專利名稱：低能N⁺注入誘變選育靈芝菌株的方法及所選育的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及生物工程和食藥用菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及使用低能N+離子注入誘 變選育靈芝子實(shí)體高產(chǎn)菌株的方法，以及由上述方法得到的一株子實(shí)體產(chǎn)量高的誘變靈芝 菌株。
背景技術(shù)：
靈芝為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，其中目前開發(fā)應(yīng)用最廣的是赤芝，其子實(shí) 體則是進(jìn)行深加工的主要原料之一。現(xiàn)在眾多研究已經(jīng)證實(shí)靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗 缺氧、抗放射、抗化療、抗心肌缺血作用和抗衰老作用以及鎮(zhèn)靜作用、強(qiáng)心、調(diào)節(jié)血脂作用、 降血糖、平喘、保肝、等作用，廣泛應(yīng)用于臨床對(duì)各種疾病的治療之中。而產(chǎn)量高、生物性狀 優(yōu)異的靈芝菌種是保障靈芝生產(chǎn)和促進(jìn)靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的先決條件，從野外分離的靈芝菌種 大多產(chǎn)量不高，需要經(jīng)過人工馴化和不斷的選育，以提高靈芝的產(chǎn)量和生產(chǎn)性狀，因此，菌 種的選育方面的研究就顯得尤為重要了。自然選育的效率較低，而采取人工選育的方法效 果較好，經(jīng)過多年的研究實(shí)踐，以子實(shí)體產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀為主要目標(biāo)的菌種選育已從最初 的選擇育種、雜交育種發(fā)展到人工誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、以及運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù) 進(jìn)行育種等，在食用菌育種方法上推陳出新、不斷改進(jìn)，育種效率不斷提高。如山東微生物 技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2002年對(duì)原“山大1號(hào)”平菇菌株進(jìn)行紫外誘變育種獲得成功，新菌 株株型美觀，抗雜能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)潮快，生物學(xué)效率較原始菌株得到顯著提高。目前靈芝方面的 菌種選育研究開展的不多，有利用紫外誘變選育靈芝的報(bào)道，但是誘變選育效率不高，新菌 種產(chǎn)量提升不明顯，效果不顯著，本發(fā)明采用低能M離子注入誘變靈芝高產(chǎn)菌株有別于其 它誘變育種方法，提高了靈芝等食用菌菌種選育的效率。離子束作為一種應(yīng)用于生物育種的研究始于上世紀(jì)80年代，離子束具有質(zhì)量、能 量雙重誘變效應(yīng)的特征，不同于以往的射線輻射，離子注入引發(fā)的生物效應(yīng)，既有能量沉 積、動(dòng)量傳遞，又有元素質(zhì)量沉積，首先有能量沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列 碰撞，生物大分子獲得能量時(shí)，生物基因鍵斷裂，DNA分子擊出原為，留下斷鍵或缺陷，注入 元素有一定幾率同基因斷鍵或DNA被打出的缺位相結(jié)合，伴隨各種元素的生化反應(yīng)，產(chǎn)生 基因突變和染色體變異；注入離子和靶細(xì)胞的電荷交換，可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞 膜透性和膜電位的改良；離子束打入生物體產(chǎn)生Braag峰，具有較強(qiáng)的電離作用，還能產(chǎn)生 活性較高的自由基間接損傷作用，因此它對(duì)生物體的作用可導(dǎo)致較高的突變率，另外由于 注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量組合，提供了眾多誘變條件，通過這種電、能、質(zhì) 的聯(lián)合作用，強(qiáng)烈影響生物細(xì)胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較 高的突變率，較廣的突變譜，突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復(fù)突變率低。