專利名稱：一種利用rna干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物的培育技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用RNA干擾技術(shù)培育抗 粗縮病玉米的方法。
背景技術(shù)：
玉米粗縮病是由玉米粗縮病毒(MRDV)所引起的一種病毒病。國內(nèi)學(xué)者研究表明， 此病是由灰飛虱傳播的一種病毒性病害，其病原是一種具有雙層衣殼的雙鏈RNA球形病 毒，主要由灰飛虱傳播，只侵染單子葉植物。其寄主范圍較廣，有玉米、小麥、水稻、谷子和黑 麥等。另外，還有一年生禾本科雜草，如狗尾、馬塘、畫眉、蟋蟀和白茅草等。田間冬小麥“綠 矮型病株”及與叢矮病毒(WRSV)混生的矮縮病株，即是玉米粗縮病的初侵染源。研究資料 表明，在玉米上傳毒并造成危害的主要是灰飛虱第1代成蟲，而灰飛虱則又是玉米粗縮病 的主要傳毒介體。研究結(jié)果表明，麥套夏玉米一般3 5片葉即可感病，而且感病越早，發(fā) 病越重，經(jīng)濟產(chǎn)量損失也越大！近年來，山東、山西、河北、北京、天津、陜西、云南等地都有發(fā)病嚴重甚至絕產(chǎn)的報 道。玉米粗縮病已成為我國乃至世界玉米生產(chǎn)中的主要病害。發(fā)展到了不可忽視的地步。 針對玉米粗縮病的發(fā)生與環(huán)境條件、播種日期、品種抗病性等因素有關(guān)，目前也采取了調(diào)整 播期、加強田間管理、藥物防治等措施來控制其發(fā)生，但是由于病毒繁殖快，易于變異，用傳 統(tǒng)的防治方法不能從根本上解決這一問題。解決這一問題的有效策略是選育并推廣抗病毒玉米品種。近年來逐漸興起的RNA 干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)，為各種作物的抗病毒育種研究開辟了一條新的途徑。 利用基因工程的方法可以將病毒基因?qū)雰?yōu)良玉米品種，獲得對病毒的抗性。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。作為一種古老的生物體自我監(jiān)督機制，RNAi是植物抵御外來核酸入侵，保持自身 基因組結(jié)構(gòu)完整性的一種有效策略。由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的干擾現(xiàn)象作為細胞的一種 防御機制可針對性地降解細胞內(nèi)與之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，達到對病毒的 抵抗，同時還調(diào)節(jié)細胞內(nèi)編碼基因的表達，為利用RNA介導(dǎo)的病毒抗性進行抗病毒基因工 程的研究奠定了基礎(chǔ)。目前有分析玉米粗縮病基因序列以及尋找和篩選一些與玉米粗縮病抗性相關(guān)的 分子標記的報道。如Bai等分離鑒定了引起中國禾本科作物矮化癥狀的水稻黑條紋矮 化病毒(Identification of rice black streaked dwarf virus in different cereal crops withdwarfing symptoms in China. Acta Virol. 2001 ；45 (5-6) :335_9·)。Azuhata 等研究表明水稻黑條紋矮化病毒與玉米粗縮病病毒基因同源性很高(Close similarity betweengenome structures of rice black-streaked dwarf and maize rough dwarf viruses. JGen Virol. 1993,74(7) 1227-32.) 李常保等人利用RAPD標記方法尋找與玉 米粗縮病(MRDV)基因緊密連鎖的分子標記(李常保等，玉米抗粗縮病病毒(MRDV)基因的RAPD標記及其輔助選擇效果研究，作物學(xué)報，2002年7月，28 (4) 564 568)；何龍等人利 用SSR標記方法，尋找與玉米粗縮病抗性基因連鎖的SSR分子標記(何龍等，玉米粗縮病抗 性基因SSR標記初步研究，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008年，8 5 8)；陳艷萍等人利用SSR-BSA技 術(shù)篩選玉米粗縮病抗性基因分子標記(陳艷萍等，利用SSR-BSA技術(shù)篩選玉米粗縮病抗性 基因分子標記，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，24 (5) 590 594)。通過上述方法找到了一些可能與玉米粗縮病抗性有關(guān)的分子標記，張舉仁等也利 用分子標記進行了抗粗縮病玉米選育(利用分子標記選育抗粗縮病的玉米，發(fā)明專利公開 號CN 101138313A)。但目前還未見利用RNA干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米成功的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對上述抗粗縮病玉米的研究現(xiàn)狀，提供一種利用RNA干 擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種利用RNA干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法以SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列作為抗玉米粗縮病的目的基因序列，以SEQ ID 而.2所述的？0核苷酸序列作為初始模板，分別以下述四對引物打/1~^2/1~2、€3/1~3、€4/1~4 依次進行PCR擴增，下一對引物上下游的3’端分別與上一對引物上下游的5’端有部分堿基 重疊，第一對引物以FO為模板，以后每一對引物以上一對引物的產(chǎn)物為模板，這樣每次PCR 之后都在5’和3’端將目的序列延伸，最終擴增得到目的基因序列；四對引物分別如下f1 TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC,rl :GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG ；f2 TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC,r2 :AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG ；f3 GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT,r3 :TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA ；f4 CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，r4 :AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT ；將得到的目的基因序列經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶酶切形成粘性末端，再用與其相同 的限制性內(nèi)切酶酶切中間載體pSK-int，于0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收酶切的目 的條帶，連接克隆入pSK-int載體中，形成含正反向重復(fù)目的片段的中間載體，命名為 pSK-int-FR303 ；用不同的兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切中間載體pSK-int-FR303和植物表達載 體pJIM19(BARK)，將含正反向重復(fù)序列的目的片段連接到pJIM19(BARK)載體中，即為構(gòu) 建成功的植物表達載體；新構(gòu)建的載體能轉(zhuǎn)錄出發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(hairpin RNA)，命名為 PJIM19-MRDV303 ；將植物表達載體PJIM19-MRDV303利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米的胚性愈 傷組織，通過除草劑篩選、分化、生根壯苗，即獲得再生轉(zhuǎn)基因植株。上述利用RNA干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法，更具體的可包括下述主要步 驟
(1)、玉米粗縮病病毒的RNAi載體的構(gòu)建A.重疊PCR法擴增獲得如SEQ ID NO. 1所述的目的基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast序列比對，選擇MRDV的保守序列共303bp作為抗玉米 粗縮病的目的基因序列，在本發(fā)明中命名為MRDV-303，其核苷酸序列從左至右從5’端至3’ 端堿基組成如SEQ ID NO. 1所述。具體步驟如下1) PCR擴增獲得第一段序列首先合成目的基因片段的中間部分片段F0(123bp-179bp)，即具有如SEQ ID NO. 2 所述的核苷酸序列，再以FO為初始模板、以下述上游引物f 1和下游引物rl進行PCR擴增
Π TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC,rl :GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG ；擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板1 μ L，上游引物fl 0. 5μ L,下游引物rl0. 5uL,rTaq 酶0. 2 μ L,ddH2013. OyL;擴增程序為94°C，5min;94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s(30 個循環(huán))；72°C，5min ;10°C保溫；擴增得到第一段序列。2) PCR擴增獲得第二段序列以步驟1)的產(chǎn)物(第一段序列)為模板，以下述上游引物f2和下游引物r2進行 PCR擴增f2 TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC,r2 :AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG ；擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer2μ L,
dNTPs1. 6 μ L,
Mg2+1. 2μ L,
DNA模板1 μ L,
上游引物f20. 5μ L,
下游引物r20. 5μ L,
rTaq 酶0. 2μ L,
ddH2013. 0μ L
11
擴增程序為
94°C，5min ；
940C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s (30 個循環(huán))；
72°C，5min ； 10°C保溫；
擴增得到第二段序列。
3) PCR擴增獲得第_三段序列
以步驟2)的產(chǎn)物(第二段序列)為模板，以下述上游引物f3和下游引物r3進行PCR擴增
f3 GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
r3 :TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA ；
擴增體系為，每20μL中含有
10XPCR buffer2. 0μ L,
dNTPs1. 6 μ L,
Mg2+1. 2μ L,
DNA模板1 μ L,
上游引物f30. 5μ L,
下游引物r30. 5μ L,
