MgCl2, 2. 5mol/L 異硫氰酸胍。人體唾液保存固定液的配制方法同實(shí)施例1按上述配方中試劑內(nèi)容進(jìn)行配制。實(shí)驗(yàn)步驟唾液用四種不同成分的固定液固定后，基因組DNA抽提實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 圖4結(jié)果表明固定液中四種成分缺少任何一種將導(dǎo)致唾液基因組DNA抽提效果變差。實(shí)施例5不同配比的固定液固定后的唾液樣本基因組DNA抽提實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)固定液做四因素、三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，抽提方法同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)方案如下
權(quán)利要求
1.一種人體唾液保存固定液，包括如下組分蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、異硫氰酸胍及水。
2.如權(quán)利要求1所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為 0. 05mol/L 0. 5mol/L, MgCl2 為 0. 5m mol/L 20m mol/L, pH 為 7 10 的 Tris-HCl 為 Im mol/L 30m mol/L，異硫氰酸胍為 0. 5mol/L 10mol/L。
3.如權(quán)利要求2所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為0. lmol/L 0. 4mol/L, MgCl2為2m mol/L 15m mol/L, pH為 7 10 的 Tris-HCl 為 3m mol/L 20m mol/L，異硫氰酸胍為 lmol/L 6mol/L。
4.如權(quán)利要求3所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為0. 2mol/L 0. 4mol/L, MgCl2為2m mol/L 10m mol/L, pH為 7 9 的 Tris-HCl 為 5m mol/L 15m mol/L，異硫氰酸胍為 2mol/L 5mol/L。
5.如權(quán)利要求4所述人體唾液保存固定液，其特征在于，所述人體唾液保存固定液中， 以質(zhì)量體積濃度計(jì)，蔗糖為0. 25mol/L 0. 35mol/L,MgCl2為3m mol/L 8m mol/L, pH為 7 8. 5 的 Tris-HCl 為 8m mol/L 12m mol/L，異硫氰酸胍為 2. 5mol/L 3. 5mol/L。
6.如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述人體唾液保存固定液的制備方法，包括下列步驟(1)分別配制Tris-HCl緩沖液、蔗糖、MgCl2及異硫氰酸胍的水溶液并滅菌；(2)無(wú)菌條件下，將經(jīng)步驟1獲得溶液與無(wú)菌水一起按比例混合配制獲得人體唾液保存固定液。
7.如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述人體唾液保存固定液用于保存人體唾液。
全文摘要
本發(fā)明涉及人體唾液保存固定液及其制備與應(yīng)用，本發(fā)明的人體唾液保存固定液包括如下組分蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、異硫氰酸胍及水。本發(fā)明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明顯優(yōu)于使用單一組分保存唾液，且成本較低，配制方便，有望成為唾液作為基因組DNA來(lái)源的廣泛應(yīng)用所必需的較佳固定液。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102440234SQ20101029921
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者孫長(zhǎng)勝, 張健, 張?zhí)炝? 彭麗娟, 江三多, 魏寧, 鮑曉妮 申請(qǐng)人:上海泛亞生命科技有限公司