目前尚未見到有關(guān)采用低能N+離子注入技術(shù)誘變靈芝菌株的任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可選育出高產(chǎn)菌株的低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法及所選育的菌株。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是—種低能N+離子注入技術(shù)誘變靈芝子實(shí)體菌株，其特征是保藏編號(hào)為CGMCC No. 4191 ；分類命名靈芝，拉丁文學(xué)名ducidum，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2010年10月9日。一種低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法，其特征是依次包括下列步驟(1)篩選要誘變的靈芝出發(fā)菌株選擇多種不同的靈芝生產(chǎn)菌種，進(jìn)行靈芝栽培， 挑選靈芝子實(shí)體產(chǎn)量最高的靈芝菌株作為誘變的出發(fā)菌株；(2)選擇靈芝孢子作為低能N+離子注入誘變的材料收集出發(fā)菌株的新鮮靈芝孢 子粉，用氯胺τ溶液處理，再用無菌水洗滌稀釋成孢子懸液，涂布于培養(yǎng)皿中進(jìn)行N+離子注 入誘變；(3)N+離子注入誘變對(duì)步驟(2)涂布于培養(yǎng)皿中的材料進(jìn)行N+離子注入誘變，然 后用無菌水洗脫，涂布于PDA平面培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(4)誘變菌株的篩選誘變菌株的篩選將經(jīng)離子束注入后的平板用無菌水洗脫， 涂布于PDA平板上，待菌落長成后，挑選菌絲粗壯濃密、生長較快的菌絲進(jìn)行液體發(fā)酵試 驗(yàn)，然后進(jìn)行菌絲生物量的測(cè)定，并選擇生物量高于出發(fā)菌株5%重量以上的菌株保存于試 管中作為初篩的誘變菌種；然后將經(jīng)過初篩后的菌種與出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行靈芝栽培試驗(yàn)， 選擇生物轉(zhuǎn)化率高于對(duì)照菌株5%以上的菌株作為誘變的高產(chǎn)菌株；(5)遺傳性狀穩(wěn)定性驗(yàn)證將上述誘變篩選后的菌株連續(xù)傳代20代，然后進(jìn)行栽 培試驗(yàn)，產(chǎn)量穩(wěn)定、性狀無變化的最終確定為用于生產(chǎn)上的新的誘變靈芝子實(shí)體菌株。所述的N+離子注入條件為注入能量為20KeV，注入劑量為1. 25 X 1016iOnS/cm2，靶 室真空度為10_3Pa，以5s脈沖式注入，間隔為15s。PDA 培養(yǎng)基的為馬鈴薯 200g 煮汁，葡萄糖 20g，KH2PO4 10g，MgS045g，H20 1000ml ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20g，玉米粉20g，豆餅粉20g，KH2PO4 IOgjMgSO4 5g，VB1 IOOmg, H2O 1000ml。步驟(1)所述的多種不同的靈芝生產(chǎn)菌種中包含有美國大靈芝，并選擇美國大靈 芝作為誘變的出發(fā)菌株。一種低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法所選育的菌株，其特征是保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4191 ；分類命名靈芝，拉丁文學(xué)名=Iucidum,保藏單位中國微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2010年10
月9日。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果是1、以往靈芝等食用菌菌種的育種通常采用雜交育種和紫外誘變育種等手段進(jìn)行， 有誘變效率低、易導(dǎo)致負(fù)突變、遺傳性狀不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，而通過采用離子注入技術(shù)誘變靈芝 等食用菌孢子來進(jìn)行菌株的選育，提高了誘變的效率和正突變的機(jī)率，并且誘變后的靈芝 菌株不易發(fā)生退化。采用本發(fā)明誘變出一株子實(shí)體產(chǎn)量高于原菌株的靈芝誘變菌株，提高 了靈芝的產(chǎn)量，可以創(chuàng)造了很好的經(jīng)濟(jì)效益。2、本發(fā)明利用N+離子注入技術(shù)對(duì)靈芝孢子進(jìn)行誘變，并經(jīng)不同劑量的N+離子注入 后，在最適劑量1.25X1016ions/cm2下，篩選到一株遺傳性狀穩(wěn)定的靈芝子實(shí)體高產(chǎn)菌株，其子實(shí)體產(chǎn)量指標(biāo)比出發(fā)菌株提高了 15.9%，子實(shí)體多糖和三萜含量分別比出發(fā)菌株高 6.41%, 19. 