專利名稱：一種抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中一種抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表 達(dá)的DNA片段及其在改良1B/1R易位系小麥加工品質(zhì)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥1B/1R易位系由于具有高產(chǎn)和適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)大面積推廣的高產(chǎn)小 麥中占有很大的份額。但這類品種普遍存在加工品質(zhì)差的問(wèn)題，主要體現(xiàn)在面筋強(qiáng)度低、 耐揉性差和面團(tuán)發(fā)粘，對(duì)面包和面條加工品質(zhì)都有明顯的不良影響(Dhaliwal等，Cereal Sci.，1990，12:165-175 ；劉建軍等，作物學(xué)報(bào)，2004，30 (2):149 153)。研究發(fā)現(xiàn)，小麥 1B/1R易位系IRS染色體臂上的ω-黑麥堿基因被認(rèn)為是導(dǎo)致面團(tuán)加工品質(zhì)變差的重要原 因(Graybosh 等，Cereal Chemistry, 1990, 67:342 - 349)，因此消除 ω-黑麥堿基因的 不良影響是改善小麥1B/1R易位系加工品質(zhì)的一條重要途徑。在用小麥1B/1R易位系做雜交親本的品質(zhì)育種中，人們常常在雜交后代中淘汰含 1B/1R易位的個(gè)體，但這樣做同時(shí)也淘汰了與ω-黑麥堿基因連鎖的高產(chǎn)和廣適基因，導(dǎo)致 培育出來(lái)的小麥雖優(yōu)質(zhì)但不高產(chǎn)，適應(yīng)性也比較差。在常規(guī)小麥育種中試圖打破ω-黑麥 堿基因與高產(chǎn)和廣適基因之間的連鎖很難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樗鼈兺幱谕庠吹腎RS染色體臂上， 常規(guī)條件下IRS染色體臂很難與小麥的IBS染色體臂配對(duì)，因此利用傳統(tǒng)育種方法很難解 決1B/1R易位系小麥高產(chǎn)不優(yōu)質(zhì)的難題。ω-黑麥堿基因是一個(gè)包括多個(gè)成員的基因家族，不同家族成員之間DNA序列高 度相似(Chai等，Cell Research, 2005，15(8) 658-664)，利用誘變技術(shù)突變個(gè)別ω-黑 麥堿基因是可行的，但要同時(shí)突變多個(gè)ω-黑麥堿基因則很難實(shí)現(xiàn)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的 RNA干涉(RNAi)技術(shù)可同時(shí)沉默多個(gè)序列高度相似的基因的表達(dá)，這為改良由多個(gè)基因控 制的單一性狀提供了一條有效途徑。其主要原理是在生物體內(nèi)摻入或表達(dá)目標(biāo)基因的雙 鏈RNA(ds-RNA)，可引起植物固有的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS，Post-Transcriptional Gene Silencing),與雙鏈RNA序列高度相似的內(nèi)源mRNA被降解，從而獲得目標(biāo)基因功能減弱或 缺失的表型(Scott 等，Nature, 2001，2:110_119;Phillip 等，Genes & Development， 2001, 15:485-490)。這項(xiàng)技術(shù)已被成功用于大幅度降低小麥種子中直鏈淀粉的含量(Li 等，Acta Genetica Sinica, 2005, 32 (8) 846-854)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可用于抑制小麥1B/1R易位系中ω-黑麥堿基因表達(dá)的DNA片 段及其在改良1B/1R易位系小麥加工品質(zhì)方面的用途。本發(fā)明提供的一種抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特 征在于其序列為序列表中SEQ ID NO. 1。SEQ ID NO. 1全長(zhǎng)936bp，其中l(wèi)_381bp為一個(gè)有 轉(zhuǎn)錄活性ω黑麥堿基因的部分編碼區(qū)序列，382-387bp為BamH I酶切位點(diǎn)序列，388_548bp為含有小麥蠟質(zhì)蛋白基因第一內(nèi)含子的一段DNA序列，549-555為含有Xba I酶切位點(diǎn)的一 段連接序列，556-936bp為l-381bp的反向互補(bǔ)序列。所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征在于利 用該片段、啟動(dòng)子和終止子等可以構(gòu)建成抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的 RNAi遺傳表達(dá)載體。所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征在于構(gòu)建 的RNAi遺傳表達(dá)載體為pAHC25-Sec。