專利名稱：一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雷公藤胚狀體培養(yǎng)方法，特別是一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀 體的方法，該方法生產(chǎn)的雷公藤胚狀體中所含的雷公藤甲素和總生物堿與野生植株所含的 雷公藤甲素和總生物堿幾乎相同，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對(duì)環(huán)境無污染等特點(diǎn)，并且有 利于雷公藤自然資源的保護(hù)。
背景技術(shù)：
i^JkMiJripterygium wilfordii Hook. f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，在我國很早 以前就用于醫(yī)學(xué)和防治各種害蟲，為著名的殺蟲植物之一。民間多用于防治蔬菜害蟲，故有 “菜藥”之稱。其對(duì)多種害蟲有效。傳統(tǒng)中醫(yī)上可用于治療腫脹、水腫、黃白疽、痢疾等，具有 明顯的抗腫瘤、抗風(fēng)濕作用。雷公藤屬多年生木質(zhì)藤本、生長緩慢、處于野生狀態(tài)，因用根入 藥，大量應(yīng)用使資源遭到破壞。雷公藤根中的活性成分含量顯著高于其他部位，是主要藥用部位?，F(xiàn)已從中分離 出70多種化學(xué)成分，其中雷公藤甲素又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是中藥雷公藤的主要有效成分之 一，作為免疫抑制藥物，可應(yīng)用于許多自身免疫性疾病的治療，同時(shí)它又是一種毒性成分。 雷公藤生物堿具有明顯的體液和細(xì)胞免疫抑制作用，也是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效成 分。在農(nóng)業(yè)害蟲防治中，雷公藤甲素有較好的觸殺活性，雷公藤總生物堿有較好的胃毒毒殺 活性和拒食活性。這些有效成分均為次生代謝產(chǎn)物，在雷公藤植株內(nèi)含量很低，在其他植物 內(nèi)的含量更低，雖然可通過化學(xué)分離提取獲得產(chǎn)品，但受氣候、土壤、分布等因素及有效成 分含量、原料、季節(jié)等條件的限制，生產(chǎn)受到一定的限制，加上人類對(duì)自然的過度開發(fā)，資源 受到破壞，提取量很有限。雷公藤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分在國內(nèi)外已進(jìn)行了大量研究。在國內(nèi)，尹作鴻等人 從雷公藤的莖、葉誘導(dǎo)出愈傷組織，并進(jìn)行了組織培養(yǎng)，從中分離得到雷公藤甲素、雷公藤 乙素等二萜內(nèi)酯化合物。曹華興等(2002年)申請(qǐng)中國發(fā)明專利，提出采用懸浮法培養(yǎng)雷公 藤植物細(xì)胞而生產(chǎn)雷公藤總生物堿的方法，該方法得到的產(chǎn)物所含雷公藤總生物堿的含量 為植物體的2. 9倍。張興等(2008)公開的發(fā)明專利，建立了雷公藤的不定根培養(yǎng)體系，該方 法得到的不定根中雷公藤甲素和總生物堿的含量分別為根皮粉的13倍和1. 8倍，培養(yǎng)液中 雷公藤甲素產(chǎn)量占55 60%，總生物堿產(chǎn)量占60 65%。李琰等(2008)建立并篩選出了 適合通過二步細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)雷公藤甲素和生物堿的細(xì)胞懸浮體系及其相應(yīng)的生長培養(yǎng) 基和生產(chǎn)雷公藤甲素培養(yǎng)基以及雷公藤生物堿培養(yǎng)基配方并申請(qǐng)專利。在國外，日本Kyowa Hakko kogyo公司也為組織培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯二醇申請(qǐng)專利。這些對(duì)雷 公藤細(xì)胞培養(yǎng)的研究從不同方面進(jìn)行了有益的探索，但遠(yuǎn)未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。而關(guān) 于雷公藤胚狀體懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿的方法尚未見到報(bào)道。一般來說，植物的次生代謝產(chǎn)物在已經(jīng)分化的組織中含量較高，且器官培養(yǎng)相對(duì) 比較穩(wěn)定，因此采用胚狀體或根培養(yǎng)的方法是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的另一條途徑。胚狀體的 培養(yǎng)對(duì)植物有著特殊的意義，因?yàn)樵S多植物在器官分化之后次生代謝物會(huì)增加。但工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)胚狀體的實(shí)例并不多，多見于根的培養(yǎng)。