99%。。結(jié)果表明，離子注入技術(shù)能夠應(yīng)用于靈芝高產(chǎn)菌株的誘變選育中，并且 具有較高的突變率和較寬的突變譜，誘變效果好，是一種比較理想的食用菌菌種選育方法。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。低能N+離子注入技術(shù)誘變靈芝子實(shí)體菌株，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4191 ；分類命 名靈芝，拉丁文學(xué)名Kanoderma Iucidum，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2010年10月9日。
具體實(shí)施例方式一種低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法，其步驟是1、出發(fā)菌株的篩選從國內(nèi)各省靈芝主產(chǎn)區(qū)引進(jìn)不同品種的靈芝菌種(包括美國大靈芝、泰山靈芝、 韓國靈芝、信州靈芝、惠州靈芝、日本紅芝、日本平芝、京大靈芝、甜芝、G-Fl、G-F2、G-902、韓 國紅芝等)。接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28°C避光培養(yǎng)7天進(jìn)行活化。將活化的菌株接種于 裝有PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿的中央，記錄靈芝菌絲萌發(fā)的時(shí)間，測(cè)定其生長速度，觀察菌絲的 形態(tài)(菌絲粗細(xì)、濃密)。接著進(jìn)行靈芝液體發(fā)酵試驗(yàn)，斜面菌種接種至液體培養(yǎng)基中(培 養(yǎng)基配方見下)，140轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)式搖床28°C避光培養(yǎng)7天，然后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，140 轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)式搖床28°C避光培養(yǎng)3天，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集菌絲體，65°C烘干至恒 重，測(cè)定其質(zhì)量得靈芝液體發(fā)酵生物量。同時(shí)進(jìn)行靈芝的栽培，其具體的過程為將靈芝的斜面菌種接種于靈芝液體培養(yǎng) 基中(液體培養(yǎng)基配方見下)，140轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)式搖床，28°C避光培養(yǎng)7天，以2%的接種量 接種于滅菌后的靈芝固體培養(yǎng)基，26°C避光培養(yǎng)約40天左右，待菌絲長滿菌袋后，搬至出 菇房進(jìn)行出菇管理，空氣相對(duì)濕度85% 95%，溫度30°C，散射光處理，經(jīng)常通風(fēng)換氣，菌 絲形成原基，分化形成子實(shí)體，等靈芝子實(shí)體菌蓋邊緣由白轉(zhuǎn)黃時(shí)，用牛皮紙袋套于靈芝子 實(shí)體上收集靈芝孢子粉。同時(shí)進(jìn)行管理，待靈芝子實(shí)體完全成熟時(shí)采收，統(tǒng)計(jì)靈芝的產(chǎn)量， 計(jì)算靈芝的生物轉(zhuǎn)化率，以靈芝子實(shí)體產(chǎn)量最高，生物轉(zhuǎn)化率最高者作為靈芝出發(fā)菌株。同 時(shí)通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，靈芝子實(shí)體的產(chǎn)量與靈芝菌絲在PDA平面培養(yǎng)基上的形態(tài)以及液體發(fā)酵 生物量的大小有相關(guān)性。在PDA平面上菌絲粗壯濃密且生長速度快、液體發(fā)酵生物量越大 者其靈芝子實(shí)體產(chǎn)量高。試驗(yàn)最后確定以美國大靈芝作為誘變的出發(fā)菌株。2、低能N+離子注入誘變(1)樣品前處理取0. 02克出發(fā)菌株的孢子粉，用5%的氯胺T溶液浸泡5ml處理 5分鐘，4000r/min離心，然后用無菌水洗滌離心3次，定容至10ml，稀釋制成濃度為IO4級(jí) 的孢子懸液。取0. Iml涂布于培養(yǎng)皿中，無菌風(fēng)風(fēng)干經(jīng)鏡檢無孢子重疊后立即進(jìn)行低能N+ 離子注入。(2)離子注入條件注入能量為20KeV，注入劑量為0、25、50、100、125、150、175、 200、250X 1014ions/cm2，靶室真空度為10_3Pa，以5s脈沖式注入，間隔為15s。計(jì)算其在各 劑量下的存活率曲線。其結(jié)果見


