專利名稱：文心蘭離體葉片誘導(dǎo)體胚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文心蘭組織培養(yǎng)的方法，特別是一種從文心蘭離體葉片誘導(dǎo)體胚并最 終獲得再生植株的方法，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
文心蘭i/hcidiuni flexuosum Lodd),又名舞女蘭、瘤瓣蘭，為蘭科 (flrcAii/aceae)瘤瓣蘭屬iXhcidiwn 5k )植物，是世界花卉業(yè)重要的盆花和切花種類之 一。文心蘭無(wú)論屬內(nèi)雜交還是屬間雜交，其親和力都較差、授粉結(jié)實(shí)機(jī)率低，通過(guò)雜交培育 新品種難度大、周期長(zhǎng)，采用新技術(shù)新方法獲得文心蘭新品種將是未來(lái)文心蘭育種的重要 途徑。能生成單細(xì)胞體胚的葉片是上佳的育種材料和轉(zhuǎn)基因受體材料。Chen and Chang 首先報(bào)道了文心蘭(Oncidium Gower Ramsey)離體葉片在添加TDZ的改良1/2MS培養(yǎng)基 上誘導(dǎo)出了直接體胚，這些體胚能形成原球莖，進(jìn)而發(fā)育成正常的植株(Chen and Chang, Plant Cell Rep, 1999，19: 143-149)。文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉背、葉緣、葉切口 均能形成體胚，培養(yǎng)基的成分和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及品種差異對(duì)文心蘭離體葉片誘導(dǎo)體胚 有很大影響(Su, Chen and Chang. Biologia Plantarum，2006，50 (1):107_110)。建立高 效穩(wěn)定的葉片體胚誘導(dǎo)及再生體系是開(kāi)展文心蘭生物技術(shù)育種工作的關(guān)鍵步驟之一。

發(fā)明內(nèi)容
采用目前的組織培養(yǎng)體系，文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉緣、葉中切口、葉基部 切口均能形成體胚，這些體胚能迅速增殖并形成原球莖，與其他外植體獲得的原球莖沒(méi)有 差異，最終能成為正常植株。文心蘭離體葉片誘導(dǎo)生成的體胚，源自葉片表皮或葉肉單一細(xì) 胞，非常適合應(yīng)用于育種領(lǐng)域，如多倍體育種、轉(zhuǎn)基因育種等。但文心蘭離體葉片體胚誘導(dǎo) 率較低，一般不超過(guò)30%，且誘導(dǎo)率很不穩(wěn)定，本發(fā)明主要通過(guò)選擇適宜的葉片外植體、優(yōu)化 培養(yǎng)條件來(lái)提高文心蘭離體葉片體胚誘導(dǎo)率和穩(wěn)定性，使文心蘭離體葉片的體胚誘導(dǎo)率保 持在90%以上，為文心蘭育種提供了大量源于葉片的胚性單細(xì)胞，這些能形成體胚-類原球 莖并可獲得再生植株的胚性單細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因育種工程的最佳受體細(xì)胞。本發(fā)明的具體描述如下
(1)通過(guò)組織培養(yǎng)可獲得大量的無(wú)菌文心蘭幼苗，這些幼苗起初往往是叢生的，按其形 態(tài)發(fā)育特性可分為無(wú)根幼苗和帶根幼苗，盡管無(wú)根幼苗和帶根幼苗剪下的葉片都能生成體 胚，但無(wú)根苗和帶根苗的生理狀態(tài)是有差異的，帶根幼苗離體葉片的體胚誘導(dǎo)率是無(wú)根的 2-3倍，選擇帶根幼苗作為外植體供體能顯著提高文心離體葉片體胚誘導(dǎo)率。(2)文心蘭無(wú)菌試管苗中的幼葉處于最初的生長(zhǎng)階段，其葉片的長(zhǎng)短與生長(zhǎng)時(shí)間 呈正相關(guān)，葉片的長(zhǎng)短在一定程度上顯示了葉齡和苗齡。實(shí)驗(yàn)表明葉片長(zhǎng)度對(duì)體胚誘導(dǎo)率有顯著影響，小于10毫米的葉片體胚誘導(dǎo)率低于15%，長(zhǎng)度為25-30毫米的葉片體胚誘導(dǎo)率 為30%，當(dāng)葉片長(zhǎng)度大于30毫米時(shí)，葉片體胚誘導(dǎo)率僅為12%，當(dāng)葉片長(zhǎng)度為12-22毫米，葉 片體胚誘導(dǎo)率超過(guò)90%。選擇適宜的葉片長(zhǎng)度，對(duì)于維持較高的體胚誘導(dǎo)率至關(guān)重要，文心 蘭離體葉片最適宜的尺寸是15毫米-22毫米，文心蘭無(wú)菌幼苗的長(zhǎng)度最好在15毫米-25 毫米范圍(不計(jì)根的長(zhǎng)度)。