所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征在于構(gòu)建 的RNAi遺傳表達(dá)載體為pAHC15-Sec。所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征在于構(gòu)建 的RNAi遺傳表達(dá)載體為pCAMBIA-2200-Sec。所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征在于構(gòu)建 的RNAi遺傳表達(dá)載體為pCAMBIA-0390-Sec。所述啟動(dòng)子為玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、水稻Actin啟動(dòng)子或種子特異性啟動(dòng)子(如 小麥高分子量麥谷蛋白5亞基基因的啟動(dòng)子、ω-黑麥堿基因的啟動(dòng)子等)。所述RNAi遺傳表達(dá)載體包括兩種類型，一種含有抗性篩選標(biāo)記基因，一種不含抗 性篩選標(biāo)記基因。本發(fā)明還提供了所述DNA片段在抑制小麥1B/1R易位系中ω-黑麥堿基因表達(dá)方 面的用途，其特征在于利用所述RNAi遺傳表達(dá)載體對(duì)小麥1B/1R易位系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，從 中篩選出ω-黑麥堿基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)化體。所述的遺傳轉(zhuǎn)化，其特征在于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌侵染法、基因槍或花 粉管介導(dǎo)法。所述的基因槍介導(dǎo)法，其特征在于該方法包括兩種類型，一種是利用所述含有抗 性篩選標(biāo)記的RNAi遺傳表達(dá)載體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，另一種是把所述不含抗性篩選標(biāo)記的 RNAi遺傳表達(dá)載體與一種含有抗性篩選標(biāo)記的其它表達(dá)載體混合后進(jìn)行基因槍共轉(zhuǎn)化。所述DNA片段在抑制小麥1B/1R易位系中ω -黑麥堿基因表達(dá)方面的用途，其特 征在于通過(guò)基因槍介導(dǎo)法將RNAi遺傳表達(dá)載體pAHC25-Sec轉(zhuǎn)入到小麥1B/1R易位系的幼 胚愈傷組織中，抗性再生后代經(jīng)PCR檢測(cè)、RNA表達(dá)量檢測(cè)和種子貯藏蛋白SDS-PAGE電泳 檢測(cè)，篩選得到ω黑麥堿基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因后代。用本發(fā)明的方法把所述RNAi遺傳表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到小麥1B/1R易位系中，形成的雙 鏈RNA可引起小麥固有的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，使小麥1B/1R易位系內(nèi)源ω-黑麥堿基因轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)生的mRNA降解，下調(diào)甚至完全沉默ω-黑麥堿基因的表達(dá)。本發(fā)明在解決小麥1B/1R易 位系高產(chǎn)不優(yōu)質(zhì)這一問(wèn)題上將得到廣泛應(yīng)用。


圖1是轉(zhuǎn)pAHC25-Sec抗性再生植株BAR基因的PCR檢測(cè)圖譜 圖中
A為未轉(zhuǎn)化的蘭考906陰性對(duì)照植株；B為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pAHC25-Sec ； 1-6號(hào)為轉(zhuǎn)化蘭 考906后得到的抗性再生植株。
圖2是轉(zhuǎn)pAHC25-Sec抗性再生植株Ubiquitin啟動(dòng)子的PCR檢測(cè)圖譜 圖中
A為未轉(zhuǎn)化的蘭考906陰性對(duì)照植株；B為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pAHC25-Sec ； 1-6號(hào)為轉(zhuǎn)化蘭 考906后得到的抗性再生植株。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例中所用基因槍耗材購(gòu)自伯樂(lè)公司，所用試劑如無(wú)特別說(shuō)明均購(gòu)自上海 生工生物工程技術(shù)有限公司，所用引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例1 用于沉默ω -黑麥堿基因的DNA片段的制備