圖1。
圖1顯示，隨著注入劑量的增加，存活量呈現(xiàn)先降低、 后升高再降低的“馬鞍型”變化趨勢(shì)?？赡苁怯捎诘蛣┝侩x子注入細(xì)胞的射程較短，離子只 對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行損傷和刻蝕，因而存活率較高；隨著劑量的增加，細(xì)胞表面的刻蝕嚴(yán)重，離子損及細(xì)胞內(nèi)部并產(chǎn)生大量的自由基和軟射線等，致使存活率急劇下降；但下降到一定值 時(shí)出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，當(dāng)劑量累積到一定值時(shí)，細(xì)胞某種修復(fù)機(jī)制被激活，存活率有所回升；當(dāng) 劑量繼續(xù)增加時(shí)，細(xì)胞孫損傷將無法修復(fù)。(3)樣品的后處理將經(jīng)過N+離子注入的培養(yǎng)皿和真空對(duì)照的培養(yǎng)皿用Iml無菌 水洗脫，取0. Iml涂布于PDA平板上，28°C避光培養(yǎng)72h后計(jì)數(shù)，以計(jì)算存活量。存活量為 經(jīng)N+離子注入處理的存貨菌落數(shù)。然后以注入劑量為橫坐標(biāo)，存活量為縱坐標(biāo)，繪制存活 量與注入劑量的關(guān)系曲線。3、子實(shí)體高產(chǎn)菌株的篩選(1)初篩將經(jīng)離子束注入后的平板用無菌水洗脫，取0. Iml涂布于PDA平板上， 待菌落長成后，挑選菌絲粗壯濃密、生長較快的菌絲進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，然后進(jìn)行菌絲生物 量的測(cè)定，并選擇生物量高于出發(fā)菌株5%重量以上的菌株保存于試管中作為初篩的誘變 菌種(2)復(fù)篩將經(jīng)過初篩后的菌種與出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行靈芝栽培試驗(yàn)，方法參見1， 計(jì)算靈芝菌株的生物轉(zhuǎn)化率，選擇生物轉(zhuǎn)化率高于對(duì)照菌株5%以上的菌株作為誘變的高 產(chǎn)菌株。4、N+離子注入對(duì)菌株突變率的影響以出發(fā)菌株作為對(duì)照，隨機(jī)挑取接受離子注入誘變后形成的菌落分別進(jìn)行液體 發(fā)酵試驗(yàn)，每個(gè)劑量挑取20個(gè)菌株，考察菌株的生物量。高于對(duì)照5%以上的為正突變， 低于對(duì)照5%以上的為負(fù)突變，正突變的菌落數(shù)占所取菌落總數(shù)的比值為正突變率，負(fù)突 變的菌落數(shù)占所取菌落總數(shù)的比值為負(fù)突變率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在劑量1. OX 1016ionS. cm_2 1. 5 X 1016ions. cm_2之內(nèi)正突變率較高，在劑量1. 25 X 1016ions. cm"2,正突變率最高，因此選 取劑量1. 25 X 1016ions. cm_2作為離子注入誘變的最適劑量。結(jié)果見表1。表1 N+離子注入劑量對(duì)靈芝菌株突變率的影響
效果025離子注入劑量(X10'4ions/cm2) 50 100 125 150 175200250突變率(％)012.3428.5634.4257.3468.2343.2324.1520.27正突變率(％)04.2512.3416.4624.2317.2413.169.736.155、遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證1、將誘變篩選后得到的菌株進(jìn)行20次傳代，然后再進(jìn)行靈芝栽培試驗(yàn)，與第一代 比較，選擇子實(shí)體產(chǎn)量穩(wěn)定(即各代菌株的產(chǎn)量之間不存在顯著性差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差 P > 0. 05)、性狀無變化的作為最終的靈芝誘變高產(chǎn)菌株。最終篩選到一株子實(shí)體高產(chǎn)靈芝 誘變菌株，比原菌株產(chǎn)量高15. 9%，遺傳性狀穩(wěn)定，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4191。培養(yǎng)基配方PDA 培養(yǎng)基馬鈴薯 200g 煮汁，葡萄糖 20g，KH2PO4 10g, MgSO4 5g，H2OlOOOml。液體培養(yǎng)基葡萄糖20g，玉米粉20g，豆餅粉20g，KH2PO4 10g, MgSO4 5g，Vbi IOOmg, H2O 1000ml。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g，玉米粉20g，豆餅粉20g，KH2PO4 10g, MgSO4 5g，Vbi IOOmg, H2O 1000ml。固體栽培培養(yǎng)基麩皮15%、蔗糖^、石膏粉！^水分微量(水分的含量以用手 用力擠壓可擠出1 2滴為宜)，余量(約83% )為棉籽殼。
