專利名稱：利用BGIos389基因促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)的方法。特別地，本發(fā)明利用BGIOS389基因促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
水稻是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其栽種面積為4. 5億畝左右。世界上約有60%的人口以稻米作為日常主食。通過(guò)水稻的分子育種來(lái)提高產(chǎn)量，給全球的糧食生產(chǎn)帶來(lái)了巨大收益。矮稈基因的利用和多分蘗水稻的育成，使我國(guó)的水稻產(chǎn)量取得了巨大飛躍。但在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里，我國(guó)的水稻單產(chǎn)出現(xiàn)了徘徊不前的局面。由此，許多育種工作者從育種理論和方法上提出了新的思路和設(shè)想，希望使水稻單產(chǎn)取得新的突破。在水稻的高產(chǎn)育種理論上，國(guó)際水稻研究所于20世紀(jì)90年代初就提出了基于新株型的超級(jí)稻理論，然而，到目前為止，在水稻的育種科研與實(shí)踐中對(duì)水稻地下部分的形態(tài)和生理性狀的改良卻未能在水稻的分子育種中得以具體體現(xiàn)。目前我國(guó)水稻的水肥利用率低，這不僅造成大量人力、物力和財(cái)力的浪費(fèi)，而且大量的化學(xué)肥料和農(nóng)藥通過(guò)地表徑流以及土壤滲透排入江河湖泊和地下水中，對(duì)地表和地下水造成嚴(yán)重污染。這已經(jīng)成為環(huán)境污染的一個(gè)重要方面。另一方面，全世界近一半的水稻種植面積處在缺水的狀態(tài)下，嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量的提高。我國(guó)很多地區(qū)由于相對(duì)缺乏灌溉用水，致使水稻生產(chǎn)難以發(fā)展，這在一定程度上影響了耕地資源的充分利用。因此，提高水稻本身的水肥利用率，發(fā)展節(jié)水型水稻，是新時(shí)期可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的又一基本要求。而對(duì)于提高水稻品種本身的肥料利用率來(lái)說(shuō)，根系的相關(guān)形態(tài)和生理性狀的改良至關(guān)重要。隨著環(huán)保和農(nóng)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)，解決水稻易發(fā)生根倒伏，提高水肥利用率已成為提高水稻產(chǎn)量和發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。從根系角度研究水稻抗根倒伏的生物學(xué)、力學(xué)機(jī)制及其遺傳基礎(chǔ)，對(duì)于從栽培和育種角度減輕水稻根倒伏的危害，具有巨大的現(xiàn)實(shí)和長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。水稻根系既是吸收養(yǎng)分和水分的重要器官，也是一些物質(zhì)合成和運(yùn)輸?shù)钠鞴?，它的形態(tài)發(fā)育對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響很早就引起人們的注意。育種學(xué)家主要關(guān)注于環(huán)境對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響(孫傳清等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).1995，觀(1) :42-48)以及根系與產(chǎn)量等因素之間的相互關(guān)系(凌啟鴻等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).1984，(4) :3-11)，然而，關(guān)于根系的分子育種研究卻很少報(bào)道。與根系性狀表達(dá)相關(guān)的分子標(biāo)記的開發(fā)表明，控制水稻根系發(fā)育的是數(shù)量性狀(Yadav 等人，Theor Appl Genet. 1997,94 :619-632 ；徐吉臣等，遺傳學(xué)報(bào)· 2002， 29(3) :245-249)，但這并未引起足夠的重視。石慶華等(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).1997，30 (4) 61-67)研究了根系發(fā)育與地上部分的相關(guān)關(guān)系，并指出，在栽培上培育有利于塑造理想株型的根型是水稻高產(chǎn)栽培的新要求，深根系更有利于高產(chǎn)。但是，育種工作者至今未能就什么是理想的水稻根型提出具體明確的指標(biāo)。目前，如何從思路和技術(shù)上提出一種嶄新的方法來(lái)定位水稻根系發(fā)育的基因已成為水稻育種的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明，檢測(cè)自然選擇信號(hào)可能是一條嶄新的、高通量的鑒定有用基因的道路。由于人工選擇的時(shí)間短，遺傳重組事件少，受選擇的基因與其鄰近區(qū)域會(huì)緊密連鎖，因此，如果觀察到一個(gè)基因組區(qū)域的多態(tài)性分布很特別，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，那么該區(qū)域含有的基因和突變位點(diǎn)即有可能與選擇的性狀相關(guān)。研究表明，水稻全基因組大約 6%的區(qū)域?yàn)镾NP高變區(qū)，這些區(qū)域可能富集了與亞種分化和重要復(fù)雜農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因(Tang等人，PLoS Genet. 2006,2 :el99)。Gao L Z等(BMC Evolutionary Biology. 2008， 8 11)通過(guò)對(duì)栽培稻和普通野生稻進(jìn)行對(duì)比分析，建立了理論群體遺傳學(xué)數(shù)學(xué)模型，檢測(cè)了 60個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)所受的人工選擇，發(fā)現(xiàn)了一些留有顯著選擇痕跡的位點(diǎn)以及其近鄰的可能的功能基因。但這些研究離從全基因組水平全面分析人工選擇的基因依然遙遠(yuǎn)，這主要是因?yàn)閿?shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，模型和方法也有待提高。迄今為止識(shí)別出的水稻性狀基因如 qSHl、Re、sh4、hdl (Kovach 等人，Trends in Genetics. 2007,23(11) :578-587)，以及 PROGl (Jin 等人，Nature Genetics. 2008,40(11) :1365-1369)和 GIFl (Wang 等人，Nature Genetics. 2008,40(11) :1370-1374)仍然是通過(guò)傳統(tǒng)的圖位克隆手段獲得的。新一代測(cè)序技術(shù)(如Solexa、Solid測(cè)序儀)的出現(xiàn)，為廉價(jià)高效地獲得水稻根系發(fā)育基因和基因家族提供了前所未有的機(jī)會(huì)。利用野生稻與栽培稻的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)和技術(shù)，能夠比較各栽培種及野生種的基因組結(jié)構(gòu)的異同，這使運(yùn)用進(jìn)化基因組學(xué)的理論和方法來(lái)獲得根系發(fā)育相關(guān)的基因或基因組功能元件成為可能。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)水稻根系發(fā)育形態(tài)、生理性狀的遺傳改良一直未能在水稻的分子育種中得以體現(xiàn)。雖然雜交水稻的根系比常規(guī)品種在形態(tài)和生理上占有優(yōu)勢(shì)，使育種家看到了根系改良的重要性和實(shí)際效果，但是迄今為止未能提出一套具體的改良指標(biāo)。因此，需要進(jìn)一步研究和開發(fā)水稻根系發(fā)育相關(guān)基因，以進(jìn)一步提高根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和對(duì)水肥的利用率，減少農(nóng)藥的施用，增加地上部分的分蘗和收獲等。