rTaq 酶0. 2μ L,
ddH2013. 0μ Lo
擴增程序為
94°C，5min ；
940C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s (30 個循環(huán))；
72°C，5min ； 10°C保溫；
擴增得到第三段序列。
4) PCR擴增獲得目的基因序列
以步驟3)的產(chǎn)物(第三段序列)為模板，以下述上游引物f4和下游引物r4進行PCR擴增
f4CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
r4 :AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT ；
擴增體系為，每20μL中含有
10XPCR buffer2. 0μ L,
dNTPs1. 6 μ L,
Mg2+1. 2μ L,
DNA模板IyL,
上游引物f40. 5μ L,
下游引物r40. 5μ L,
rTaq 酶0. 2μ L,
ddH2013. 0 μ Lo
擴增程序為
12
94°C，5min;94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s(30 個循環(huán))；72°C，5min ;10°C 保溫。擴增得到目的基因序列。將擴增產(chǎn)物目的基因序列在瓊脂糖凝膠上分離、回收和純化，得到純化的回收產(chǎn)物。5)連接和轉(zhuǎn)化①回收產(chǎn)物連接到PMD-18T反應(yīng)體系如下pMD_18T載體1 μ L(約50ng)，IOX連接酶緩沖液1 μ L，T4DNA連 接酶350U，回收PCR產(chǎn)物加至終反應(yīng)體積10 μ L016°C連接12h，得到連接產(chǎn)物。②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備a.取在無抗生素平板上生長良好的單個DH5 α菌落，接種于ImL LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)(225r/min)過夜；b.取500 μ L活化過夜的菌液于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 4 ；c.將菌液倒入50mL離心管中，冰浴IOmin ；d.在預(yù)冷至4°C的離心機中，4000r/min離心IOmin后去掉上清液，收集菌體；e.加入20mL冰冷的0. lmol/L CaCl2于離心管中，均勻懸浮菌體后，冰浴中30min ；f. 4 0C下，4000r/min離心IOmin后去掉上清液，收集菌體，加入2mL冰冷的 0. ImoVLCaCl2溶液均勻懸浮菌體后，放入冰中待用。轉(zhuǎn)化步驟如下a.將連接產(chǎn)物加入200 μ L感受態(tài)細胞中，充分混勻置于冰上30min ；b. 42°C熱擊Imin 30s，冰浴2min后加入預(yù)熱至37°C的LB液體培養(yǎng)基600 μ L ；c. 37°C低速(100r/min)振蕩培養(yǎng) 50min ；d.在每個含有氨芐青霉素(50yg/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上加100 μ L菌液，均 勻涂于平板上；e. 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時。6)陽性克隆的篩選以前述步驟A4)的目的基因序列為模板，以下述引物f5和r5擴增全長目的基因 序列f5 :CCTGCTCAAATGGGAATAr5 :AACGAATGACGCTACTGC①挑取培養(yǎng)基平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(50μ g/mL)的LB液 體培養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12小時。②以菌液為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下擴增體系為，每20 μ L中含有IOXPCR buffer2. O μ L,
dNTPsMg2+DNA 模板上游引物f5下游引物r5rTaq 酶ddH20
1. 6 μ L, 1. 2μ L, 1 μ L,
0. 5μ L, 0. 5μ L, 0. 2μ L, 13. 0μ L ；③PCR反應(yīng)擴增程序為94°C，5min;94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s(30 個循環(huán))；72°C，5min ;10°C保溫；將得到的擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離。④測序通過測序確定擴增得到的序列與目的基因序列是否一致。B.構(gòu)建含正向序列的中間載體pSK-int_F3031)PCR擴增獲得正向片段以上述步驟A6)得到的目的基因序列為模板，設(shè)計上下游引物F1和R1，其5’端分 別引入限制性內(nèi)切酶位點XhoI和Hindlll，酶切位點外側(cè)添加三個保護堿基以保證酶切完 全。引物序列如下F1 5' ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3，(Xho I)，R1 :5，CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3，(HindIII)；PCR 擴增體系為，每 20μ L 中含有10XPCR 緩沖液 2. 0 μ L, DNAl-lOng，dNTPs ^(^!!!(^/!，上游引物？: 5pmol，下游引物 Rl 5pmol, Taq DNA 聚合酶 1U，Mg2+L 5mmol/L， ddH20加至終體積20 μ L ；PCR 反應(yīng)程序為先 94 °C 4min;再 94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，循環(huán) 30 次；最 后72°C延伸5min ；將擴增得到的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離，得到正向片段PCR產(chǎn)物。2) PCR產(chǎn)物與中間載體的酶切、回收和純化①PCR產(chǎn)物30 μ L酶切體系為10XH緩沖液3. 0 μ L，正向片段PCR產(chǎn)物 10. 0 μ L(約 2 μ g)，XhoI 5U, HindIII 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L②中間載體20 μ L酶切體系為10ΧΗ緩沖液2. 0 μ L，pSK-int中間載體 5. 0 μ L(約 1 μ g)，XhoI 5U, HindIII 5U, ddH20 加至終體積 20 μ L。37°C溫育4小時，將得到的酶切產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上分離，再回收和純化， 得到純化的回收產(chǎn)物。3)正向片段連入中間載體①回收產(chǎn)物連接到中間載體pSK-int10 μ L反應(yīng)體系為pSK-int中間載體2 μ L (約300ng)，10XT4DNA連接酶緩沖液 1 μ L，T4DNA連接酶350U，回收正向片段酶切產(chǎn)物5 μ L (約800ng)，ddH20加至終反應(yīng)體積 10μ L ；16°C連接 10 小時；
②連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，方法同上述步驟A5)；4)正向片段陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(50yg/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12小時。②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下10XPCR緩沖液 2. 0μ L，DNA1. 0μ L 菌液，dNTPslOO μ mol/L，引物 F1 5pmol，引物 R15pmol，Taq DNA 聚合酶 IU，Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L。PCR擴增程序同上述步驟Bi)。③對PCR呈陽性的克隆，取500 μ L菌液進行測序，完全正確的樣品用于下一步載 體構(gòu)建，命名為pSK-int-F303。C.構(gòu)建含反向重復(fù)序列的中間載體pSK-int_FR3031)PCR擴增獲得反向片段以上述步驟A6)得到的目的基因序列為模板，設(shè)計引物上下游引物F2和R2，其5’ 端分別引入限制性內(nèi)切酶位點SpeI和PstI，酶切位點外側(cè)添加三個保護堿基以保證酶切完全。引物序列如下F2 5' AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3，(SpeI)R2 5' AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3，(PstI)PCR 擴增體系為，每 20μ L 中含有10XPCR 緩沖液 2. 0 μ L，DNAl-lOng， dNTPslOO μ mol/L，引物 F2 5pmol，引物 R2 5pmol，Taq DNA 聚合 1U，Mg2+L 5mmol/L，ddH20 力口 至終體積20 μ L。PCR擴增程序同上述步驟Bi)；2)反向片段PCR產(chǎn)物與載體pSK-int-F303的酶切①PCR產(chǎn)物30 μ L酶切體系=IOXH緩沖液3. 0 μ L,反向片段PCR產(chǎn)物10. 0 μ L(約 2 μ g)，SpeI 5U, PstI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。②中間載體20 μ L酶切體系10 X H緩沖液2. 0 μ L，pSK-int_F303中間載體 5. 0 μ L (約 1 μ g)，SpeI 5U, PstI 5U, ddH20 加至終體積 20 μ L。37°C溫育2小時。③酶切產(chǎn)物的回收、純化、連接和轉(zhuǎn)化等操作與正向片段的相同。10 μ 1連接體系為pSK-int-F303中間載體2 μ L (約300ng)，10 X T4DNA連接酶緩 沖液1 μ L，T4DNA連接酶350U，回收反向片段酶切產(chǎn)物5 μ L (約800ng)，ddH20加至終反應(yīng) 體積10 μ L016°C連接 12 小時。3)反向片段陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(50μ g/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h。②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，20 μ L反應(yīng)體系如下10XPCR緩沖液2. 0 μ L， DNA1. 0 μ L 菌液，dNTPslOO μ mol/L,引物 F2 5pmol,引物 R2 5pmol, Taq DNA 聚合 IU， Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L。
15