根據(jù)Cell Research雜志上發(fā)表的ω -黑麥堿基因不同成員編碼區(qū)的序列(Chai 等，Cell Research, 2005，15 (8) 658-664)，選取5 ‘相對(duì)保守的區(qū)段設(shè)計(jì)一對(duì)引物， P3-1 :ttcccgggccttcctcatctttgtcct (黑體部分為加入的 Sma I 酶切序列)，P4-1 taggatccgctctggtctctggggttg (黑體部分為加入的BamH I酶切位點(diǎn))，以小麥1B/1R易位 系蘭考906的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為94°C 4分鐘，94°C 45秒，65°C 45秒，72°C 1分鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用天根生化科技(北京)有 限公司的PBS-T克隆試劑盒進(jìn)行克隆，并選取部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。其中一個(gè)陽(yáng)性克隆 長(zhǎng)度為397bp，經(jīng)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其來(lái)自于一個(gè)具有表達(dá)活性的ω-黑麥堿基因的家族成 員，這里稱該擴(kuò)增片段為A片段，其DNA序列為序列表中的SEQ ID NO. 2。為得到上述A片段的反向互補(bǔ)片段，設(shè)計(jì)另一對(duì)引物反P4-1和反P3-1，其序列為 反P4-1 :aatttctagaagctctggtctctggggttg(黑體部分為加入的Xba I酶切位點(diǎn))和反 P3-1 :aatagagctcccttcctcatctttgtcct (黑體部分為加入的Sac I酶切位點(diǎn))，以上述含A 片段的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)與A片段擴(kuò)增時(shí)相同，得到與A片段反向互補(bǔ)的 C片段(不包括在引物中加上去的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)，其DNA序列為序列表中的SEQ ID NO. 3。含內(nèi)含子的DNA片段用PCR從小麥蠟質(zhì)蛋白基因(Waxy)的第一內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行 擴(kuò)增，所用引物為P內(nèi)ι :aattggatccggcggcctcggcgacgtcctcg(黑體部分為加入的BamH I 酶切位點(diǎn))和P內(nèi)2 :aatttctagaacccggtgaccgttggcctgca(黑體部分為加入的Xba I酶 切位點(diǎn))，以中國(guó)春小麥的的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)與擴(kuò)增A片段相同，擴(kuò) 增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，得到三種長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段(164bp、172bp和181bp)，其中長(zhǎng)度為 ISlbp的片段所含內(nèi)含子與文獻(xiàn)報(bào)道的小麥Waxy基因第一內(nèi)含子的序列完全相同，稱該片 段為B片段，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 4。在用pBS-T克隆試劑盒進(jìn)行克隆時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些沒(méi)有插入片段的藍(lán)斑，選擇一個(gè)藍(lán) 斑搖菌提質(zhì)粒得到閉環(huán)的PBS-T質(zhì)粒載體，該載體具有“Sma I-BamH I-Xba I-Sac I”結(jié)構(gòu) 的多克隆位點(diǎn)，在本發(fā)明中用其作為片段連接的中間質(zhì)粒載體。首先把Sma I/BamH I雙酶 切的正義片段A連接到同樣雙酶切的pBS-T載體上，在此基礎(chǔ)上再把BamH I/Xba I雙酶切 的含內(nèi)含子的B片段和和Xba I/Sac I雙酶切的與A片段反向互補(bǔ)的C片段依次連上去， 得到重組載體pBS-T-Sec，其中的“正義_內(nèi)含子-反義”結(jié)構(gòu)的片段就是本發(fā)明中用于抑制ω-黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 1 (不包括用于酶切目 的而加進(jìn)去的酶切位點(diǎn)序列及以外的保護(hù)堿基序列)。實(shí)施例2 =RNAi遺傳表達(dá)載體的構(gòu)建
用Sma I/Sac I雙酶切把GUS基因從基礎(chǔ)植物雙元表達(dá)載體pAHC25 (Christensen AH 和Quail PH, Transgenic Research, 1996，5213-218)上切除，然后連接上同樣雙酶切從 重組載體PBS-T-Sec上切下來(lái)的SEQ ID NO. 1片段，得到新的重組表達(dá)載體pAHC25-Sec，該 表達(dá)載體使用的啟動(dòng)子為玉米Ubiquitin，植物抗性篩選基因?yàn)锽AR基因，可直接用于基因 槍或花粉管介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)施例3 =RNAi遺傳表達(dá)載體的構(gòu)建