隨著水稻分子育種理論與技術(shù)的不斷成熟和完善，以及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化，利用新型測(cè)序技術(shù)結(jié)合基因組學(xué)方法來(lái)鑒定受人工選擇的基因資源，使得利用基因組重測(cè)序技術(shù)發(fā)掘根系發(fā)育相關(guān)基因和遺傳轉(zhuǎn)化成為可能。水稻地下部分發(fā)育的改良將進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等。水稻根系發(fā)育相關(guān)基因的開發(fā)和遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)于提高水稻地上部分的產(chǎn)量、降低農(nóng)業(yè)投入、緩解環(huán)境污染、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義， 其有利于增強(qiáng)我國(guó)農(nóng)業(yè)在國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，基因BGIos389(其序列可以是SEQ ID NO 7)具有促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的功能。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有基因BGIOS389的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述載體優(yōu)選是表達(dá)載體，更優(yōu)選是在植物中高效表達(dá)基因BGIos389的載體，例如包含基因BGIos389的重組載體p6，如本發(fā)明的重組載體p6+BGIos389。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有基因BGIos389或根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是根癌農(nóng)桿菌，例如根癌農(nóng)桿菌 EHA105-p6+BGIos389o在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了基因BGIos389和/或根據(jù)本發(fā)明的載體和/或宿主細(xì)胞用于促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)或用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物與未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長(zhǎng)。
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在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的方法，其包括將基因BGIos389 和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物，或用根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞感染植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來(lái)將基因 BGIos389或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因BGIos389可操作地連接至在植物中有效的表達(dá)調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動(dòng)子和/或NOS終止子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將基因BGIos389和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞感染植物愈傷組織；2)從所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物與未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長(zhǎng)，例如轉(zhuǎn)基因植物的根系更密集更發(fā)達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來(lái)將基因 BGIos389和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因BGIos389可操作地連接至在植物中有效的表達(dá)調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動(dòng)子和/或NOS終止子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有基因BGIos389或本發(fā)明的載體或被本發(fā)明的宿主細(xì)胞感染的植物愈傷組織。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了上文所述的植物愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其被導(dǎo)入了基因BGIos389和/或根據(jù)本發(fā)明的載體和/或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物，與未導(dǎo)入基因BGIos389或根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的對(duì)照植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長(zhǎng)，例如轉(zhuǎn)基因植物的根系更密集更發(fā)達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因BGIos389可操作地連接至在植物中有效的表達(dá)調(diào)控元件，所述表達(dá)調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動(dòng)子和/或NOS終止子。在本發(fā)明中，重組載體p6是指，包含玉米泛素啟動(dòng)子和NOS終止子的 pCAMB IA-1301 載體。在本發(fā)明中，植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子(Setariaitalica)、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻，例如日本晴。發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，基因BGIos389具有促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的功能。從而，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案將進(jìn)一步提高根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和對(duì)水肥的利用率，減少農(nóng)藥的施用，增加地上部分的分蘗和收獲，進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。這對(duì)于降低農(nóng)業(yè)投入、緩解環(huán)境污染、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和增強(qiáng)我國(guó)農(nóng)業(yè)在國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)力具有重要的意義。關(guān)于生物材料保藏的說(shuō)明
本發(fā)明涉及以下生物材料1.普通野生稻元江種子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC P201011 ；2.根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105，其于 2009 年 12 月 24 日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC M 209315 ；3.水稻日本晴種子，其于2009年12月18日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC P200910。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。附圖概述