(3)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響文心蘭離體葉片體胚誘導(dǎo)的關(guān)鍵因子之一。噻苯隆 (TDZ)、6-芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素具有強(qiáng)烈促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，三種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)文心蘭離體葉片體胚誘導(dǎo)均具有強(qiáng)烈的促進(jìn)效果，其中TDZ的效果要好于 6_芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素；通常三種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用的濃度范圍分別是TDZ 0. 1毫 克-3毫克/升，6-芐基腺嘌呤0. 5毫克-3毫克/升，細(xì)胞激動(dòng)素0. 5毫克-3毫克/升。 TDZ),6-芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素的組合使用能有效促進(jìn)文心蘭離體葉片體胚誘導(dǎo)率。較 好的組合是以TDZ為主，再添加適量的6-芐基腺嘌呤或細(xì)胞激動(dòng)素。比較適宜的植物生長(zhǎng) 調(diào)節(jié)劑添加方案是TDZ0. 3毫克-0. 5毫克/升+ 6-芐基腺嘌呤0. 5毫克-1. 0毫克/升。(4)在文心蘭組織培養(yǎng)過(guò)程中，文心蘭離體葉片的褐化尤其是從葉片的切口處出 現(xiàn)的褐化現(xiàn)象是嚴(yán)重影響體胚誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素之一。褐化通常是在葉片離體培養(yǎng)10天 左右出現(xiàn)，最初發(fā)生的部位是葉基部切口和葉片中切口邊緣，顏色由淡褐色逐漸加深至深 褐色或黑色，葉片一旦出現(xiàn)褐化，基本上無(wú)法誘導(dǎo)形成體胚。文心蘭離體葉片培養(yǎng)過(guò)程中出 現(xiàn)的褐化與常規(guī)植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象相類似，是由植物細(xì)胞中酚類化合物被氧 化產(chǎn)生褐色的酚醌類化合物。在培養(yǎng)基中添加活性碳和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)能有效 控制文心蘭離體葉片褐化的發(fā)生。兩者添加濃度范圍均為100毫克-1000毫克/升，較合 適的組合是活性碳100毫克-200毫克/升，PVPP 100毫克-300毫克/升。(5)在文心蘭離體葉片培養(yǎng)時(shí)，鐵鹽的濃度對(duì)離體葉片和葉片切口的褐化有較大 影響。適度降低培養(yǎng)基中鐵離子的濃度，對(duì)減少文心蘭離體葉片的褐化率和減輕褐化程度 有較好效果。二價(jià)鐵鹽在培養(yǎng)基中的濃度范圍是5毫克-20毫克/升，比較適合的鐵鹽濃 度是10毫克-15毫克/升。(6)文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉背、葉緣、葉切口均能形成體胚，在一般情況 下，葉尖是最易形成體胚的部位(Chen and Chang, Plant Cell, 2002,69 41-44)。當(dāng)我們 需要提高文心蘭離體葉片切口(傷口)的體胚誘導(dǎo)率時(shí)，可選擇以下2種方法(根據(jù)需要2 種方法可同時(shí)使用)1)剪去離體葉片的葉尖(1-3毫米)或在葉片中部剪一寬度為葉片寬 1/2的口子，以增加切口的長(zhǎng)度和面積，提高體胚誘導(dǎo)率。但要注意控制切口長(zhǎng)度與葉面積 的比率，不能使葉片受傷過(guò)度；2)適當(dāng)提高TDZ的濃度。在較低濃度下(TDZ0. 1毫克/升一 TDZ0. 3毫克/升)，離體葉片葉尖就具有較高的體胚誘導(dǎo)率，將TDZ增加到0. 5毫克/升，可 顯著增加離體葉片切口的體胚誘導(dǎo)率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