用Sma I/Sac I雙酶切把GUS基因從基礎(chǔ)植物雙元表達(dá)載體pAHC15 (Christensen AH 和Quail PH, Transgenic Research, 1996，5213-218)上切除，然后連接上同樣雙酶切從 重組載體pBS-T-Sec上切下來(lái)的SEQ ID NO. 1片段，得到新的重組表達(dá)載體pAHC15-Sec， 該表達(dá)載體使用的啟動(dòng)子為玉米Ubiquitin，不含植物抗性篩選基因，可與含植物抗性篩選 標(biāo)記 BAR 基因的表達(dá)載體 pAHC20 (Christensen AH 禾口 Quail PH, Transgenic Research, 1996，5:213-218)進(jìn)行基因槍共轉(zhuǎn)化。實(shí)施例4 =RNAi遺傳表達(dá)載體的構(gòu)建
用Hind III/EcoR I對(duì)實(shí)施例2中構(gòu)建的表達(dá)載體pAHC25-Sec進(jìn)行雙酶切，回收約 3. 2kb含Ubiquitin啟動(dòng)子、SEQ ID NO. 1片段和終止子的片段，然后將其連接到同樣雙酶 切的農(nóng)桿菌表達(dá)載體 pCAMBIA-2200 (Hajdukiewicz P, Svab Z 和 Maliga P, Plant Mol. Biol.，1994，25 (6) :989_994)上，得到可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pCAMBIA-2200-Sec， 該表達(dá)載體的植物抗性篩選基因?yàn)榭敲顾鼗?。?shí)施例5 =RNAi遺傳表達(dá)載體的構(gòu)建
用Hind III/EcoR I部分雙酶切實(shí)施例2中構(gòu)建的表達(dá)載體pAHC25_Sec，回收約6. Ikb 含Ubiquitin啟動(dòng)子、SEQ ID N0. 1、終止子、Ubiquitin啟動(dòng)子、BAR基因和終止子的片段， 然后將其連接到同樣雙酶切的農(nóng)桿菌表達(dá)載體pCAMBIA-0390 (Hajdukiewicz P, Svab Z 和Maliga P，Plant Mol. Biol.，1994，25 (6) :989_994)上，得到可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的表達(dá) 載體pCAMBIA-0390-Sec，該表達(dá)載體的植物抗性篩選基因?yàn)锽AR基因。實(shí)施例6 用基因槍介導(dǎo)法把表達(dá)載體pAHC25-Sec轉(zhuǎn)入小麥幼胚獲得ω -黑麥堿 基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因小麥1B/1R易位系
取小麥1B/1R易位系蘭考906授粉后8-15天的未成熟籽粒，用1%的次氯酸鈉溶 液消毒10分鐘，用無(wú)菌水沖洗4次，在無(wú)菌條件下挑出幼胚盾片朝上接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng) 基SD2上(MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽附加VB1 lmg/L、天冬酰胺150mg/L、2，4_D 2mg/L、蔗糖30g/ L、植物膠2.5g/L、pH 5.8)，黑暗條件下(25°C )誘導(dǎo)愈傷組織，7 10天后將愈傷組織集中 在高滲透壓培養(yǎng)基(SD2 + 0. 2mol/L甘露醇+ 0. 2mol/L山梨醇，pH 5.8)中央，處理4 6小時(shí)后供基因槍轟擊之用。按45 μ g/槍取適量金粉(直徑1. 0 μ m)懸浮液到1. 5mL離心管中，14，OOOrpm離 心30秒，去上清，加入ImL無(wú)離子水，14，OOOrpm離心5分鐘，去上清，依次加入220 μ L無(wú)菌 水、250 μ L CaCl2 (2. 5 mol/L)、50 μ L 亞精胺(0. lmol/L)、質(zhì)粒 DNA 溶液(濃度 1 μ g / 槍)， 將金粉和DNA的混合液振蕩10分鐘，14，OOOrpm離心5分鐘去上清，加入600 μ L無(wú)水乙醇打散沉淀，14，OOOrpm離心1分鐘后去乙醇，再加入無(wú)水乙醇(IOyL /槍)，準(zhǔn)備用于基因
槍轟擊。采用PDS-1000/He基因槍(Bia-Rod公司生產(chǎn))轟擊經(jīng)高滲培養(yǎng)基處理好的小麥 幼胚愈傷組織，轟擊參數(shù)為，氣體壓力llOOPsi，真空度28 inch Hg。轟擊后的愈傷組織繼 續(xù)在原高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 18小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入不加抗性篩選劑的SD2培養(yǎng)基中黑暗條 件下(25 °C)恢復(fù)培養(yǎng)2周?；謴?fù)培養(yǎng)2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(1/2MS + 1.0 mg/L KT + 0. 