PCR擴增程序同上述步驟Bi)；③對PCR呈陽性的克隆，取500 μ L菌液進行測序，完全正確的即為含反向重復(fù)目 的片段的中間載體，命名為pSK-int-FR303。D.構(gòu)建含反向重復(fù)序列的表達載體PJIM19-MRDV303DXhoI和SpeI雙酶切含反向重復(fù)目的片段的中間載體pSK-int-FR30330yL酶切體系為10XK緩沖液1.5 μ L(終濃度0. 5Κ)， pSK-int-FR30315. 0 μ L (約 3 μ g)，XhoI 5U, SpeI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。37 °C溫育 30 分鐘。2) XhoI和SpeI雙酶切植物表達載體pJIM1930μ L 酶切體系如下10XK 緩沖液 3. Ομ L，pJIM19 10. O μ L (約 2 μ g)，XhoI 5U， SpeI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。37°C溫育2小時。3)酶切產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后分別回收反向重復(fù)序列和植物表達載體 的大片段，所有操作按說明書進行。T4DNA連接酶連接。IOyL連接體系為10XT4DNA連接酶緩沖液lyL，正反向重復(fù)序列5μ L(約 1 μ g)，植物表達載體的大片段2 μ L (約200ng)，T4DNA連接酶350U，ddH20加至終反應(yīng)體積 10 μ L0 16°C連接10小時。4)陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有卡那霉素(50μ g/mL)的LB液體培 養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12小時。②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，20 μ L反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液2. O μ L， DNA1. OyL 菌液，dNTPslOO μ mol/L,引物 F2 5pmol,引物 R25pmol，Taq DNA 聚合酶 1U， Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L。PCR反應(yīng)體系及擴增程序同上述步驟Bi)。③PCR呈陽性的克隆在20mL含有卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中擴大 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；XhoI和SpeI雙酶切鑒定，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測含有目的片段大小的 條帶，即為構(gòu)建好的植物表達載體，在本發(fā)明中命名為PJIM19-MRDV303。(2).農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米的胚性愈傷組織及植株的再生A.植物表達載體pJIM19-MRDV303轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌①農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備取-70°C保存的EHA105于含有50 μ g/mL利福霉素平板劃線，28°C培養(yǎng)2天。挑取 單菌落接種于5mL YEP液體培養(yǎng)基中，225r/min，28°C振蕩培養(yǎng)12小時左右。將5mL菌液 轉(zhuǎn)接于IOOmL YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，225r/min，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5 ；轉(zhuǎn)入無菌50mL 的離心管，5000g離心5min,去上清液。加入ImL預(yù)冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮 細胞，冰上放置20min，4°C下，5000g離心5min，去上清。加入200L預(yù)冷的含15%甘油的 0. lmol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮?；靹蚝罅⒓磧龃嬗赺70°C，備用。 ②表達載體pJIM19-MRDV303轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 取0. 5g左右的pJIM19-MRDV303質(zhì)粒DNA加入到2001 EHA105感受態(tài)細胞中，混 勻后，冰浴30min ；液氮中速凍Imin ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入800L YEP液體
16培養(yǎng)基，28°C，150r/min振蕩培養(yǎng)4h ；然后取200L涂布在含50 μ g/mL卡那霉素和50 μ g/ mL利福霉素的YEP平板上，28 °C培養(yǎng)到形成單菌落。③陽性克隆的鑒定挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50g/mL卡那霉素和50 μ g/mL利福霉素的YEP 液體培養(yǎng)基中，28°C，225r/min振蕩培養(yǎng)12h，直接用菌液做PCR。PCR反應(yīng)體系及擴增程序 同上述步驟(1)D4)。B.農(nóng)桿菌浸染將含有目標載體PJIM19-MRDV303的農(nóng)桿菌接種到含50mg/L利福霉素和50mg/L 卡那霉素的YEP培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)2天；挑取單個菌落于含相應(yīng)抗生素的ImL YEP培養(yǎng) 基中，28°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h，再將其加入含相應(yīng)抗生素的50mL培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至 0D600 = 0. 5 ；4°C、4000r/min離心5min收集菌體，用等體積的液體浸染培養(yǎng)基懸浮。將待 轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系的愈傷組織分別浸入含AS的浸染培養(yǎng)基，浸染5-lOmin。C.共培養(yǎng)浸染了農(nóng)桿菌的愈傷組織置于滅菌紙上，吸干多余水分后接種到共培養(yǎng)基。用保 鮮膜封好平板，22°C暗培養(yǎng)3d。D.清洗及恢復(fù)培養(yǎng)共培養(yǎng)3天后的愈傷組織用5mL含250mg/L噻孢霉素鈉的滅菌蒸餾水清洗3次，置 于滅菌濾紙上吸干多余水分后，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上。用保鮮膜封好平板，25°C暗培養(yǎng)5d。Ε.篩選轉(zhuǎn)化子恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含1. 5mg/L除草劑草丁膦的選擇培養(yǎng)基上。每兩 周后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的選擇培養(yǎng)基上；連續(xù)篩選3代，草丁膦濃度按1. 5mg/L、 3. 0mg/L、5. Omg/L遞增；每次轉(zhuǎn)接都淘汰褐色的愈傷組織。F.轉(zhuǎn)基因植株的再生選取抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(N6鹽和維生素+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+ 水解酪蛋白100mg/L+KT lmg/L, pH 5. 8)上，25°C光照培養(yǎng)16小時/d ；2-3周后，將分化出 的幼苗轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基(MS鹽和維生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0. 25g/L+蔗糖 30g/L+瓊脂6g/L，pH 5.8)上，25°C光照培養(yǎng)16小時/d，即得到TO轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過自交 繁育、分子檢測、接毒鑒定等，表明該株系是一種對玉米粗縮病具有較好抗病性的轉(zhuǎn)基因作 物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明方法利用RNA干擾技術(shù)，可培育出具有優(yōu)良抗粗縮病的玉米轉(zhuǎn)基因植株， 從根本上解決玉米粗縮病問題，顯著提高玉米產(chǎn)量，提高其經(jīng)濟價值。


圖1為中間載體pBluescript SK+，構(gòu)建正反向重復(fù)序列的中載體pSK_int在 pBluescript SK+的MCS區(qū)插入了一段內(nèi)含子；圖2為植物表達載體PJIM19 (BARk)。MCS為多克隆位點區(qū)，酶切位點依次為Xbal， XhoI, Stul, Spel, Sacl ；圖3為重疊PCR擴增目的基因電泳檢測結(jié)果17
圖4為含正向序列中間載體pSK-int-F303用Xhol/Hindlll雙酶切鑒定電泳檢測 結(jié)果圖；圖5為含反向重復(fù)序列中間載體pSK-int-FR303用Xhol/Spel雙酶切鑒定電泳檢 測結(jié)果圖；圖6為轉(zhuǎn)基因18-599白再生植株；圖7為再生植株目的基因PCR檢測電泳結(jié)果圖；圖8為田間接種病毒15天后的18-599紅植株；圖9為實施例2中，部分轉(zhuǎn)化植株Bar基因檢測結(jié)果1 陽性對照；2 陰性對照； 3-15 轉(zhuǎn)化植株；圖10為實施例2中，部分轉(zhuǎn)化植株目的基因片段檢測結(jié)果5，8，15為轉(zhuǎn)化植株；圖11為實施例2中，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖12為實施例2中，部分轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交檢測電泳圖，Tff2, TW6和TW4 為不同的轉(zhuǎn)基因株系；圖13、圖14分別為實施例4中，MRDV目的基因標準曲線圖及熔解曲線分析圖；圖15、圖16分別為實施例4中，18S內(nèi)參基因標準曲線及熔解曲線分析圖；圖17為實施例4中，qRT-PCR檢測接毒鑒定的轉(zhuǎn)基因植株及對照中MRDV基因表達量。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳細描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上 述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1本實施例利用RNA干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法，包括下述主要步驟(1)、玉米粗縮病病毒的RNAi載體的構(gòu)建A.重疊PCR法擴增獲得如SEQ ID NO. 1所述的目的基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast序列比對，選擇MRDV的保守序列共303bp作為抗玉米 粗縮病的目的基因序列，在本發(fā)明中命名為MRDV-303，其核苷酸序列從左至右從5’端至3’ 端堿基組成如SEQ ID NO. 1所述。具體步驟如下1) PCR擴增獲得第一段序列首先合成目的基因片段的中間部分片段F0(123bp-179bp)，即具有如SEQ ID N0. 2 所述的核苷酸序列，再以FO為初始模板、以下述上游引物f 1和下游引物rl進行PCR擴增f1 TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，rl :GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG ；擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+