韓國目前在高麗參根類培養(yǎng)方面已經(jīng)取 得了突破性進(jìn)展，采用了 5 10 t的反應(yīng)器，并以培養(yǎng)的根為原料開發(fā)了系列產(chǎn)品。用有一 定的器官分化的胚狀體作為懸浮培養(yǎng)的材料，生產(chǎn)其代謝產(chǎn)物，要比細(xì)胞培養(yǎng)有效成分要 高得多，但胚狀體的誘導(dǎo)需要克服更多技術(shù)上的困難，并非所有植物均可進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)。植物細(xì)胞全能性的設(shè)想于1902年提出，1948年得到了證實(shí)，這為進(jìn)行植物組織 培養(yǎng)工作奠定了理論基礎(chǔ)，自從1956年Routine和Nickel首次申請(qǐng)用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn) 有用次生代謝產(chǎn)物的專利以來，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用的次生物質(zhì)的研究取得了很大的進(jìn) 展。大量研究成果證明，通過植物細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生有用的次生代謝產(chǎn)物越來越顯示出巨 大的應(yīng)用潛力。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物不受地理、季節(jié)變換和各種環(huán)境因素 的影響；可節(jié)省土地，降低成本，縮短生產(chǎn)周期；可以提供一種標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)過程，該過程 可以連續(xù)生產(chǎn)，產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量穩(wěn)定，便于實(shí)行工業(yè)化生產(chǎn)，已是解決各種有效成分含量 低的植物資源利用的主要途徑。這是本申請(qǐng)的試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
為了保護(hù)雷公藤的自然資源，本發(fā)明的目的在于提供由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀 體的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體的方法，其特征在于，具體包括下列步驟 步驟一，以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體；用洗潔精洗滌并用自來水 反復(fù)清洗后，流水沖洗2小時(shí)，用含75%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒精消毒10s，然后以無菌水沖洗4次， 再用lg/L HgCl 2消毒4 min，無菌水沖洗4次；
步驟二，將不定根的幼根切成小段；接種在培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室進(jìn)行愈傷組織誘 導(dǎo)，培養(yǎng)基組成為MS+ (0.5 L0)mg/L 2，4_D+ (0. 1 0. 5) mg/L KT, pH 值為 5. 8，并 在培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度為25土 1°C，保持每天16小時(shí)的光照，光照強(qiáng)度為 1000 1500 Ix, 20 30天后形成愈傷組織；
步驟三，將形成的愈傷組織置入培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，40 45天繼代一次，連續(xù)繼代5 代，培養(yǎng)基組成為:6,7-V+1.0 mg/L 2,4-D+O. 5 mg/L KT ；
步驟四，挑選生長快、有光澤、質(zhì)地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5% 10% (w/v), 接種在培養(yǎng)基上建立雷公藤懸浮細(xì)胞系，培養(yǎng)基的組成為l/2MS+60ml/L椰汁，選擇250 mL 三角瓶，裝培養(yǎng)基120 mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25+l°C，自 然光照，搖床轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘，每25 30天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即獲 得雷公藤懸浮細(xì)胞系；
