專利名稱：離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是生物技術(shù)領(lǐng)域的一種玉米轉(zhuǎn)基因方法，尤其涉及一種以玉米成熟種子為 材料，進(jìn)行離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
玉米是是我國和世界主要的農(nóng)作物之一，玉米的生產(chǎn)對于世界和我國的糧食問題 具有重要的意義。隨著世界人口的增長和環(huán)境的惡化，育種工作者遇到了前所未有的挑戰(zhàn)， 而常規(guī)育種又有著育種進(jìn)程慢、遺傳資源匱乏等缺點。因此，開展玉米轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)研究 勢在必行。目前，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)中已發(fā)展了多種轉(zhuǎn)化方法，而以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法 最為成熟。盡管如此，這兩種方法仍有很大的缺陷，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對玉米基因型要求 嚴(yán)格，不同基因型之間轉(zhuǎn)化效率表現(xiàn)差異較大，再生時間長以及玉米幼胚作為該方法的最 為常用外植體受到季節(jié)生長的限制，嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率；基因槍法又有著轉(zhuǎn)化頻率低、工作 量大和耗材昂貴等缺點。因此，研究者一直致力于開發(fā)一種具有轉(zhuǎn)化頻率較高、不受生長季 節(jié)和基因型限制等特點的轉(zhuǎn)基因方法。脈沖電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)是 Schwartz 等人于 1984 年發(fā)明的一種全新的電泳技術(shù)，用于分離約IOMbp的DNA片段。其原理是在凝膠上外加正交 電場，交替變化的電場能夠使DNA分子重新定向在狹小的凝膠中不斷向前運動而分離。利 用脈沖電泳技術(shù)分離大片段的DNA分子原理為帶壁的植物細(xì)胞進(jìn)行外源基因?qū)肽康氖?體提供了一種新思路。自從楊金水等人利用低壓脈沖電泳對水稻愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得成 功后，在隨后幾年內(nèi)，脈沖電泳作為一種新型的轉(zhuǎn)基因方法逐漸受到研究者的重視并得到 了很大的發(fā)展。目前，利用該技術(shù)雖有多個物種相繼報道獲得了成功，但該方法的缺點是轉(zhuǎn) 化頻率低，轉(zhuǎn)化頻率不穩(wěn)定。造成這一缺點的原因主要有以下幾個方面1.根據(jù)目前報道的研究，使用該技術(shù)必須對植物細(xì)胞進(jìn)行處理，例如水稻種子 要誘導(dǎo)出愈傷組織，然后酶解細(xì)胞壁，釋放出沒有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，才能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的成 功。而這種處理效率低，對外植體傷害大。2.不同的物種間形成胚性愈傷組織的能力差異較大，表現(xiàn)最為明顯的是玉米等單 子葉植物胚性愈傷組織的誘導(dǎo)較為困難，因此會導(dǎo)致下一步的成苗率差、轉(zhuǎn)化效率低等缺點。
3.使用的外源DNA本身沒有穿透細(xì)胞膜的能力，主要依靠脈沖電流在處理材料的 細(xì)胞膜上形成穿孔，外源DNA才能進(jìn)入植物細(xì)胞，最終整合到基因組。選擇合適的電泳時間 及電壓是外源DNA成功轉(zhuǎn)移的首要條件，電泳時間過長對外植體影響較大，影響成苗率，電 泳時間過短不能使外源DNA最大量的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低轉(zhuǎn)化效率；同樣，電壓小不足以使細(xì) 胞膜形成穿孔，電壓過大易使材料失去活性。正是由于以上的各種原因，大大降低了脈沖電泳轉(zhuǎn)基因的效率和不穩(wěn)定性，嚴(yán)重 制約著該技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，無法獲得長足發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種基于提高脈沖電泳轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性為目的，以離子束輔助脈沖 電泳轉(zhuǎn)化玉米種子并直接成苗的轉(zhuǎn)基因方法。該方法以成熟的玉米種子為材料，對種子進(jìn) 行N離子進(jìn)行注射處理后，進(jìn)行脈沖電泳轉(zhuǎn)基因，并獲得轉(zhuǎn)基因玉米，該方法為玉米的遺傳 轉(zhuǎn)化提供了一種新方法，為玉米的轉(zhuǎn)基因育種奠定了基礎(chǔ)。