文心蘭“百萬(wàn)金幣”(Oncidium ‘Million Dollar，)原球莖轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基 添加磷酸二氫鈉170mg毫克/升，谷胺酰胺500毫克/升，吲哚丁酸(IBA) 1.0毫克/升， 谷胺酰胺500毫克/升，活性碳1000毫克/升，蔗糖30，000毫克/升，瓊脂7，000毫克/升，ρΗ5· 5)，培養(yǎng)溫度24-26°C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度為1200_16001x。每隔60天換一 次培養(yǎng)基，選取15毫米-25毫米長(zhǎng)的帶根幼苗作為外植體供體。葉片處理 將葉片從基部剪下，在葉片中間剪一寬度約為一半葉寬的口子，近軸 面朝上置于培養(yǎng)基上，每一培養(yǎng)皿(直徑90毫米)中放入8-12片葉片。體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為1/2 MS (Murashige T, Skoog F, 1962)培 養(yǎng)基(其中微量元素和有機(jī)添加物為全量，鐵鹽減半)，其他添加物為磷酸二氫鈉170毫克/ 升，谷胺酰胺1000毫克/升，蛋白胨1000毫克/升，TDZ 0. 30毫克/升，6-芐基腺嘌呤1. 0 毫克/升，PVPP300毫克/升，活性碳200毫克/升蔗糖20，000毫克/升，8611^丨6 2,800 毫克/升，ρΗ5· 2，121°C滅菌15分鐘。培養(yǎng)條件暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24-26 °C。
培養(yǎng)60天后，絕大多數(shù)文心蘭離體葉片生成體胚，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)(溫度24-26°C， 光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度為1200-16001x) 20-30天，此時(shí)體胚發(fā)育成原球莖，即可轉(zhuǎn)入文 心蘭常規(guī)組織培養(yǎng)體系，獲得再生植株。實(shí)施例2
文心蘭“百萬(wàn)金幣”(Oncidium ‘Million Dollar，)原球莖轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基 添加磷酸二氫鈉170mg毫克/升，谷胺酰胺500毫克/升，吲哚丁酸(IBA) 1.0毫克/升， 谷胺酰胺500毫克/升，活性碳1000毫克/升，蔗糖30，000毫克/升，瓊脂7，000毫克/ 升，ρΗ5· 5)，培養(yǎng)溫度24-26°C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度為1200_16001x。每隔60天換一 次培養(yǎng)基，選取15毫米-25毫米長(zhǎng)的帶根幼苗作為外植體供體。葉片處理 將葉片從基部剪下，剪去葉片頂端約1-3毫米，近軸面朝上置于培養(yǎng) 基上，每一培養(yǎng)皿(直徑90毫米)中放入8-12片葉片。體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為1/2 MS (Murashige T, Skoog F, 1962)培 養(yǎng)基(其中微量元素和有機(jī)添加物為全量，鐵鹽減半)，其他添加物為磷酸二氫鈉170毫克/ 升，谷胺酰胺1000毫克/升，蛋白胨1000毫克/升，TDZ 0. 50毫克/升，6-芐基腺嘌呤1. 0 毫克/升，PVPP500毫克/升，活性碳200毫克/升蔗糖20，000毫克/升，8611^丨6 2,800 毫克/升，ρΗ5· 2，121°C滅菌15分鐘。培養(yǎng)條件暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24_26°C。
培養(yǎng)60天后，絕大多數(shù)文心蘭離體葉片切口處生成體胚，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)(溫度 24-26°C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度為1200-16001x) 20-30天，此時(shí)體胚發(fā)育成原球莖，即 可轉(zhuǎn)入文心蘭常規(guī)組織培養(yǎng)體系，獲得再生植株。
權(quán)利要求
一種從文心蘭離體葉片高效誘導(dǎo)體胚的方法，其特征在于以取自文心蘭(Oncidium flexuosum)“百萬(wàn)金幣”無(wú)菌幼苗的離體葉片為外植體，培養(yǎng)基為添加TDZ(噻苯隆，thidiazuron)、6 芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素的改良1/2MS培養(yǎng)基，20 28℃暗培養(yǎng)50 60天，絕大部分葉片可誘導(dǎo)生成體胚，繼續(xù)培養(yǎng)可形成類原球莖，并最終獲得正常的再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文心蘭腫/Y^rao1S腫)，是指蘭科(Orchidaceae)瘤 