DNA模板 上游引物Π 下游引物rl rTaq 酶 ddH20
1. 2μ L, 1 μ L, 0. 5μ L, 0. 5μ L,
0.2μ L, 13. 0μ L ；
擴增程序為 94°C，5min ；
94°C，30s, 59°C，30s, 72°C，30s (30 個循環(huán))； 72°C，5min ； 10°C保溫； 擴增得到第一段序列。
2)PCR擴增獲得第二段序列
以步驟1)的產(chǎn)物(第一段序列)為模板，設(shè)計上游引物f2和下游引物r2，分別與 1)產(chǎn)物的5’和3’端部分堿基重疊，進行PCR擴增
f2 TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC， r2 :AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG ； 擴增體系為，每20 μ L中含有 10XPCR buffer 2. 0 μ L,
1.6 μ L, 1. 2μ L,
1 μ L, 0. 5μ L, 0. 5μ L, 0. 2μ L, 13. 0μ L ；
擴增程序為 94°C，5min ；
94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s (30 個循環(huán))； 72°C，5min ； 10°C保溫； 擴增得到第二段序列。
3)PCR擴增獲得第三段序列
以步驟2)的產(chǎn)物(第二段序列)為模板，設(shè)計上游引物f3和下游引物r 3，分別 f 2)產(chǎn)物的5’和3’端部分堿基重疊，進行PCR擴增
f3 GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT， r3 :TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA ； 擴增體系為，每20 μ L中含有 10XPCR buffer 2. 0 μ L, dNTPs1. 6μ L,
dNTPs Mg2+
DNA模板 上游引物f2 下游引物r2 rTaq 酶 ddH20
Mg2
1. 2μ L,
DNA 模板l.OyL，上游引物f30. 5μ L,下游引物r30. 5 μ L，rTaq _0. 2 μ L,ddH2013. 0 μ L0擴增程序為94°C,5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s(30 個循環(huán))；72°C，5min ;10°C保溫；擴增得到第三段序列。4) PCR擴增獲得目的序列以步驟3)的產(chǎn)物(第三段序列)為模板，設(shè)計上游引物f4和下游引物r4，分別與 步驟3)產(chǎn)物的5’和3’端部分堿基重疊，進行PCR擴增f4 CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT,r4 :AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT ；擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f40. 5μ L,下游引物r40. 5μ L,rTaq _0. 2 μ L,ddH2013. 0 μ L0擴增程序為94°C，5min;94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s(30 個循環(huán))；72°C，5min ;10°C 保溫。PCR反應(yīng)在PTC-220型PCR儀(MJ Research,U. S. Α.)中進行，擴增產(chǎn)物即為目的
基因序列。將擴增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上分離，80V恒定電壓電泳45min。在步驟4)引物擴增電泳分離后，使用TIANGEN公司瓊脂糖凝膠回收和純化試劑 盒，所有操作均按說明書進行，得到純化的回收產(chǎn)物。5)連接和轉(zhuǎn)化①回收產(chǎn)物連接到pMD-18T反應(yīng)體系如下pMD-18T載體1 μ L(約50ng)，IOX連接酶緩沖液1 μ L，T4DNA連 接酶350U，回收PCR產(chǎn)物加至終反應(yīng)體積10 μ L016°C 連接 12h。②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a
20
感受態(tài)細胞的制備a.取在無抗生素平板上生長良好的單個DH5 α菌落，接種于ImL LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)(225r/min)過夜；b.取500 μ L活化過夜的菌液于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 4 ；c.將菌液倒入50mL離心管中，冰浴IOmin ；d.在預(yù)冷至4°C的離心機中，4000r/min離心IOmin后去掉上清液，收集菌體；e.加入20mL冰冷的0. lmol/L CaCl2于離心管中，均勻懸浮菌體后，冰浴中30min ；f. 4 0C下，4000r/min離心IOmin后去掉上清液，收集菌體，加入2mL冰冷的 0. ImoVLCaCl2溶液均勻懸浮菌體后，放入冰中待用。轉(zhuǎn)化步驟如下a.將連接產(chǎn)物加入200 μ L感受態(tài)細胞中，充分混勻置于冰上30min ；b. 42°C熱擊Imin 30s，冰浴2min后加入預(yù)熱至37°C的LB液體培養(yǎng)基600 μ L ；c. 37°C低速(100r/min)振蕩培養(yǎng) 50min ；d.在每個含有氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上加100 μ L菌液，均 勻涂于平板上；e. 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。6)陽性克隆的篩選以前述步驟A4)的目的基因序列為模板，以下述引物f5和r5擴增全長目的基因 序列f5 :CCTGCTCAAATGGGAATAr5 :AACGAATGACGCTACTGC①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h。②以菌液為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下=DNAlyL菌液，dNTPs IOOymol/ L，引物 f45pmol，引物 r45pmol,Taq DNA 聚合酶 IU，IOXPCR 緩沖液 2. O μ L，Mg2+L 5mmol/L, ddH20加至終體積20 μ L。擴增體系為，每20μ L中含有
IOXPCR buffer2. Ομ L,
dNTPs1. 6 μ L,
Mg2+1. 2μ L,
DNA模板1. Ομ L,
上游引物f50. 5μ L,
下游引物r50. 5μ L,
rTaq 酶0. 2μ L,
ddH2013. 0μ L ；③PCR反應(yīng)擴增程序為94°C，5min;94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s(30 個循環(huán))；
72°C，5min ;10°C保溫；將得到的擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離，80V恒定電壓電泳45min，檢測有無 目的片段。④測序?qū)⒛康钠嗡虸nvitrogen公司測序，測序結(jié)果表明擴增序列與設(shè)計的目 的片段完全一致。B.構(gòu)建含正向序列的中間載體pSK-int_F3031)PCR擴增獲得正向片段以上述步驟A 6)得到的目的基因序列為模板，設(shè)計上下游引物F1和R1，其5’端 分別引入限制性內(nèi)切酶位點XhoI和Hindlll，酶切位點外側(cè)添加三個保護堿基以保證酶切 完全。引物序列如下F1 5' ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3，(Xho I)，R1 :5，CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3，(HindIII)；PCR 擴增體系為，每 20 μ L 中含有10XPCR 緩沖液 2. O μ L，DNA 1-lOng，dNTPs ΙΟΟμπιοΙ/L，上游引物 Fl 5pmol，下游引物 Rl 5pmol, Taq DNA 聚合酶 1U，Mg2+L 5mmol/L， ddH20加至終體積20 μ L ；PCR 反應(yīng)程序為先 94°C 4min ；再 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s,循環(huán) 30 次；最后 72°C 延伸 5min ；PCR反應(yīng)在PTC-220型PCR儀(MJ Research, U. S. Α.)中進行。擴增產(chǎn)物在瓊 脂糖凝膠上分離，80V恒定電壓電泳45min，得到正向片段PCR產(chǎn)物。2)PCR產(chǎn)物與中間載體的酶切、回收和純化①PCR產(chǎn)物30 μ L酶切體系為10XH緩沖液3. 0 μ L，正向片段PCR產(chǎn)物 10. 0 μ L(約 2 μ g)，XhoI 5U, HindIII 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。②中間載體20 μ L酶切體系為10ΧΗ緩沖液2. 0 μ L，pSK-int中間載體 5. 0 μ L(約 1 μ g)，XhoI 5U, HindIII 5U, ddH20 加至終體積 20 μ L。37°C溫育2小時，酶切產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上分離，80V恒定電壓電泳50分 鐘。③使用TIANGEN公司瓊脂糖凝膠回收和純化試劑盒，所有操作均按說明書進行， 得到純化的回收產(chǎn)物。3)正向片段連入中間載體①回收產(chǎn)物連接到中間載體pSK-int的10 μ L反應(yīng)體系為酶切的pSK-int中間 載體2 μ L (約300ng)，10XT4DNA連接酶緩沖液1 μ L，T4DNA連接酶350U，回收正向片段酶 切產(chǎn)物5 μ L (約800ng)，ddH20加至終反應(yīng)體積10 μ L。16°C連接 10 小時。②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，方法同上述步驟A 5)。4)正向片段陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(50yg/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h。②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下10XPCR緩沖液 2. 0 μ L， DNA1. 0μ L 菌液，dNTPs 100 μ mol/L，引物 F1 5pmol，引物 R1 5pmol，TaqDNA 聚合酶 1U，
22Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L。PCR擴增程序同上述步驟Bi)；③PCR呈陽性的克隆取500 μ L菌液送Invitrogen公司測序，完全正確的樣品用 于下一步載體構(gòu)建，命名為pSK-int-F303。C.構(gòu)建含反向重復(fù)序列的中間載體pSK-int_FR3031)PCR擴增獲得反向片段以上述步驟A 6)得到的目的基因序列為模板，上下游引物F2和R2，其5’端分別 引入限制性內(nèi)切酶位點SpeI和PstI (下劃線)，酶切位點外側(cè)添加三個保護堿基以保證酶 切完全。引物序列如下F2. 5' AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3，(SpeI)R2 :5，AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3，(PstI)PCR 擴增體系為，每 20 μ L 中含有10 X PCR 緩沖液 2. 0 μ L, DNAl-lOng，dNTPs 100ymol/U|*F25pmoU|*R2 5pmol，Taq DNA 聚合 1U，Mg2+L 5mmol/L，ddH20 加至終體 積 20 μ L0PCR擴增程序同上述步驟Bi)；2)反向片段PCR產(chǎn)物與載體pSK-int-F303的酶切①PCR產(chǎn)物30 μ L酶切體系=IOXH緩沖液3. 0 μ L,反向片段PCR產(chǎn)物10. 0 μ L(約 2 μ g)，SpeI 5U, PstI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。②中間載體20 μ L酶切體系10 X H緩沖液2. 0 μ L，pSK-int_F303中間載體 5. 0 μ L (約 1 μ g)，SpeI 5U, PstI 5U, ddH20 加至終體積 20 μ L。37°C溫育 2h。③酶切產(chǎn)物的回收、純化、連接和轉(zhuǎn)化等操作與正向片段的相同。10 μ L連接體系為pSK-int-F303中間載體2 μ L (約300ng)，10 X T4DNA連接酶緩 沖液1 μ L，T4DNA連接酶350U，回收反向片段酶切產(chǎn)物5 μ L (約800ng)，ddH20加至終反應(yīng) 體積10 μ L016°C 連接 12h。3)反向片段陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(50yg/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h。②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，20 μ L反應(yīng)體系如下10XPCR緩沖液2. 0 μ L， DNA1. 0μ L 菌液，dNTPs 100 μ mol/L，引物 F2 5pmol，引物 R2 5pmol, Taq DNA 聚合酶 1U， Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L。PCR擴增程序同上述步驟Bi)；③PCR呈陽性的克隆取500 μ L菌液送Invitrogen公司測序，完全正確的即為含 反向重復(fù)目的片段的中間載體，命名為pSK-int-FR303。D.構(gòu)建含反向重復(fù)序列的表達載體PJIM19-MRDV303DXhoI和SpeI雙酶切含反向重復(fù)目的片段的中間載體pSK-int-FR30330 μ L 酶切體系為10XK 緩沖液 1. 5 μ L(終濃度 0. 5K)，pSK-int_FR303 15. 0 μ L (約 3 μ g)，XhoI 5U, SpeI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。
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37°C溫育 30min。2) XhoI和SpeI雙酶切植物表達載體pJIM1930μ L 酶切體系如下10XK 緩沖液 3. Ομ L，pJIM19 10. O μ L (約 2 μ g)，XhoI 5U， SpeI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L。37°C溫育 2h。3)酶切產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后分別回收反向重復(fù)序列和植物表達載體 的大片段，所有操作按說明書進行。T4DNA連接酶連接。IOyL連接體系為10XT4DNA連接酶緩沖液lyL，正反向重復(fù)序列5μ L(約 1 μ g)，植物表達載體的大片段2 μ L (約200ng)，T4DNA連接酶350U，ddH20加至終反應(yīng)體積 10 μ L0 16°C連接 10h。4)陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液體培 養(yǎng)基中37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h。②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，20 μ L反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液2. O μ L， DNA1. Ομ L 菌液，dNTPs 100 μ mol/L，引物 F2 5pmol，引物 R2 5pmol, Taq DNA 聚合 1U， Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L。PCR擴增程序同上述步驟Bi)；③PCR呈陽性的克隆在20ml含有卡那霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中擴大培 養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用TIANGEN公司的質(zhì)粒小提試劑盒，所有操作按說明書進行。XhoI和SpeI 雙酶切鑒定，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測含有目的片段大小的條帶，即為構(gòu)建好的植物表達 載體,命名為 PJIM19-MRDV303。(2).農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米自交系的胚性愈傷組織及植株的再生1)植物表達載體pJIM19-MRDV303轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌①農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備取-70°C保存的EHA105于含有5(^8/11^利福霉素平板劃線，281培養(yǎng)2天。挑取 單菌落接種于5mL YEP液體培養(yǎng)基中，225r/min，28°C振蕩培養(yǎng)12小時左右。將5mL菌液 轉(zhuǎn)接于IOOmL YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，225r/min，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5 ；轉(zhuǎn)入無菌50mL 的離心管，5000g離心5min,去上清液。加入ImL預(yù)冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮 細胞，冰上放置20min，4°C下，5000g離心5min，去上清。加入200L預(yù)冷的含15%甘油的 0. lmol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮?；靹蚝罅⒓磧龃嬗赺70°C。②表達載體ρ JIM19-MRDV303轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取0. 5g左右的pJIM19-MRDV303質(zhì)粒DNA加入到200L EHA105感受態(tài)細胞中，混 勻后，冰浴30min ；液氮中速凍Imin ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入800LYEP液體 培養(yǎng)基，28°C，150r/min振蕩培養(yǎng)4h ；取200L菌液涂布在含50 μ g/mL卡那霉素和50 μ g/ mL利福霉素的YEP平板上，28 °C培養(yǎng)形成單菌落。③陽性克隆的鑒定挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50g/mL卡那霉素和100 μ g/mL利福霉素的YEP 液體培養(yǎng)基中，280C，225r/min振蕩培養(yǎng)12h，直接用菌液做PCR。PCR反應(yīng)體系及擴增程序同上述步驟(1)D4)。
2)農(nóng)桿菌浸染將含有目標載體pJIM19-MRDV303的農(nóng)桿菌接種到含50mg/L利福霉素和50mg/ L卡那霉素的YEP培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)2天。挑取單個菌落于含相應(yīng)抗生素的ImL YEP 培養(yǎng)基中，28°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h，再將其加入含相應(yīng)抗生素的50mL培養(yǎng)基擴大培 養(yǎng)至0D600 = 0. 5 ；4°C、4000r/min離心5min收集菌體，用等體積的液體浸染培養(yǎng)基(含 100 μ mol/L乙酰丁香酮即AS)懸浮。將18-599紅、18-599白的愈傷組織分別浸入含AS的 浸染培養(yǎng)基，浸侵染5-lOmin。3)共培養(yǎng)浸染了農(nóng)桿菌的愈傷組織置于滅菌紙上，吸干多余水分后接種到共培養(yǎng)基。用保 鮮膜封好平板，22°C暗培養(yǎng)3d。4)清洗及恢復(fù)培養(yǎng)共培養(yǎng)3天后的愈傷組織用5mL含250mg/L噻孢霉素鈉的滅菌蒸餾水清洗3次，置 于滅菌濾紙上吸干多余水分后，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上。用保鮮膜封好平板，25°C暗培養(yǎng)5d。5)篩選轉(zhuǎn)化子恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含1. 5mg/L除草劑草丁膦的選擇培養(yǎng)基上。每兩周 后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的選擇培養(yǎng)基上；連續(xù)篩選3代，草丁膦濃度按1. 5mg/L、3mg/L、 5mg/L遞增；每次轉(zhuǎn)接都淘汰褐色的愈傷組織。6)轉(zhuǎn)基因植株的再生選取抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(N6鹽和維生素+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+ 水解酪蛋白100mg/L+KT lmg/L, pH 5. 8)上，25°C光照培養(yǎng)16小時/d ；2-3周后，將分化出 的幼苗轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基(MS鹽和維生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0. 25g/L+蔗糖 30g/L+瓊脂6g/L，pH 5. 8)上，25°C光照培養(yǎng)16小時/d,即得到TO轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分子檢測和田間接種鑒定，確定將MRDV基因轉(zhuǎn)入到玉米自交系18-599紅、 18-599 白中。