權(quán)利要求
1.一種低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法，其特征是依次包括下列步驟(1)篩選要誘變的靈芝出發(fā)菌株選擇多種不同的靈芝生產(chǎn)菌種，進(jìn)行靈芝栽培，挑選 靈芝子實(shí)體產(chǎn)量最高的靈芝菌株作為誘變的出發(fā)菌株；(2)選擇靈芝孢子作為低能N+離子注入誘變的材料收集出發(fā)菌株的新鮮靈芝孢子 粉，用氯胺T溶液處理，再用無菌水洗滌稀釋成孢子懸液，涂布于培養(yǎng)皿中進(jìn)行N+離子注入 誘變；(3)N+離子注入誘變對(duì)步驟(2)涂布于培養(yǎng)皿中的材料進(jìn)行N+離子注入誘變，然后用 無菌水洗脫，涂布于PDA平面培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(4)誘變菌株的篩選將經(jīng)離子束注入后的平板用無菌水洗脫，涂布于PDA平板上，待 菌落長成后，挑選菌絲粗壯濃密、生長較快的菌絲進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，然后進(jìn)行菌絲生物量 的測(cè)定，并選擇生物量高于出發(fā)菌株5%重量以上的菌株保存于試管中作為初篩的誘變菌 種；然后將經(jīng)過初篩后的菌種與出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行靈芝栽培試驗(yàn)，選擇生物轉(zhuǎn)化率高于對(duì) 照菌株5%以上的菌株作為誘變的高產(chǎn)菌株；(5)遺傳性狀穩(wěn)定性驗(yàn)證將上述誘變篩選后的高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代20代，然后進(jìn)行栽 培試驗(yàn)，產(chǎn)量穩(wěn)定、性狀無變化的最終確定為用于生產(chǎn)上的新的誘變靈芝子實(shí)體菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法，其特征是所述的N+ 離子注入條件為注入能量為20KeV，注入劑量為1. 25X1016ions/cm2，靶室真空度為10_3Pa， 以&脈沖式注入，間隔為15s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法，其特征是PDA 培養(yǎng)基的為馬鈴薯200g煮汁，葡萄糖20g, KH2PO4IOg, MgSO4 5g，H2O 1000ml ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20g,玉米粉20g，豆餅粉20g, KH2PO4 10g, MgSO4 5g，Vbi IOOmg, H2O 1000ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法，其特征是步驟 (1)所述的多種不同的靈芝生產(chǎn)菌種中包含有美國大靈芝，并選擇美國大靈芝作為誘變的 出發(fā)菌株。
5.一種低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法所選育的菌株，其特征是保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4191。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低能N+注入誘變選育靈芝菌株的方法及所選育的菌株，菌株保藏編號(hào)為CGMCC No.4191；其誘變選育步驟包括收集原靈芝孢子粉制成懸液，涂布于培養(yǎng)皿中，風(fēng)干，以一定的劑量對(duì)材料進(jìn)行N+離子注入誘變，將誘變后的孢子制成懸液，涂布于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，靈芝孢子萌發(fā)后形成菌落，對(duì)其進(jìn)行篩選培養(yǎng)和靈芝栽培試驗(yàn)，最后得到一株新靈芝菌株，子實(shí)體產(chǎn)量高于原菌株15.9％，子實(shí)體多糖和三萜含量分別比出發(fā)菌株高6.41％、19.99％。
文檔編號(hào)A01H1/06GK102067788SQ20101055077
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者全衛(wèi)豐, 劉廣建, 曹昌貴, 李穎穎, 汪潔, 王紅連, 瞿衛(wèi)林, 薛璟, 謝瑀婷, 鄭惠華 申請(qǐng)人:江蘇安惠生物科技有限公司, 江蘇省蘇微微生物研究有限公司