本方法主要通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技 術(shù)，對成熟的玉米種子進(jìn)行N離子注射后，將其置于特制的瓊脂糖凝膠膠塊中進(jìn)行脈沖電 泳，然后培養(yǎng)成苗的一種玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)。具體包括如下步驟(1)選取成熟飽滿的玉米種子，在0. I^WHgCl2中進(jìn)行消毒15min，然后用無菌水 沖洗3-5次，剝?nèi)シN胚周圍種皮；將消毒并剝皮的種子分單層、均勻排布在培養(yǎng)皿內(nèi)，種胚 朝向束流方向，進(jìn)行N離子注射處理；(2)將處理后的種子置于包埋膠中，制作支持膠，然后將包埋玉米種子的包埋膠放 入支持膠上，放入電泳槽，將要轉(zhuǎn)化的外源基因樣品注入支持膠起始位置的樣孔內(nèi)，開始電 泳；(3)電泳結(jié)束后，將玉米種子放入MS培養(yǎng)基上成苗，然后移到大田，待3-4葉期進(jìn) 行除草劑抗性篩選和PCR檢測。通過對后代植株進(jìn)行除草劑抗性篩選及PCR檢測，表明外 源基因已經(jīng)成功的導(dǎo)入受體，獲得了玉米轉(zhuǎn)基因植株。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，進(jìn)行N離子注射處理時，劑量為2X 1016N7cm2。作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方案，電泳時間為120min。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在1.本方法在進(jìn)行脈沖電泳前，將玉米種子進(jìn)行一定劑量的N離子注射處理，研究 認(rèn)為，離子束對植物的細(xì)胞壁具有濺射作用，最終在細(xì)胞壁上可以產(chǎn)生穿孔和損傷，為后續(xù) 脈沖電泳過程中外源DNA進(jìn)入細(xì)胞提供了通道，與單獨使用脈沖電泳轉(zhuǎn)基因相比，該方法 大大提高了玉米的轉(zhuǎn)基因效率。2.本方法避免了在脈沖電泳前對細(xì)胞進(jìn)行酶解細(xì)胞壁的流程，可以直接對批量的 玉米種胚進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，提高了工作效率，避免了玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)困難的缺陷，大大降 低了工作量，提高了成苗率，有利于轉(zhuǎn)化效率的提高。3. 一定劑量的離子束處理后，注入離子的正電荷降低了細(xì)胞表面的負(fù)電荷，在進(jìn) 行脈沖電泳過程中，減弱了對外源DNA的排斥力，促進(jìn)了外源DNA進(jìn)入細(xì)胞，提高了細(xì)胞對 進(jìn)入的外源DNA的吸附力，對轉(zhuǎn)化效率的提高起到了重要作用。4.外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，必須整合到受體基因組中，轉(zhuǎn)化才有可能成功。離子束對 種子進(jìn)行注射處理后，能夠?qū)?xì)胞核和染色體塊結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定破壞，在一定程度上打斷細(xì) 胞內(nèi)的染色體DNA結(jié)構(gòu)，對于外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并整合到受體基因組是有利的，促進(jìn)轉(zhuǎn)化 效率的提高。


圖1為本發(fā)明中不同N離子劑量對玉米發(fā)芽的影響。
圖2為本發(fā)明中脈沖電泳時間對出苗率的影響。
具體實施例方式1.玉米種子的N離子注射處理1. 1選取玉米A188自交系成熟種子，使用0. 1 %的HgCl2中進(jìn)行消毒15min，然后 用滅無菌水沖洗3-5遍，剝?nèi)シN胚周圍的種皮；1. 2將消毒好的玉米種子排列于直徑IOcm的培養(yǎng)皿中，種胚朝著束流方向，劑量 分別為 2X IO16NVcm2,5X IO16NVcm2,8X IO16NVcm2 和 11 X IO16NVcm2,同時以一份不經(jīng)離子 束處理的種子作為對照。通過對Ml代種子發(fā)芽率、出苗率和存活率進(jìn)行統(tǒng)計，表明選用 2X IO16NVcm2劑量的離子束對玉米種子處理后，Ml代種子表現(xiàn)出發(fā)芽和出苗的刺激效應(yīng)， 在此之后，隨著輻照劑量的增加，三種誘變源均表現(xiàn)出對Ml代種子發(fā)芽和出苗的抑制效 應(yīng)，呈顯著的負(fù)相關(guān)，如圖1。2.離子束輔助的脈沖電泳使用北京科斯佳科技公司提供的k5061866型號的脈沖電泳儀，以2 X IO16NVcm2劑 量的N離子注射處理后的玉米A188玉米自交系種子為材料，進(jìn)行離子束輔助的脈沖電泳轉(zhuǎn)基因。