專利名稱：一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種單倍體育種技術(shù)。
背景技術(shù)：
通過(guò)單倍體培養(yǎng)，豐富的分離、變異和重組在當(dāng)代就能顯示，并可以通過(guò)染色體加 倍以純合的形式永久穩(wěn)定下來(lái)。與常規(guī)育種技術(shù)相比較，單倍體育種技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)首 先，可顯著加快純合速度，應(yīng)用單倍體育種可縮短作物育種周期5-6個(gè)世代；其次，加倍單 倍體的隱性基因不受顯性基因遮蓋而能正常表達(dá)，可顯著提高基因型的選擇效率和選擇的 準(zhǔn)確性，有利于多基因重組和隱性基因的選擇。此外，單倍體培養(yǎng)在遺傳分析、基因工程、分 子生物學(xué)及物種進(jìn)化等領(lǐng)域，都有重要的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。甜辣椒(即Capsicum annuum L.，包括甜椒和辣椒等不同基因型)單倍體的發(fā)生 主要通過(guò)雄核發(fā)育途徑，即可通過(guò)花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)得到其單倍體。20世紀(jì)70 年代，我國(guó)在國(guó)際上最早開展了甜辣椒花藥培養(yǎng)研究。其后，國(guó)內(nèi)外的多位科研工作者在甜 辣椒花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)上投入了大量精力。目前，甜辣椒花藥培養(yǎng)獲得了一定發(fā) 展，但真實(shí)培養(yǎng)效率不能令人滿意，尚存在基因型反應(yīng)率低、有效胚狀體發(fā)生率低、培養(yǎng)周 期長(zhǎng)、內(nèi)生菌污染嚴(yán)重等問題。因此，要獲得一定群體規(guī)模的加倍單倍體須耗費(fèi)大量資源和 工作量，培養(yǎng)時(shí)間也大大拉長(zhǎng)，不能滿足育種實(shí)踐需要。游離小孢子培養(yǎng)不受母體組織影響，且成熟游離培養(yǎng)體系的一次培養(yǎng)產(chǎn)胚量大， 同時(shí)游離小孢子還具備分散性單細(xì)胞特點(diǎn)，是理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。但甜辣椒游離小 孢子培養(yǎng)難度大，國(guó)內(nèi)外曾有過(guò)辣椒基因型材料的成功報(bào)道，但關(guān)于甜椒基因型材料尚無(wú) 成功報(bào)道，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室數(shù)次重復(fù)，發(fā)現(xiàn)報(bào)道方法受基因型限制大，甜椒材料基本上無(wú)法獲得 理想的胚狀體發(fā)生率及再生株獲得率。此外，在普通的甜辣椒單倍體培育實(shí)驗(yàn)中，單倍體植株的加倍也一直是一個(gè)難點(diǎn)。 經(jīng)過(guò)自然加倍或人工加倍得到的雙單倍體(Doubled Haploid,DH)植株對(duì)于育種、分子生物 學(xué)、遺傳學(xué)研究等具有重要意義。而甜辣椒小孢子培養(yǎng)或花藥培養(yǎng)得到的再生株中，自然加 倍的DH株所占比例僅為30%左右。其余為單倍體、混倍體、非整倍體等，其中單倍體所占比 例最大，約為55%左右(培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和基因型的不同可導(dǎo)致差異)?，F(xiàn)有技術(shù)中常用 的田間秋水仙堿加倍法的加倍效果也并不理想。因此，大量的單倍體植株被浪費(fèi)，限制了甜 辣椒單倍體培育技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠解決上述問題，可以較為高效地獲得甜辣椒雙單倍 體植株的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其步驟如下(1)選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害的植株作為供體植株，通過(guò)鏡檢選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期至雙核早期的花蕾，4°C低溫預(yù)處理花蕾1-3天；(2)選取合適大小的花蕾——不同基因型的處在上述發(fā)育時(shí)期的花蕾大小可有不 同，大致上，合適的花蕾處在花瓣與花萼呈平齊狀態(tài)至花瓣稍長(zhǎng)于花萼的狀態(tài)之間，更一般 地，可選擇花瓣不短于花萼的花蕾；將花蕾剝?nèi)セㄝ嗪?，先?5% (ν/ν)的酒精浸泡30s，再用8-10% (ν/ν)的次氯酸 鈉振蕩消毒10-20min，然后用無(wú)菌水清洗3次，每次3-5min ；(3)在工作臺(tái)上將花藥完好無(wú)損地剝離，以每60mm直徑培養(yǎng)皿接種12_18枚花藥 的密度接種于N4-3固液雙層培養(yǎng)基上，所述N4-3固液雙層培養(yǎng)基的配方為固體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和 瓊脂粉的含量分別是它們相對(duì)于所述NTH培養(yǎng)基的重量百分比；液體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對(duì)于NTH培養(yǎng)基的重量百分比；所述固體層經(jīng)121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌；(4)花藥先在觀_351條件下黑暗培養(yǎng)1-10天，再轉(zhuǎn)移到25_28°C條件下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)；(5)培養(yǎng)4-7周時(shí)間，即可看到大量胚狀體發(fā)生，將子葉型胚狀體轉(zhuǎn)移到不加激素 的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯苗。如上所述的獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其中，所述NTH培養(yǎng)基的配方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/ L,磷酸二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水 鉬酸鈉:0. 25mg/L,無(wú)水硫酸銅0. 025mg/L,六水氯化鈷0. 03mg/L,肌醇:100mg/L，煙酸 5mg/L，鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,鹽酸硫胺素0. 5mg/L,甘氨酸:2mg/L,葉酸:5mg/L，生物素 0. 5mg/L。一種用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養(yǎng)基，為固液雙層培養(yǎng)基，其配方為固體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和 瓊脂粉的含量分別是它們相對(duì)于所述NTH培養(yǎng)基的重量百分比；液體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對(duì)于NTH培養(yǎng)基的重量百分比；所述固體層經(jīng)121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌。如上所述的用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養(yǎng)基，其中，所述NTH培養(yǎng)基的配 方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/ L,磷酸二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水 鉬酸鈉:0. 25mg/L,無(wú)水硫酸銅0. 025mg/L,六水氯化鈷0. 03mg/L,肌醇:100mg/L，煙酸 5mg/L，鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,鹽酸硫胺素0. 5mg/L,甘氨酸:2mg/L,葉酸:5mg/L，生物素 0. 5mg/L。本發(fā)明的有益效果為應(yīng)用本發(fā)明的培育方法，甜辣椒胚狀體的發(fā)生突破了基因型的限制，特別是甜椒 基因型的培養(yǎng)效率得到了大幅度提高。同時(shí)，甜椒和辣椒的再生株中DH株比率均得到了明顯提高。本發(fā)明培育方法及培養(yǎng)基中的組分戊炔草胺是一種生產(chǎn)上常用的選擇性除草劑， 其作為一種抗微管物質(zhì)，可有效抑制紡錘絲的形成，使植物染色體復(fù)制而不分開，從而使染 色體加倍。與秋水仙堿相比，戊炔草胺的染色體加倍效果相當(dāng)，應(yīng)用濃度低，并具有無(wú)毒的 特性。


圖1為采用本發(fā)明培育方法的胚狀體發(fā)生情況示意照片。圖2為采用本發(fā)明培育方法的胚狀體成苗情況示意照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明的甜辣椒雙單倍體培育方法的具體步驟如下(1)選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害植株作為供體植株，嚴(yán)格按鏡檢結(jié)果選取小孢子發(fā)育 處于單核靠邊期至雙核早期的花蕾，4°C低溫預(yù)處理花蕾1-3天；(2)取合適大小的花蕾，剝?nèi)セㄝ嗪?，?5% (ν/ν)的酒精浸泡30s，再用8_10% (ν/ν)的次氯酸鈉振蕩消毒10-20min，最后用無(wú)菌水清洗3次，每次3-5min ；(3)在工作臺(tái)上將花藥完好無(wú)損的剝離，以每60mm直徑培養(yǎng)皿12_18枚花藥的密 度接種于N4-3固液雙層培養(yǎng)基上，N4-3培養(yǎng)基的配方為固體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和 瓊脂粉的含量分別是它們相對(duì)于所述NTH培養(yǎng)基的重量百分比；液體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對(duì)于NTH培養(yǎng)基的重量百分比；所述固體層經(jīng)121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌；(4)花藥先在觀_351條件下黑暗培養(yǎng)1-10天，再轉(zhuǎn)移到25_28°C條件下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)；(5)培養(yǎng)4-7周時(shí)間，即可看到大量胚狀體發(fā)生，將子葉型胚狀體轉(zhuǎn)移到不加激素 的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯苗；待再生株長(zhǎng)至3-4片真葉，切取葉片，通過(guò)流式細(xì)胞儀或保 衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法鑒定植株倍性。二倍體植株的準(zhǔn)確鑒定以田間植株的坐果與結(jié)籽情況為準(zhǔn)，小孢子途徑得到的DH 株以后代不發(fā)生性狀分離為判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，所述NTH培養(yǎng)基的配方如下所示
權(quán)利要求