步驟五，用對(duì)數(shù)期生長的雷公藤懸浮細(xì)胞系，選取直徑在Imm以下、分散性好、顆粒狀 雷公藤懸浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)接在1/2MS+ (0.5 1.0)mg/LNAA培養(yǎng)基上進(jìn)行胚狀體的誘導(dǎo)，接種 量為鮮重5g/L 10g/L，培養(yǎng)30天可產(chǎn)生胚狀體，繼續(xù)培養(yǎng)至60天，有85%的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生 長度為0. 5cm 3cm的胚狀體；
步驟六，胚狀體的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時(shí)在超凈工作臺(tái)上，挑選步驟五誘導(dǎo)的胚狀體中， 長度為Icm 2cm、分散性好，顏色鮮亮、有明顯分化的胚狀體，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在步驟五相 同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的胚狀體培養(yǎng)體系；同時(shí)將篩選的生長旺盛、
4顏色鮮亮、分化明顯的胚狀體，繼代保存在1/2MS+ (0. 5 1. 0)mg/LNAA培養(yǎng)基中，30天繼 代一次，1/2MS培養(yǎng)基組成為NAA 0. 5 1. 0 mg/L，蔗糖30 40 g/L，pH值為5. 8 ；
步驟七，對(duì)胚狀體進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)，1/2MS培養(yǎng)基組成為NAA 0.5 1.0 mg/L，蔗糖 30 40 g/L，pH值為6. 1，培養(yǎng)至第40天收獲。本發(fā)明的方法得到的胚狀體，其中雷公藤甲素和總生物堿的含量與根皮粉含量接 近，利用該方法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對(duì)環(huán)境無污染等特 點(diǎn)，并且有利于雷公藤自然資源的保護(hù)。


圖1為本發(fā)明的雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體的技術(shù)流程圖； 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式參見圖1，依照本發(fā)明的技術(shù)方案，由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體的方法，具體包 括下列步驟
1.愈傷組織誘導(dǎo)以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體；用洗潔精洗滌并 用自來水反復(fù)清洗后，流水沖洗2小時(shí)，用含75%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒精消毒10s，無菌水沖洗4 次，再用lg/L HgCl2消毒4min,無菌水沖洗4次；
將不定根的幼根切成小段，接種在MS+0. 5 1. 0 mg/L 2,4-D+O. 1 0· 5 mg/L KT培 養(yǎng)基上，pH值為5. 8，蔗糖30 g/L，培養(yǎng)室溫度25 V 土 1°C，每天保持16小時(shí)光照，光照強(qiáng) 度為1000 1500 Ix, 20 30 d后形成愈傷組織。愈傷組織在6，7_V+0. 5 1. Omg/L 2， 4-D+0. 1 0. 5 mg/L KT培養(yǎng)基上，40d 45d繼代一次，連續(xù)繼代5代。2.懸浮系的建立挑選生長快、有光澤、質(zhì)地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為 5% 10% (w/v)，接種在l/2MS+60ml/L椰汁培養(yǎng)基上，250mL三角瓶，裝液體培養(yǎng)基120mL， 放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°c +rc,自然光照，搖床轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn) /分鐘，每25d 30d繼代一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，獲得雷公藤懸浮細(xì)胞系；