瓣蘭屬(Oncidium)的植物，包括與文心蘭(itocii/i flexuosum)的雜交品種，包括但不 限于如下品種南茜Gower Ramsey)火山皇后伽ee/ )、野貓 Colmanara wildcat) ^QloAlxxre (One. Golden Shower)霓虹雪影Ralph Yagi Jon)、 甜蜜蜜(itoc. Sharry fe知)、黛麗絲(^c. Pink Deluxe，Maroon ite/i勸 ，)、雅露賓 (One. Kra thoomban )、艾 _ 莎(itoc. Ralph yagielsa )、金色回憶(Golden Anni versary 歷7 /ο·5)、蜜糖(One. Sweet Sugar)、羅漢(One. Aloha Iwanaga) (One. Million Dollar)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文心蘭無(wú)菌幼苗，其特征為葉片長(zhǎng)度為10毫米-30毫米的帶 根或不帶根的幼苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文心蘭無(wú)菌苗離體葉片，其特征為從幼苗葉基部剪取長(zhǎng)度 8-30毫米的完整葉片，為增加體胚誘導(dǎo)的數(shù)量，可剪去葉尖部位(約1-3毫米)或可在葉片 中部剪一寬度約為葉寬一半的口子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ(噻苯隆， thidiazuron),6-芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素成分，其特征為至少添加TDZ、6_芐基腺嘌呤和 細(xì)胞激動(dòng)素三種成分的一種或三種成分的組合，TDZ、6-芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素在培養(yǎng)基 中的濃度范圍均為0. 1毫克_3毫克/升；效果較好的一種組合是TDZ 0. 5毫克/升+6-芐 基腺嘌呤1毫克/升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良1/2MS培養(yǎng)基，其特征為在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑活性 碳和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)兩種成分的一種或兩種成分的組合，兩種成分濃度范圍均為 100毫克-1000毫克/升，比較合適的組合是活性碳100毫克-200毫克/升，PVPP 200毫 克-500毫克/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良1/2MS培養(yǎng)基，其特征在于減少培養(yǎng)基中二價(jià)鐵鹽的用 量，以FeSO4Jl2O計(jì)，二價(jià)鐵鹽在培養(yǎng)基中的濃度范圍是5毫克-20毫克/升，比較適合的鐵 鹽濃度是10毫克-15毫克/升。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了從文心蘭離體葉片誘導(dǎo)體胚并最終獲得再生植株的方法，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以文心蘭(Oncidiumflexuosum)“百萬(wàn)金幣”無(wú)菌苗葉片為外植體，培養(yǎng)基為添加TDZ、6-芐基腺嘌呤和細(xì)胞激動(dòng)素的改良1/2MS培養(yǎng)基，24-26℃暗培養(yǎng)50-60天，90%以上的葉片能誘導(dǎo)生成體胚，體胚發(fā)生的位置在葉尖、葉切口、葉面和葉緣，這些體胚均能進(jìn)一步發(fā)育成類原球莖(PLBs)，最終獲得正常的再生植株。采用本發(fā)明建立的文心蘭離體葉片-體胚-植株再生體系，為文心蘭育種提供了大量源于葉片的胚性單細(xì)胞，這些能形成體胚-類原球莖并可獲得再生植株的胚性單細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因育種工程的最佳受體細(xì)胞。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101940162SQ20101050341
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者喬桂榮, 劉明英, 卓仁英, 李海營(yíng), 蔣晶, 謝麗華, 邱文敏 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所;蔣晶