專利名稱：環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毒性測(cè)試方法，具體為環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方 法，屬于魚類急性毒性測(cè)試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近三十年來，環(huán)境中的外源性化合物——環(huán)境雌激素(Environmental estrogens)能夠造成人類和野生動(dòng)物發(fā)育和繁殖方面的健康損害，引起了人們高度重視， 目前已報(bào)道的環(huán)境雌激素危害包括男性精液減少、野生魚類性發(fā)育紊亂(包括雌雄同體、 雄魚雌化等)、兩棲動(dòng)物(如短吻鱷、蟾蜍)種群減少等。環(huán)境雌激素是內(nèi)分泌干擾物中重要 的一類，它們或者屬于天然雌激素(即由生物體內(nèi)源雌激素排泄而進(jìn)入環(huán)境)，或者屬于人 工合成雌激素以及具有雌激素活性的合成化學(xué)品，當(dāng)其進(jìn)入生物體后能模擬體內(nèi)內(nèi)源性雌 激素的功能和行為，引發(fā)類雌激素反應(yīng)，從而對(duì)生物體的激素平衡、生殖、發(fā)育和行為等造 成負(fù)面影響。研究證實(shí)，目前環(huán)境中已經(jīng)存在成百上千種具有不同雌激素活力的化合物。其 中，幾種常見的環(huán)境雌激素及其雌激素活力和來源如表1所示；
*EEq (17 β-E2 Equivalent)換算成17 β -雌二醇的雌激素活力當(dāng)量。
雌激素活力當(dāng)量越大，對(duì)生物體潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)就越強(qiáng)，因此，E2和EE2是 兩種最受關(guān)注的環(huán)境雌激素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化性質(zhì)見表2。前者是天然雌激素中雌 激素活力最強(qiáng)的一種，通常被用作值為1的雌激素當(dāng)量，以衡量其他化合物的雌激素活力。 E2由人或動(dòng)物分泌而成，主要通過糞便和尿液進(jìn)入自然環(huán)境。據(jù)報(bào)道，一頭奶牛每天排泄的 糞便中E2含量達(dá)17(Γ1230 μ g/kg，成年女性E2的排泄量可達(dá)82 695 μ g/天，而懷孕期 間婦女E2的排泄量可達(dá)平時(shí)的1000倍。后者是人工合成的雌激素，主要作為女性避孕藥 和治療絕經(jīng)期綜合癥的雌激素替代療法用藥；
權(quán)利要求
環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，其特征在于具體步驟如下1)首先稱取1 mg的E2溶于500 ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中，配制成2 mg/L的E2儲(chǔ)備液，將試劑瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，用同樣的方法配制2 mg/L的EE2儲(chǔ)備液并保存；2)試驗(yàn)時(shí)，取出上述儲(chǔ)備液，待恢復(fù)到室溫并充分搖勻后，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水分別于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)配制濃度為1、0.2、0.04 mg/L，8、1.6 μg/L和10、0.05 mg/L的E2和EE2的暴露溶液，并各移取20 ml放入培養(yǎng)皿中；空白對(duì)照為20 ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，另取經(jīng)脫脂棉過濾的長江水20 ml作為自然水體環(huán)境對(duì)照，以上暴露液和對(duì)照液均設(shè)置3組平行；3)隨機(jī)挑選處于囊胚期的活胚胎置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察試驗(yàn)，在每個(gè)裝有暴露液和對(duì)照液的培養(yǎng)皿內(nèi)放入10個(gè)胚胎，然后將胚胎置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在2 10℃條件下保持恒溫、無光照，試驗(yàn)持續(xù)30天，每天用倒置顯微鏡觀察測(cè)試的終點(diǎn)，并記錄；4)使用SPSS 13.0 for Windows軟件，對(duì)大銀魚胚胎在暴露濃度下與空白下的存活、生長和發(fā)育進(jìn)行顯著性分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，其特征在于 所述的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，采用分析純的化學(xué)品和全玻璃蒸餾水或去離子水，取氯化鈣溶液、硫酸 鎂溶液、碳酸氫鈉溶液和氯化鈉溶液4種溶液各25 ml加以混合，稀釋至1 L，稀釋用水需經(jīng) 曝氣至氧飽和為止，然后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，其特征在于 所述的氯化鈣溶液是將11. 76 g CaCl2CH2O溶解于1 L水中，所述的硫酸鎂溶液是將4. 93 g MgSO4WH2O溶解于1 L水中，所述的碳酸氫鈉溶液是將2. 59 g NaHCO3溶解于1 L水中， 所述的氯化鈉溶液是將0. 23 g KCl溶解于1 L水中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，其特征在于 步驟2)中各暴露濃度組的配制方法如下取12. 5 ml E2或EE2儲(chǔ)備液于等體積的標(biāo)準(zhǔn)稀 釋水中，配成1 mg/L的E2或EE2暴露液25 ml ；充分混勻后按5倍體積逐級(jí)稀釋成200、 40、8和1. 6 μ g/L的暴露液；然后再取125 μ L的1. 6 μ g/L暴露液于19. 875 ml標(biāo)準(zhǔn)稀 釋水中，配成10 mg/L的暴露液；取100 μ L的10 mg/L暴露液于19. 9 ml稀釋水中，配成 0. 05 ng/L的暴露液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，其特征在于 步驟3)中，將胚胎置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在8°C條件下保持恒溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，其特征在于 步驟3)中，采用半靜態(tài)暴露方式，所有暴露液和對(duì)照液每2天更換一次；更換溶液時(shí)，用吸 管逐一地吸取胚胎轉(zhuǎn)移至新鮮溶液內(nèi)，如有死亡胚胎或死亡的幼魚，采用吸管吸取將之移 除；測(cè)試的終點(diǎn)包括致死、致畸和孵化延遲。全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)境雌激素對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性測(cè)試方法，利用胚胎對(duì)環(huán)境污染物或者化學(xué)物質(zhì)刺激的敏感性，將大銀魚胚胎暴露于含有受試物的一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水溶液中，以半靜態(tài)條件進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)從將處于囊胚期的活胚胎暴露于含受試物的水溶液開始，至對(duì)照組和暴露組中所有的胚胎孵化完成結(jié)束，持續(xù)30天左右。毒性終點(diǎn)包括致死、致畸和孵化延遲。通過對(duì)暴露組毒性終點(diǎn)的觀察及與對(duì)照組的比較，確定該受試物對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育的毒性。研究兩種天然雌激素E2和EE2對(duì)大銀魚胚胎-卵黃囊階段的影響，以確定它們對(duì)大銀魚胚胎發(fā)育毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并且評(píng)價(jià)該魚種暴露在雌激素環(huán)境濃度水平下存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A01K61/00GK101982072SQ201010502878
公開日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月11日
發(fā)明者史江紅, 孟耀斌, 張洪渠, 朱江, 朱英, 沈根祥, 王振旗, 王曉丹, 胡雙慶, 趙慶節(jié), 郭春霞, 錢曉雍, 顧海蓉 申請(qǐng)人:上海市環(huán)境科學(xué)研究院;北京師范大學(xué)