3.胚狀體的誘導(dǎo)用對(duì)數(shù)期生長的懸浮細(xì)胞，選取直徑在Imm以下、分散性好、顆粒狀 懸浮細(xì)胞系，轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的組成為1/2MS+ 0.5 1. Omg/L NAA，接種量為鮮 重(5 10) g/L，培養(yǎng)30d開始有胚狀體產(chǎn)生，繼續(xù)培養(yǎng)至60 d，85%的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生長度為 0. 5 3 cm的胚狀體。4.胚狀體的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時(shí)在超凈工作臺(tái)上，挑選上述誘導(dǎo)的胚狀體中長度 在Icm 2cm、直徑在2mm以下、生長旺盛、顏色鮮亮、分化明顯的胚狀體，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在 相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的胚狀體培養(yǎng)體系。5.胚狀體的液體繼代保存及生產(chǎn)將步驟4篩選的生長旺盛、顏色鮮亮、分化明顯 的胚狀體，繼代保存在附加NAA 0. 5 1 mg/L，蔗糖30 40 g/L，pH值為5. 8的1/2MS培 養(yǎng)基中，35 d繼代一次。生長至40d可對(duì)胚狀體進(jìn)行收獲。6.胚狀體中雷公藤甲素和總生物堿的提取將培養(yǎng)40d的胚狀體過濾，在60°C烘 干，按雷公藤甲素的提取方法，如《中草藥》，2005，36 (7)，1065-1068記載的方法提取雷公 藤甲素，按雷公藤總生物堿的提取方法，如《中國中藥雜志》1995，20 (3) 145-147記載的方法提取總生物堿。根據(jù)申請(qǐng)人的試驗(yàn)結(jié)果表明，按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的胚狀體中雷公藤甲素含量 為5. 64 μ g/g，雷公藤總生物堿為4. 31mg/g。雷公藤胚狀體與雷公藤根皮粉質(zhì)量比較培養(yǎng)Ig胚狀體得到的雷公藤甲素與總 生物堿和Ig根皮粉中的含量幾乎相同。對(duì)本發(fā)明所得胚狀體提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的 殺蟲活性測(cè)定表明，其致死中濃(LD5tl)與根皮粉幾乎相同。以下是申請(qǐng)人給出的相關(guān)試驗(yàn)
實(shí)施例1 胚狀體及培養(yǎng)液中雷公藤甲素、總生物堿含量的測(cè)定 精密稱取烘干后的雷公藤根皮粉、雷公藤胚狀體各l.ooog，置磨口三角瓶中，加入 乙酸乙酯20mL浸泡過夜，超聲提取40min，過中性氧化鋁柱(含3g中性氧化鋁，玻璃柱 d=l. 0cm)，然后用20mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，減壓回收乙酸乙酯至干，用45%甲 醇溶解并定容至5mL容量瓶中，待用。雷公藤甲素的含量測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜條件為色譜柱C18色譜柱 (4. 6mmX250mm,5ym)；流動(dòng)相甲醇水(45 55)；流速:lmL/min ；檢測(cè)波長218nm。雷公藤總生物堿含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，將提取液用45%甲醇稀釋 10^30倍，用分光光度計(jì)在268nm處測(cè)定吸光度值。檢測(cè)結(jié)果
(1)雷公藤根皮粉中雷公藤甲素含量為5.58μ g/g，總生物堿為4. 89 mg/g ；
(2)雷公藤胚狀體中雷公藤甲素含量為5.64μ g/g，總生物堿為4. 31mg/g。實(shí)施例2 雷公藤胚狀體中試生產(chǎn)
本實(shí)施例用5升的全自動(dòng)磁力攪拌植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器以雷公藤胚狀體為材料一步 法培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素和雷公藤生物堿。1.搖床上三角瓶細(xì)胞種子的準(zhǔn)備
(D1/2MS+ 0.5 1.0 mg/L NAA，pH值調(diào)至5. 8，分裝于500ml的三角瓶中，每瓶150ml。(2)以實(shí)施例1的步驟四獲得的雷公藤葉胚狀體為種源，接種于以上準(zhǔn)備好的液 體生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，接種密度約為10g/L。接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室中的搖 床上，培養(yǎng)條件為溫度25 士 1°C，自然光照，搖床轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)25天，即可用于5 升發(fā)酵罐的種子。2. 5升全自動(dòng)磁力攪拌植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器生產(chǎn)胚狀體
(1)滅菌反應(yīng)器內(nèi)裝入3L培養(yǎng)基，連接pH和DO電極，并設(shè)定相關(guān)參數(shù)。將反應(yīng)器置 于滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間和溫度為30分鐘，120°C .