5 mg/L NAA + Bialaphos 3_5mg/L，pH 5.8)上培養(yǎng)4 6周(25°C、10小時(shí)光照/天)，愈傷組織 分化出綠芽以后，將再生芽轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(1/2MS + Bialaphos 3_4mg/ L，pH 5.8)上，光照與溫度同前，待分化出的抗性苗生長(zhǎng)到1 2cm時(shí)，轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基 (1/2MS + IAA 0. 5mg/L +多效脞0. 5mg/L，pH 5.8)上壯苗，再生植株生長(zhǎng)到適宜大小(苗 高6 8cm，根系較好)時(shí)移入培養(yǎng)缽，幼苗在4-8°C進(jìn)行綠體春化20天后移栽到溫室。共 得到6株生長(zhǎng)正常的抗性再生植株。將得到的6株生長(zhǎng)正常的抗性再生植株編為1-6號(hào)，用CTAB法提取其葉片基因組 DNA。用表達(dá)載體pAHC25_Sec中的BAR基因和Ubiquitin啟動(dòng)子的引物對(duì)上述抗性 再生植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，以未轉(zhuǎn)化的蘭考906植株作陰性對(duì)照(編號(hào)為A)， 以質(zhì)粒pAHC25-Sec作陽(yáng)性對(duì)照(編號(hào)為B)，引物序列為BAR-pl :gTCTgCACCATCgTCAACC， BAR-p2 :gAAgTCCAgCTgCCAgAAAC 禾口 Ubi_p1:CTCgCCCgCCgTAATAAATAgACA， Ubi_p2: TAAAggAAAAgggCAAACCAAACC ；采用 25 μ 1 的反應(yīng)體系，其中含有 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 9.0，每種 dNTP 0.1 mM,正反向引物各 0.4 μ M, 1.5 U Taq DNA 聚合酶和約100 ng的基因組DNA或Ing的質(zhì)粒DNA。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘，94°C 變性45秒、58°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，循環(huán)35次，然后再延伸7分鐘。結(jié)果顯示，在6株抗性再生植株中檢測(cè)到2株BAR基因和Ubiquitin啟動(dòng)子均呈 陽(yáng)性的植株，見(jiàn)圖1和圖2中的3號(hào)和5號(hào)。用天根生化科技(北京)有限生產(chǎn)的RNApr印pure植物總RNA提取試劑盒提 取上述2個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的T2代純合轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)化陰性對(duì)照植株開(kāi)花15天 后的籽粒總RNA，并用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄 成 cDNA,以反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 為模板，ω-sec-Pi :accttcctcatctttgtcct 禾口 co-Sec_P2 ccgatgcctataccactact為引物檢測(cè)ω-黑麥堿基因的表達(dá)，擴(kuò)增產(chǎn)物包括了 ω-黑麥堿 基因成熟蛋白編碼區(qū)的完整序列。檢測(cè)時(shí)以Actin基因作為內(nèi)參，內(nèi)參引物為Actin-F: ggAATCCATgAgACCACCTAC 和 Actin-R: gACCCAgACAACTCgCAAC。反應(yīng)參數(shù)為94°C 預(yù)變性 3 分鐘，94°C變性45秒、65 °C退火45秒，72°C延伸1. 5分鐘，循環(huán)30次，然后72°C延伸7分 鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀照相，并用圖像分析軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物 的相對(duì)含量。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因的A對(duì)照相比，3號(hào)和5號(hào)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的T2代純合株系 擴(kuò)增產(chǎn)物的量均顯著下降，分別為對(duì)照的40%和25%，說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因株系中產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄后基 因沉默，內(nèi)源ω -黑麥堿基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA被大量降解，具有完整功能的mRNA的數(shù)量大 幅減少。