圖1是顯示愈傷組織⑶S染色的檢測(cè)結(jié)果的照片。左邊的愈傷組織為未轉(zhuǎn)化 BGIos389基因的對(duì)照愈傷組織，右邊的愈傷組織為轉(zhuǎn)化了 BGIos389基因的轉(zhuǎn)基因愈傷組
幺口
/Ν ο圖2是顯示水稻苗的根系性狀觀察結(jié)果的照片。其中，左邊試管為轉(zhuǎn)化了 BGIos389基因的轉(zhuǎn)基因水稻苗，右邊試管為未轉(zhuǎn)化BGIos389基因的對(duì)照水稻苗。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :BGIos389基因的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+BGIos389重組載體的構(gòu)建1.PCR 擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號(hào)DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongonYuanjiang)(其由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供)的基因組DNA(gDNA)。根據(jù)BGIos389基因的堿基序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR 特異性擴(kuò)增引物上游引物Fl (SEQ ID NO 1)包含限制性酶切位點(diǎn)BamHI，下游引物Rl (SEQ ID而⑵包含限制性酶切位點(diǎn))(bal。以上述提取的元江gDNA為模板，利用上游引物F1、 下游引物Rl和高保真Ex TaqTM(TaKaRa,DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系如表1所示。表1 :BGIos389基因的PCR擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.含有基因BGIos389的載體，所述載體優(yōu)選是表達(dá)載體，更優(yōu)選是在植物中高效表達(dá)基因BGIos389的載體，例如包含基因BGIos389的重組載體p6。
2.含有基因BGIos389或權(quán)利要求1的載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是根癌農(nóng)桿菌,例如根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIos389。
3.基因BGIos389和/或權(quán)利要求1的載體和/或權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞用于促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)或用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。
4.權(quán)利要求3的用途，其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻；優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因植物與未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長(zhǎng)。
5.一種促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的方法，所述方法包括將基因BGIos389和/或權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)化入植物，或用權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞感染植物，其中，優(yōu)選，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來(lái)將所述基因和/或所述載體轉(zhuǎn)化入植物； 優(yōu)選，所述基因可操作地連接至在植物中有效的表達(dá)調(diào)控元件，所述表達(dá)調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動(dòng)子和/或NOS終止子；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻。
6.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將基因BGIos389和/或權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞感染植物愈傷組織；2)從所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物；其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻；優(yōu)選，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來(lái)將所述基因和/或所述載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織； 優(yōu)選，所述基因可操作地連接至在植物中有效的表達(dá)調(diào)控元件，所述表達(dá)調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動(dòng)子和/或NOS終止子；優(yōu)選，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物與未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長(zhǎng)。
7.通過(guò)權(quán)利要求6的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻。
8.含有基因BGIos389或權(quán)利要求1的載體或被權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞感染的植物愈傷組織，其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻。
9.權(quán)利要求8的植物愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。
10.一種轉(zhuǎn)基因植物，其被導(dǎo)入了基因BGIos389和/或權(quán)利要求1的載體和/或權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞，其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻；優(yōu)選，所述基因可操作地連接至在植物中有效的表達(dá)調(diào)控元件，所述表達(dá)調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動(dòng)子和/或NOS終止子；優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因植物與未導(dǎo)入基因BGIos389或權(quán)利要求1的載體或權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用BGIos389基因促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)，提供了利用BGIos389基因促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)的方法和用途。本發(fā)明還提供了具有導(dǎo)入的BGIos389基因的轉(zhuǎn)基因植物，以及產(chǎn)生此類轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102465139SQ20101053913
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者倪雪梅, 孫紅正, 李寧, 楊爽 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司