實施例2本實施例為轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測 A.玉米基因組DNA提取
取Ttl代轉(zhuǎn)化植株幼嫩葉片，用CTAB法提取總DNA，試劑及配方見表L 表ICTAB提取液的配置(500mL)
試劑劑量終濃度CTAB10 g2%IMTris-HCl (ρΗ8· 0)50 mL100 mmol/LNaCl41 g1. 4 mol/L0. 5Μ EDTA (ρΗ8· 0)20 mL10 mmol/Lβ-巰基乙醇(用時現(xiàn)加)1 mL0. 2% 將5g左右新鮮葉片放入研缽中，加入液氮快速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入5mL離心管，加
入2mL 65°C預(yù)熱的CTAB提取液充分混勻，65°C保溫45 60min，在此期間輕輕顛倒離心管
幾次，使植株組織與CTAB充分接觸。加入等體積的氯仿/異戊醇(24/1)混合液輕輕搖動
2515min。10，000r/min 離心 lOmin。取上清液，再用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次，10，000r/min離心lOmin。小心吸出上清液于另一支5mL離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，置 于_20°C冰箱中沉淀DNA。挑出成團的DNA，用70%乙醇洗2-3次，無水乙醇洗1-2次，烘干，加200L TE溶解， 再加入RNase于37°C保溫30min。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA合格后，保存于-20°C備用。B.選擇標記基因Bar和目的基因片段的PCR檢測利用primer premier5. 0軟件設(shè)計一對篩選標記Bar基因和目的基因片段的特異 引物，對TO代植株DNA進行PCR擴增。引物序列分別如下Bar-s :ATGAGCCCAGAACGACGC//Bar-x CTAAATCTCGGTGACGGGCfl CCTGCTCAAATGGGAATA//r1 :AACGAATGACGCTACTGCPCR擴增體系(20μ L) :DNA lL，dNTP 1. 6L,Mg2+2L, IOXbuffer 2L，正向引物和反 向引物各 0.3L，Taq 酶 0.3L，ddH20 12. 5L。PCR 程序94°C變性 5min，58°C退火 30S，72°C 延伸45S，30個循環(huán)，最后72°C再延伸5min。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，見圖9、圖 10，并送博邁德公司測序。PCR擴增和測序結(jié)果表明(見圖11)，外源目的基因片段已成功 導(dǎo)入玉米中。C. Southern雜交檢測結(jié)果Ttl代陽性植株套袋自交結(jié)實，并于云南南繁加代，用上述PCR方法繼續(xù)檢測后代植 株的陽性情況。PCR陽性的株系進一步用Southern雜交檢測外源基因是否整合到玉米基因 組上及其在玉米基因組中的拷貝數(shù)。以MRDV目的基因片斷作為探針，質(zhì)粒pJIM19_MRDV303作為陽性對照，用Roche公 司 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 試劑盒進行基因組DNA Southern雜交，檢測目的基因拷貝數(shù)，步驟如下A. SpeI酶切基因組DNA用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，酶切體系見表2，反應(yīng)條件為 37°C，過夜。表2SpeI酶切反應(yīng)體系
Total SpeI50汕 3 pL10 χ K酶切緩沖液6 pL基因組 DNA (1 pg/^iL)10 ^iLddH2031 ^iL消化后的DNA加入1/10體積的IOXLoading緩沖液，以終止反應(yīng)。取5 μ L電泳 檢測消化效果。B.酶切產(chǎn)物電泳及變性制備0. 8%的瓊脂糖凝膠，酶切產(chǎn)物全部點樣電泳，電壓l-2V/cm，電泳過夜。將
26電泳后的凝膠去除膠孔，切成適當大小并切去左上角用做標記，于變性液中輕微振蕩變性 40mino將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液中，振蕩中和30min。C.毛細管法轉(zhuǎn)膜及固定取一方盤，在放盤內(nèi)加入適量的20 X SSR溶液，在方盤上架一玻璃板，在玻璃板上 鋪上一張Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，兩端浸沒在20 X SSR溶液中，濾紙與玻璃板之間無氣泡。將凝膠倒扣(點樣孔向下)在Whatman 3mm濾紙上，凝膠與濾紙之間無氣泡。按 凝膠的大小剪裁尼龍膜并剪去一角作為標記，水浸濕后，浸入20XSSR溶液中浸泡5min。將 膜準確覆蓋在凝膠上，接觸后不再移動。將兩張與膜大小相同的Whatman 3mm濾紙置于2 X SSR溶液中濕潤，覆蓋在膜上， 去除氣泡。濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，吸水紙上再置一玻璃板，玻板上壓0. 5 IKg的重物，水平轉(zhuǎn)膜過夜。取下尼龍膜，置于2 X SSC中漂洗5min，放于濾紙上涼干，將膜放在浸有10 X SSR的 厚濾紙上，DNA面向上，置于紫外交聯(lián)儀中，紫外光下自動交聯(lián)。D.標記探針取陽性質(zhì)粒pJIM19-MRDV303經(jīng)PCR擴增，得到目的基因序列產(chǎn)物。將1 μ g此產(chǎn) 物溶于16 μ L ddH20,100°C水浴IOmin,迅速冰浴冷卻，加入4 μ L DIG-High Prime的探針 標記液(viall)，37°C 標記 20h，加入 0. 2mol/L EDTA (pH 8.0)2yL 終止標記。E.預(yù)雜交42°C預(yù)熱IOmL的雜交液DIG Easy Hyb Granules (bottle 7)，將尼龍膜放入裝有 預(yù)雜交液的雜交管中，置于雜交爐中，42 °C預(yù)雜交2h。F.雜交將標記的探針(25ng/mL DIG High Hyb)于100°C水浴變性5min，使其變性，迅速置 于冰上冷卻。加變性的標記探針于預(yù)熱的雜交液中(3.5mL/100cm2膜)，置于雜交爐，42°C 雜交過夜。G.洗膜及顯色取出尼龍膜，按試劑盒說明書步驟及要求進行洗膜和顯色。部分陽性植株的分子 雜交結(jié)果見圖12。由于Spe I在RNAi載體上是單一的酶切位點，因此Southern雜交的條帶數(shù)即為 外源基因的拷貝數(shù)。Southern雜交結(jié)果表明，外源目的基因片段均以低拷貝形式插入玉米
基因組。實施例3本實施例為陽性株系抗病性接種鑒定具體步驟為A.傳毒介體昆蟲灰飛虱的飼養(yǎng)沙土與蛭石按1 1混合滅菌，用于培養(yǎng)水稻幼苗。待幼苗長至5cm左右，轉(zhuǎn)入灰 飛虱若蟲飼養(yǎng)，視幼苗生長情況及時更換新鮮幼苗用于灰飛虱取食(飼養(yǎng)條件溫度24°C， 相對濕度60%，光照14小時)，經(jīng)過多代繁殖可獲得大量灰飛虱。B.帶毒灰飛虱的獲得
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因為我國玉米粗縮病病原主要是水稻黑條矮縮病病毒，遺傳轉(zhuǎn)化玉米的外源基因 也是此病毒衣殼蛋白基因的保守序列。所以，將飼養(yǎng)1-2齡的無毒灰飛虱轉(zhuǎn)入水稻黑條矮 縮病病株上飼喂一周，而后轉(zhuǎn)入健康的水稻苗繼續(xù)飼養(yǎng)10天，待灰飛虱度過病毒循回期 后，此灰飛虱即為帶毒灰飛虱，可用于轉(zhuǎn)基因株系病毒接種的介體毒源。C.轉(zhuǎn)基因株系接種傳毒介體將陽性轉(zhuǎn)基因株系(TW1、TW2、TW3、TW4、TW5、TW6、TW7、TW8、TW9)與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?“18白”及抗病自交系“87-1”(是否是已知的？)種植于溫室內(nèi)，隨機區(qū)組設(shè)計，單行區(qū)，每 行14株，雙株種植，株行距30cmX 70cm，兩次重復(fù)。三葉一心時，接入帶毒灰飛虱，接蟲量約 每株5頭，接種植株用紗網(wǎng)隔離，同時設(shè)不接蟲對照。溫室溫度約25-30°C，自然光照。D.轉(zhuǎn)基因株系發(fā)病情況調(diào)查接蟲一周后，用殺蟲劑殺滅灰飛虱，10天后觀察病情發(fā)展情況，開花期調(diào)查病情指 數(shù)，記錄發(fā)病率。表3中發(fā)病率和病情指數(shù)為兩次重復(fù)的平均值。不同平均數(shù)后的相同字 母表示0. 0. 5水平差異不顯著，不同字母表示0. 0. 5水平差異顯著。R抗?。籑R中抗；S感病。表3轉(zhuǎn)基因株系田間對MRDV抗性鑒定
轉(zhuǎn)基因株系及對照發(fā)病率病情指數(shù)抗病等級TW246.813.8RTW551.316.5RTW753.518.2R87-155.819.1RTWl60.0 ·20.0RTW862.522.5MRTW375.627.0MRTW688.532.3MRTW991.038.5MRTW492.845.3S18-599 白100.047.8S實施例4本實施例為熒光定量PCR檢測接毒轉(zhuǎn)基因株系及對照MRDV CP基因表達
量(1)引物設(shè)計以轉(zhuǎn)化303bp MRDV目的基因為模板，18S rRNA為內(nèi)參基因設(shè)計引物，引物序列見表4。表4定量PCR用引物
權(quán)利要求
一種利用RNA干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法，其特征在于以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作為抗玉米粗縮病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作為初始模板，分別以下述四對引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次進行PCR擴增，下一對引物上下游的3’端分別與上一對引物上下游的5’端有部分堿基重疊，第一對引物以F0為模板，以后每一對引物以上一對引物的產(chǎn)物為模板，這樣每次PCR之后都在5’和3’端將目的序列延伸，最終擴增得到目的基因序列；四對引物分別如下f1TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，r1GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；f2TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，r2AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；f3GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，r3TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；f4CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，r4AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；將得到的目的基因序列經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶酶切形成粘性末端，再用與其相同的限制性內(nèi)切酶酶切中間載體pSK int，于1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離后回收酶切的目的條帶，連接克隆入pSK int載體中，形成含正反向重復(fù)目的片段的中間載體pSK int FR303；用不同的兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切中間載體pSK int FR303和植物表達載體pJIM19，電泳回收目的條帶后將含正反向重復(fù)序列的目的片段連接到pJIM19載體中，即為構(gòu)建成功的植物表達載體pJIM19 MRDV303；將植物表達載體pJIM19 MRDV303利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米的胚性愈傷組織，通過除草劑篩選、分化、生根壯苗，即獲得再生轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述主要步驟 (1)、玉米粗縮病病毒的RNAi載體的構(gòu)建A.