進(jìn)一步用 SDS-PAGE 電泳(Hussain 和 Lukow, 1994，Euphytica, 78:109-134)對(duì)上 述3號(hào)和5號(hào)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的T2代純合轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誂植株成熟種子中 ω-黑麥堿的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中ω-黑麥堿的表達(dá)量明顯降低，凝膠電泳 經(jīng)凝膠成像儀照相后，用圖像分析軟件分析ω -黑麥堿條帶的相對(duì)表達(dá)量，得出這兩個(gè)Τ2 代轉(zhuǎn)基因株系的種子中ω-黑麥堿的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的30%和20%，說(shuō)明本發(fā)明可用來(lái)獲得 ω-黑麥堿基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因小麥1B/1R易位系。
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權(quán)利要求
一種抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征在于其序列為序列表中SEQ ID NO.1。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征 在于利用該片段構(gòu)建成抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的RNAi的遺傳表達(dá)載 體。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征 在于構(gòu)建的RNAi的遺傳表達(dá)載體為pAHC25-Sec。
4.根據(jù)權(quán)利2所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征 在于構(gòu)建的RNAi的遺傳表達(dá)載體為pAHC15-Sec。
5.根據(jù)權(quán)利2所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征 在于構(gòu)建的RNAi的遺傳表達(dá)載體為pCAMBIA2200-Sec。
6.根據(jù)權(quán)利2所述的抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段，其特征 在于構(gòu)建的RNAi的遺傳表達(dá)載體為pCAMBIA0390-Sec。
7.一種用于抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的用途，其特征在于用權(quán)利要 求2 7所述的遺傳表達(dá)載體對(duì)小麥1B/1R易位系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ω黑麥堿基因表達(dá) 活性受到抑制的轉(zhuǎn)化體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的用 途，其特征在于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌侵染法或基因槍介導(dǎo)法。
9.根據(jù)權(quán)利要求7和8所述的一種用于抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá) 的用途，其特征在于通過(guò)基因槍介導(dǎo)法將RNAi遺傳表達(dá)載體pAHC25-Sec轉(zhuǎn)入到小麥1B/1R 易位系的幼胚愈傷組織，抗性后代經(jīng)PCR檢測(cè)、RNA表達(dá)量檢測(cè)和種子貯藏蛋白SDS-PAGE電 泳檢測(cè)，篩選得到ω黑麥堿基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因后代。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制小麥1B/1R易位系中ω黑麥堿基因表達(dá)的DNA片段及其用途。所述DNA片段由ω黑麥堿基因編碼區(qū)部分序列、植物內(nèi)含子序列和ω黑麥堿基因編碼區(qū)部分序列的反向重復(fù)序列依次連接構(gòu)成。通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑，把含有所述DNA片段的RNAi遺傳表達(dá)載體轉(zhuǎn)入小麥1B/1R易位系中，可抑制內(nèi)源ω黑麥堿基因的表達(dá),減輕或消除ω黑麥堿對(duì)小麥1B/1R易位系的食品加工品質(zhì)的不良影響，進(jìn)而達(dá)到改善小麥1B/1R易位系的食品加工品質(zhì)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101955938SQ201010532880
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者楊帆, 柴建芳, 王海波 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所