1.一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其特征在于，步驟如下(1)選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期至雙核早期的甜辣椒供體植株的花蕾，4°c低溫預(yù) 處理花蕾1-3天；(2)取花瓣不短于花萼的花蕾，剝?nèi)セㄝ嗪?，先?5%(ν/ν)的酒精浸泡30s，再用 8-10% (ν/ν)的次氯酸鈉振蕩消毒10-20min，然后用無(wú)菌水清洗3次，每次3-5min;(3)將花藥完整地剝離，以每60mm直徑培養(yǎng)皿接種12-18枚花藥的密度接種于N4-3固 液雙層培養(yǎng)基上，其中，所述N4-3固液雙層培養(yǎng)基的配方為固體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和瓊脂 粉的含量分別是它們相對(duì)于所述NTH培養(yǎng)基的重量百分比；液體層=NTH 培養(yǎng)基 +3-6 % 蔗糖 +IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+ 戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對(duì)于NTH培養(yǎng)基的重量百分比； 所述固體層經(jīng)121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌；(4)花藥先在條件下黑暗培養(yǎng)1-10天，再轉(zhuǎn)移到2548°C條件下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)；(5)培養(yǎng)4-7周時(shí)間，待胚狀體發(fā)生時(shí)，將子葉型胚狀體轉(zhuǎn)移到不加激素的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯苗。
2.如權(quán)利要求1所述的獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其特征在于，所述NTH培養(yǎng)基 的配方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/L，磷酸 二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水鉬酸鈉 0. 25mg/L，無(wú)水硫酸銅0. 025mg/L，六水氯化鈷0. 03mg/L，肌醇100mg/L，煙酸5mg/L，鹽 酸吡哆醇0. 5mg/L，鹽酸硫胺素0. 5mg/L，甘氨酸Jmg/L，葉酸5mg/L，生物素0. 5mg/L。
3.一種用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養(yǎng)基，其特征在于，為固液雙層培養(yǎng)基，其配 方為固體層NTH培養(yǎng)基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和瓊脂 粉的含量分別是它們相對(duì)于所述NTH培養(yǎng)基的重量百分比；液體層=NTH 培養(yǎng)基 +3-6 % 蔗糖 +IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+ 戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對(duì)于NTH培養(yǎng)基的重量百分比； 所述固體層經(jīng)121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌。
4.如權(quán)利要求3所述的用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養(yǎng)基，其特征在于，所述NTH 培養(yǎng)基的配方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/L，磷酸 二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水鉬酸鈉 0. 25mg/L，無(wú)水硫酸銅0. 025mg/L，六水氯化鈷0. 03mg/L，肌醇100mg/L，煙酸5mg/L，鹽 酸吡哆醇0. 5mg/L，鹽酸硫胺素0. 5mg/L，甘氨酸Jmg/L，葉酸5mg/L，生物素0. 5mg/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其步驟如下(1)選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期至雙核早期的供體植株的花蕾，4℃預(yù)處理1-3天；(2)剝?nèi)セㄝ嗪?，先用酒精浸泡，再用次氯酸鈉振蕩消毒，然后用無(wú)菌水清洗；(3)將花藥剝離，以每60mm直徑培養(yǎng)皿12-18枚花藥的密度接種于N4-3固液雙層培養(yǎng)基上；(4)花藥先在28-35℃條件下黑暗培養(yǎng)1-10天，再轉(zhuǎn)移到25-28℃條件下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)；(5)培養(yǎng)4-7周時(shí)間，待大量胚狀體發(fā)生時(shí)，將子葉型胚狀體轉(zhuǎn)移到不加激素的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯苗。經(jīng)過(guò)本發(fā)明培育方法，胚狀體發(fā)生率突破了基因型的限制，甜辣椒的培養(yǎng)效率得到了大幅度提高，同時(shí)DH株比率也得到了提高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102047843SQ201010508370
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者張宇, 張曉芬, 耿三省, 陳斌 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院