重疊PCR法擴增獲得如SEQ ID NO. 1所述的目的基因序列 以SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列作為抗玉米粗縮病的目的基因序列，以SEQ ID NO. 2 所述的FO核苷酸序列作為初始模板，分別以四對引物fl/rl、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次進 行PCR擴增具體步驟如下1)PCR擴增獲得第一段序列首先合成目的基因片段的中間部分片段F0，即具有如SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列， 再以FO為初始模板、以上游引物f 1和下游引物rl進行PCR擴增； 擴增體系為，每20 μ L中含有 10XPCR buffer 2. 0 μ L, dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物fl0. 5yL,下游引物rl0. 5yL,rTaq 酶 ddH900. 2μ L, 13. 0μ L ；擴增程序為 94°C，5min ；94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s ；30 個循環(huán)； 72°C，5min ； 10°C保溫； 擴增得到第一段序列；2)PCR擴增獲得第二段序列以步驟1)的產(chǎn)物為模板，以上游引物f2和下游引物r2進行PCR擴增；擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f2 0. 5yL,下游引物r2 0. 5yL,rTaq 酶0· 2 μ L，ddH2013. OyL;擴增程序為 94°C，5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s ；30 個循環(huán)； 72°C，5min ； 10°C保溫； 擴增得到第二段序列；3)PCR擴增獲得第三段序列以步驟2)的產(chǎn)物為模板，以上游引物f3和下游引物r3進行PCR擴增；擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f30. 5yL,下游引物r30. 5yL,rTaq 酶0· 2 μ L，ddH2013. OyL;擴增程序為 94°C，5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s ；30 個循環(huán)； 72°C，5min ； 10°C保溫； 擴增得到第三段序列；4) PCR擴增獲得目的基因序列以步驟3)的產(chǎn)物為模板，以上游引物f4和下游引物r4進行PCR擴增； 擴增體系為，每20 μ L中含有 10XPCR buffer 2. 0 μ L，MgDNA模板 上游引物f4 下游引物r4 rTaq 酶 ddH90，1. 6 μ L, 1. 2μ L, 1. 0μ L, 0. 5μ L, 0. 5μ L, 0. 2μ L, 13. 0μ L ；擴增程序為 94°C，5min ；94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s ；30 個循環(huán)； 72°C，5min ； 10°C保溫； 擴增得到目的基因序列；將擴增產(chǎn)物目的基因序列在瓊脂糖凝膠上分離、回收和純化，得到純化的回收產(chǎn)物；5)連接和轉(zhuǎn)化①回收產(chǎn)物連接到PMD-18T反應(yīng)體系如下pMD-18T載體1 μ L，IOX連接酶緩沖液1 μ L，T4DNA連接酶350U，回收 PCR產(chǎn)物加至終反應(yīng)體積IOyL;16°C連接12小時，得到連接產(chǎn)物；②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞的制備a.取在無抗生素平板上生長良好的單個DH5α菌落，接種于Iml LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、225r/min振蕩培養(yǎng)過夜；b.取500μ L活化過夜的菌液于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 4 ；c.將菌液倒入50mL離心管中，冰浴IOmin；d.在預(yù)冷至4°C的離心機中，4000r/min離心IOmin后去掉上清液，收集菌體；e.加入20mL冰冷的0.lmol/L CaCl2于離心管中，均勻懸浮菌體后，冰浴中30min ；f.4°C下，4000r/min離心IOmin后去掉上清液，收集菌體，加入2mL冰冷的0. Imol/ LCaCl2溶液均勻懸浮菌體后，放入冰中待用；轉(zhuǎn)化步驟如下a.將連接產(chǎn)物加入200μ L感受態(tài)細胞中，充分混勻置于冰上30min ；b.42°C熱擊lmin 30s，冰浴2min后加入預(yù)熱至37°C的LB液體培養(yǎng)基600 μ L ；c.37°C>100r/min 低速振蕩培養(yǎng) 50min ；d.在每個含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上加100μ L菌液，均勻涂于平板上；e.37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時；6)陽性克隆的篩選以前述步驟4)得到的目的基因序列為模板，以下述引物f5和r5擴增全長目的基因序列f5 :CCTGCTCAAATGGGAATA, r5 :AACGAATGACGCTACTGC ；①挑取培養(yǎng)基平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、 225r/min振蕩培養(yǎng)12小時；②以菌液為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下 擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR buffer2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f50. 5yL,下游引物r50. 5yL,rTaq _0. 2 μ L,ddH2013. OyL;③PCR反應(yīng)擴增程序為 94°C，5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s ；30 個循環(huán)； 72°C，5min ； 10°C保溫；將得到的擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳分離；④測序通過測序確定擴增得到的序列與目的基因序列是否一致； B.構(gòu)建含正向序列的中間載體pSK-int-F3031)PCR擴增獲得正向片段以上述步驟A6)得到的目的基因序列為模板，設(shè)計上下游引物Fl和R1，其5’端分別引 入限制性內(nèi)切酶位點XhoI和Hindlll，酶切位點外側(cè)添加三個保護堿基以保證酶切完全； 引物序列如下F1 :5，ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3，， R1 5' CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3'；PCR擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR緩沖液2. 0 μ L, DNA 1-lOng, dNTPs ΙΟΟμπιοΙ/L，上游引物 Fl 5pmol，下游引物 Rl 5pmol, TaqDNA 聚合酶 1U，Mg2+L 5mmol/L， ddH20加至終體積20 μ L ；PCR 反應(yīng)程序為先 94°C 4min;再 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次；最后 72°C 延伸 5min ；將擴增得到的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳分離，得到正向片段PCR產(chǎn)物；2)PCR產(chǎn)物與中間載體的酶切、回收和純化①PCR產(chǎn)物30 μ L酶切體系為=IOXH緩沖液3. 0 μ L,正向片段PCR產(chǎn)物10. OyL,XhoI 5U, HindIII 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L ；②中間載體20 μ L酶切體系為10 X H緩沖液2· Ομ L，pSK-int中間載體5. 0 μ L，XhoI 5U, HindIII 5U, ddH20 加至終體積 20 μ L ；37°C溫育4小時，將得到的酶切產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上分離，再回收和純化，得到 純化的回收產(chǎn)物；3)正向片段連入中間載體①回收產(chǎn)物連接到中間載體pSK-intIOyL反應(yīng)體系為pSK-int中間載體2 μ L，10 X T4DNA連接酶緩沖液1 μ L，T4DNA連接 酶350U，回收正向片段酶切產(chǎn)物5 μ L，ddH20加至終反應(yīng)體積10 μ L ；16°C連接 IOh ；②轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，方法同前述步驟A5)；4)正向片段陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、 225r/min振蕩培養(yǎng)12h ；②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下=IOXPCR緩沖液2.Ομ L，DNA1. Ομ L 菌液，dNTPs 100ymol/L，引物 F1 5pmol，引物 R1 5pmol, Taq DNA 聚合酶 1U，Mg2+L 5mmol/ L，ddH20加至終體積20 μ L ；PCR擴增程序同上述步驟B 1)；③對PCR呈陽性的克隆，取500μ L菌液進行測序，完全正確的樣品用于下一步載體構(gòu) 建，命名為 pSK-int-F303 ；C.