(4)接種滅菌結(jié)束后，待培養(yǎng)基自然冷卻至室溫，在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種上一步生產(chǎn)的 種子。(5)生長培養(yǎng)及監(jiān)測(cè)按本發(fā)明的培養(yǎng)條件，溫度25士1°C，通氣量1.2 L HiirT1L-1 (vvm)，攪拌轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分鐘，自然光照，系統(tǒng)自動(dòng)控制進(jìn)行培養(yǎng)，生長培養(yǎng)40天， 達(dá)到生物量指數(shù)末期，即完成一步生長培養(yǎng)。收集胚狀體。實(shí)施例3 不同類型雷公藤提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的胃毒毒殺活性測(cè)定 將雷公藤根皮粉及雷公藤胚狀體培養(yǎng)物干燥粉碎后，精確稱取1. 000g，加入乙酸乙酯
20mL超聲提取40 min，過濾后，揮干乙酸乙酯，提取物用丙酮稀釋成1，5，10，25，50，100 mg/HiL的溶液，采用葉碟法測(cè)定其毒殺活性。采用DPS v7. 05程序求出毒殺曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明兩種提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲均具有明顯的毒殺作用(表1)，其中 雷公藤胚狀體提取物的對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的胃毒毒殺LD5tl (致死中濃)為43. 38 mg/mL，而 雷公藤根皮粉提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的胃毒毒殺LD5tl為44. 50 mg/mL，兩者相差不大。表1不同類型雷公藤樣品對(duì)小菜蛾幼蟲的毒殺作用(48 h)
權(quán)利要求
一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體的方法，其特征在于，具體包括下列步驟步驟一，以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體；用洗潔精洗滌并用自來水反復(fù)清洗后，流水沖洗2小時(shí)，用含75%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒精消毒10s，然后以無菌水沖洗4次，再用1g/L HgCl2消毒4min，無菌水沖洗4次；步驟二，將不定根的幼根切成小段；接種在培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)基組成為MS+(0.5～1.0)mg/L 2,4 D+(0.1～0.5)mg/L KT，pH值為5.8，并在培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度為25+1℃，保持每天16小時(shí)的光照，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，20～30天后形成愈傷組織；步驟三，將形成的愈傷組織置入培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，40～45天繼代一次，連續(xù)繼代5代，培養(yǎng)基組成為6,7 V+1.0 mg/L 2,4 D+0.5 mg/L KT；步驟四，挑選生長快、有光澤、質(zhì)地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5%～10%(w/v)，接種在培養(yǎng)基上建立雷公藤懸浮細(xì)胞系，培養(yǎng)基的組成為1/2MS+60ml/L椰汁，選擇250 mL三角瓶，裝培養(yǎng)基120 mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25+1℃，自然光照，搖床轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘，每25～30天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即獲得雷公藤懸浮細(xì)胞系；步驟五，用對(duì)數(shù)期生長的雷公藤懸浮細(xì)胞系，選取直徑在1mm以下、分散性好、顆粒狀雷公藤懸浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)接在1/2MS+(0.5～1.0)mg/LNAA培養(yǎng)基上進(jìn)行胚狀體的誘導(dǎo)，接種量為鮮重5g/L～10g/L，培養(yǎng)30天可產(chǎn)生胚狀體，繼續(xù)培養(yǎng)至60天，有85%的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生長度為0.5cm～3cm的胚狀體；步驟六，胚狀體的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時(shí)在超凈工作臺(tái)上，挑選步驟五誘導(dǎo)的胚狀體中，長度為1cm～2cm、分散性好，顏色鮮亮、有明顯分化的胚狀體，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在步驟五相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的胚狀體培養(yǎng)體系；同時(shí)將篩選的生長旺盛、顏色鮮亮、分化明顯的胚狀體，繼代保存在1/2MS+(0.5～1.0)mg/LNAA培養(yǎng)基中，30天繼代一次，1/2MS培養(yǎng)基組成為NAA 0.5～1.0 mg/L，蔗糖30～40 g/L，pH值為5.8；步驟七，對(duì)胚狀體進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)，1/2MS培養(yǎng)基組成為NAA 0.5～1.0 mg/L，蔗糖30～40 g/L，pH值為6.1，培養(yǎng)至第40天收獲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體的方法，該方法以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為原始材料，對(duì)外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)，建立懸浮細(xì)胞系，通過懸浮細(xì)胞系誘導(dǎo)胚狀體，通過胚狀體的穩(wěn)定性培養(yǎng)、繼代保存、培養(yǎng)條件優(yōu)化，即可用于擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素和生物堿。該方法得到的胚狀體中雷公藤甲素和總生物堿的含量與根皮粉含量相近。利用該方法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對(duì)環(huán)境無污染等特點(diǎn)，并且有利于雷公藤自然資源的保護(hù)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101960989SQ201010508469
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者何軍, 馮俊濤, 張興, 楊廣隸, 祝傳書, 馬志卿 申請(qǐng)人:楊凌農(nóng)科大無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心