2. 1脈沖電泳時間的優(yōu)化受離子束照射影響，加上脈沖電場對種子損傷，對種子出苗及成活率影響較大，因 此，選擇合適的電泳時間尤為重要。本發(fā)明中設(shè)計了不同電泳時間，以研究對成苗率的影 響，分別為0，90，120，150和180min，然后將其置于MS培養(yǎng)基上，統(tǒng)計成苗率(3次重復(fù))； 另外，待幼苗移入大田到四葉期，對抗性苗進(jìn)行PCR檢測，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化效率。研究結(jié)果表明電 泳時間為120min時，既能保證良好的出苗率又能使一定外源DNA進(jìn)入種子內(nèi)部，保證了較 高的轉(zhuǎn)化效率，如圖2。2. 2本方法研究結(jié)果表明玉米種胚轉(zhuǎn)化頻率與外源DNA濃度呈二次曲線關(guān)系，近 似于正態(tài)分布，外源質(zhì)粒DNA濃度為300 μ g/mL時，Ttl代PCR陽性率與T1代轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值。3.抗性植株的篩選本方法所用的外源DNA片段含有Bar基因，因此可以使用除草劑(PPT)進(jìn)行抗性 苗的篩選，經(jīng)脈沖電泳后的種子在MS培養(yǎng)基上成苗后，并移至大田長到4葉期左右，使用 50 μ g/mL的PPT進(jìn)行噴施，使用該濃度分別篩選I；、T1代植株，既能篩選出轉(zhuǎn)化植株，又能 淘汰大部分非轉(zhuǎn)化株，降低假陽性率。4.抗性苗的分子檢測通過除草劑篩選并表現(xiàn)抗性的植株，將其葉片取回實驗室，用CTAB法進(jìn)行基因組 的提取，然后用Bar基因引物進(jìn)行PCR擴增驗證，同時以水為陰性對照，含Bar質(zhì)粒為陽性 對照。引物如下Forward Primer 5' -ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3‘Reverse Primer 5' -TCAGATCTCGGTGACGGGCAG-3‘PCR反應(yīng)條件如下
權(quán)利要求
離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于對成熟的玉米種子進(jìn)行N離子注射后，將其置于特制的瓊脂糖凝膠膠塊中進(jìn)行脈沖電泳，然后培養(yǎng)成苗的一種玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于包 括如下步驟(1)選取成熟飽滿的玉米種子，在0.1%的HgCl2中進(jìn)行消毒15min，然后用無菌水沖洗 3-5次，剝?nèi)シN胚周圍種皮；將消毒并剝皮的種子分單層、均勻排布在培養(yǎng)皿內(nèi)，種胚朝向 束流方向，進(jìn)行N離子注射處理；(2)將處理后的種子置于包埋膠中，制作支持膠，然后將包埋玉米種子的包埋膠放入 支持膠上，放入電泳槽，將要轉(zhuǎn)化的外源基因樣品注入支持膠起始位置的樣孔內(nèi)，開始電 泳；(3)電泳結(jié)束后，將玉米種子放入MS培養(yǎng)基上成苗，然后移到大田，待3-4葉期進(jìn)行除 草劑抗性篩選和PCR檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于 進(jìn)行N離子注射處理時，劑量為2X IO16 N+/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于 電泳時間為120min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種離子束輔助脈沖電泳的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對成熟的玉米種子進(jìn)行N離子注射后，將其置于特制的瓊脂糖凝膠膠塊中進(jìn)行脈沖電泳，然后培養(yǎng)成苗的一種玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)。采用本方法可以對批量的玉米種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，種子損傷小、成苗率高，大大的提高了轉(zhuǎn)化效率。本方法可以在常溫、常壓的常規(guī)實驗室進(jìn)行，不受季節(jié)限制，避免傳統(tǒng)的玉米轉(zhuǎn)基因過程中受生長季節(jié)限制的缺陷，為玉米的遺傳育種提供了一種新的轉(zhuǎn)基因方法。
文檔編號A01H5/00GK101979608SQ20101054352
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者彭曉劍, 朱蘇文, 江海洋, 程備久, 趙陽 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)