構(gòu)建含反向重復(fù)序列的中間載體pSK-int-FR3031)PCR擴增獲得反向片段以上述步驟A6)得到的目的基因序列為模板，設(shè)計上下游引物F2和R2，其5’端分別引 入限制性內(nèi)切酶位點SpeI和PstI，酶切位點外側(cè)添加三個保護堿基以保證酶切完全；引物 序列如下F2 :5， AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3，，R2 5' AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3'；PCR擴增體系為，每20 μ L中含有10XPCR緩沖液2. 0 μ L, DNA 1-lOng, dNTPs 100 μ mol/L，引物 F2 5pmol，引物 R2 5pmol, Taq DNA 聚合 IU，Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終 體積20 μ L ；PCR擴增程序同上述步驟Bi)；2)反向片段PCR產(chǎn)物與載體pSK-int-F303的酶切①PCR產(chǎn)物30μ L酶切體系10 XH緩沖液3.0 μ L，反向片段PCR產(chǎn)物10. 0 μ L，SpeI 5U, PstI 5U, ddH20 加至終體積 30 μ L ；②中間載體20μ L酶切體系10 XH緩沖液2. 0 μ L，pSK-int_F303中間載體5.0 μ L， SpeI5U, PstI 5U, ddH20 加至終體積 20 μ L ；37°C溫育4小時；③酶切產(chǎn)物的回收、純化、連接和轉(zhuǎn)化等操作與正向片段的相同；10 μ L連接體系為pSK-int-F303中間載體2 μ L，10 X T4DNA連接酶緩沖液1 μ L， T4DNA連接酶350U，回收反向片段酶切產(chǎn)物5 μ L，ddH20加至終反應(yīng)體積10 μ L ；·16°C連接 12h ；·3)反向片段陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、 225r/min振蕩培養(yǎng)12h ；②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，20μ L反應(yīng)體系如下10XPCR緩沖液2.0 μ L， DNA 1. 0 μ L 菌液，dNTPs 100 μ mol/L,引物 F2 5pmol,引物 R2 5pmol, TaqDNA 聚合 IU， Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L ；PCR擴增程序同上述步驟Bi)；③對PCR呈陽性的克隆，取500μ L菌液進行測序，完全正確的即為含反向重復(fù)目的片 段的中間載體，命名為pSK-int-FR303 ；D.構(gòu)建含反向重復(fù)序列的表達載體PJIM19-MRDV303DXhoI和SpeI雙酶切含反向重復(fù)目的片段的中間載體pSK-int-FR303·30μ L 酶切體系為10XK 緩沖液 1. 5μ L，pSK-int-FR303 15. 0 μ L，XhoI 5U，SpeI 5U, ddH20加至終體積30 μ L ；·37°C溫育30分鐘；·2)XhoI和SpeI雙酶切植物表達載體PJIM19·30 μ L 酶切體系如下:10ΧΚ 緩沖液 3. 0μ L，pJIM1910. 0 μ L, XhoI 5U, SpeI 5U, ddH20 加至終體積30 μ L ；·37°C溫育2小時；·3)酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后分別回收反向重復(fù)序列和植物表達載體的大 片段，所有操作按說明書進行；T4DNA連接酶連接；·10 μ L連接體系為10XT4DNA連接酶緩沖液lyL，正反向重復(fù)序列5yL，植物表達載 體的大片段2 μ L，T4DNA連接酶350U，ddH20加至終反應(yīng)體積10 μ L ； 16°C連接IOh ；·4)陽性克隆的篩選①挑取培養(yǎng)平板上生長良好的單菌落，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、 225r/min振蕩培養(yǎng)12小時；②取培養(yǎng)后的菌液進行PCR擴增，20μ L反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液2. 0 μ L，DNA 1. 0μ L 菌液，dNTPs 100ymol/L，引物 F2 5pmol，引物 R2 5pmol, Taq DNA 聚合酶 1U， Mg2+L 5mmol/L, ddH20 加至終體積 20 μ L ；PCR擴增程序同上述步驟Bi)；③PCR呈陽性的克隆在20mL含有50g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取 質(zhì)粒；XhoI和SpeI雙酶切鑒定，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測含有目的片段大小的條帶，即為 構(gòu)建好的植物表達載體，在本發(fā)明中命名為PJIM19-MRDV303 ；(2).農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化優(yōu)良玉米的胚性愈傷組織及植株的再生A.植物表達載體pJIM19-MRDV303轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌①農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備取-70°C保存的EHA105于含有50g/mL利福霉素平板劃線，28°C培養(yǎng)2天；挑取單菌 落接種于5mLYEP液體培養(yǎng)基中，225r/min，28°C振蕩培養(yǎng)12小時左右；將5mL菌液轉(zhuǎn)接于 IOOmLYEP液體培養(yǎng)基中，28°C，225r/min，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5 ；轉(zhuǎn)入無菌50mL的離心管，5000g離心5min，去上清液；加入ImL預(yù)冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰 上放置20min，4°C下，5000g離心5min，去上清；加入200 μ L預(yù)冷的含15%甘油的0. Imol/ L的CaCl2溶液，輕輕懸??；混勻后立即凍存于_70°C，備用；②表達載體PJIM19-MRDV303轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取0. 5g左右的pJIM19-MRDV303質(zhì)粒DNA加入到200L EHA105感受態(tài)細胞中，混勻后， 冰浴30min ；液氮中速凍Imin ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入800L YEP液體培養(yǎng) 基，28 V，150r/min振蕩培養(yǎng)4h，然后取200L菌液涂布在含50g/mL卡那霉素和50g/mL利 福霉素的YEP平板上，28°C培養(yǎng)到形成單菌落；③陽性克隆的鑒定挑取轉(zhuǎn)化后長出的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50g/mL卡那霉素和50g/mL利福霉素的YEP 液體培養(yǎng)基中，28°C，225r/min振蕩培養(yǎng)12h，用菌液作模板進行PCR檢測；PCR反應(yīng)體系及擴增程序同上述步驟(I)D 4)；B.農(nóng)桿菌浸染將含有目標載體PJIM19-MRDV303的農(nóng)桿菌接種到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那 霉素的YEP培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)2天；挑取單個菌落于含相應(yīng)抗生素的ImL YEP培養(yǎng)基中， 28°C、225r/min振蕩培養(yǎng)12h，再將其加入含相應(yīng)抗生素的50mL培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至0D600 =0. 5 ；4°C,4000r/min離心5min收集菌體，用等體積的液體浸染培養(yǎng)基懸浮；將待轉(zhuǎn)化優(yōu) 良玉米自交系的愈傷組織分別浸入含AS的浸染培養(yǎng)基，浸染5-lOmin ；C.共培養(yǎng)浸染了農(nóng)桿菌的愈傷組織置于滅菌紙上，吸干多余水分后接種到共培養(yǎng)基；用保鮮膜 封好平板，22°C暗培養(yǎng)3d;D.清洗及恢復(fù)培養(yǎng)共培養(yǎng)3d后的愈傷組織用5mL含250mg/L噻孢霉素鈉的滅菌蒸餾水清洗3次，置于滅 菌濾紙上吸干多余水分后，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上；用保鮮膜封好平板，25°C暗培養(yǎng)5d ；E.篩選轉(zhuǎn)化子恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含1. 5mg/L除草劑草丁膦的選擇培養(yǎng)基上；每兩周后將 抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的選擇培養(yǎng)基上；連續(xù)篩選3代，草丁膦濃度按1. 5mg/L、3. Omg/ L、5. Omg/L遞增；每次轉(zhuǎn)接都淘汰褐色的愈傷組織；F.轉(zhuǎn)基因植株的再生選取抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，所述的分化培養(yǎng)基為N6鹽和維生素+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+KT lmg/L, pH 5. 8 ；25°C光照培養(yǎng) 16 小時 /d ；2-3 周后，將分化出的幼苗轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基上，所述的生根壯苗培養(yǎng)基為MS鹽和維生 素 + 肌醇 100mg/L+ 生根粉 ABT 0. 25g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 5. 8 ；25°C光照培養(yǎng) 16 小時/d，即得到TO轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用RNA干擾技術(shù)培育抗粗縮病玉米的方法，以SEQIDNO.1所述的核苷酸序列為抗玉米粗縮病的目的基因序列，通過四次PCR反應(yīng)，獲得目的基因序列，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、分離、回收、連接，構(gòu)建植物表達載體；將植物表達載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米的胚性愈傷組織，通過除草劑篩選、分化、生根壯苗，即獲得再生轉(zhuǎn)基因植株。該方法利用RNA干擾技術(shù)，可培育出優(yōu)良的抗粗縮病的玉米轉(zhuǎn)基因植株，從根本上解決玉米粗縮病問題，顯著提高玉米產(chǎn)量，提高其經(jīng)濟價值。
文檔編號A01H4/00GK101979562SQ20101052505
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者付鳳玲, 張志勇, 李晚忱, 蔣曉芳 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)