專利名稱：一種有效降低轉(zhuǎn)基因植物通過花粉介導(dǎo)基因漂移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種終止轉(zhuǎn)基因植物通過花粉將外源基因傳遞給其它植物的方法， 從而有效降低了轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著轉(zhuǎn)基因植物種類和種植面積的迅猛增加，轉(zhuǎn)基因生物的大規(guī)模環(huán)境釋放及其可能帶來的環(huán)境生物安全問題已經(jīng)日益成為目前全球最受關(guān)注和爭(zhēng)議的領(lǐng)域之一。轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因通過基因漂移(或天然雜交)轉(zhuǎn)移到環(huán)境中的非轉(zhuǎn)基因品種或其野生近緣種(包括雜草種類)中，并通過遺傳漸滲在野生近緣種的群體中存留或進(jìn)一步擴(kuò)散，從而帶來環(huán)境生物安全問題?；ǚ劢閷?dǎo)的基因漂移廣泛存在于具有雜交親和性的植物種類之間，包括同一物種不同群體和不同物種之間的基因漂移。與其它形式的基因漂移(如種子介導(dǎo)的基因漂移)相比，花粉介導(dǎo)的基因漂移由于可以借助風(fēng)力和昆蟲進(jìn)行，因而是最不容易避免的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些降低花粉中外源基因擴(kuò)散的方法，常見的如葉綠體轉(zhuǎn)化、花粉中外源基因的去除等。大多數(shù)植物的葉綠體是母性遺傳的，如果外源基因整合到葉綠體基因組上，就不能通過花粉向其它植物擴(kuò)散，因此可以避免外源基因的擴(kuò)散。然而葉綠體轉(zhuǎn)化只在少數(shù)植物中利用基因槍法獲得了成功。另外，葉綠體轉(zhuǎn)化載體包含有葉綠體同源片段，以保證外源基因的定點(diǎn)組合，而大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚，因此，無法確定用于載體構(gòu)建的同源片段和外源基因插入位點(diǎn)，對(duì)未知序列葉綠體基因組只能通過保守序列來完成。另外一個(gè)關(guān)鍵的問題是，大多數(shù)植物細(xì)胞含有10-100個(gè)葉綠體，每個(gè)葉綠體又含有高達(dá)100 個(gè)質(zhì)體基因組拷貝，而只有少數(shù)的質(zhì)體基因組能夠轉(zhuǎn)化成功，使外源基因完全整合到葉綠體每個(gè)DNA拷貝中需要有效的組織培養(yǎng)方法以及篩選技術(shù)，而對(duì)于大多數(shù)單子葉植物來說目前還沒有建立起來有效的轉(zhuǎn)化和篩選系統(tǒng)。特異位點(diǎn)重組(如Cre/loxP系統(tǒng)、FLP/FRTs系統(tǒng)和鋅指核酸酶(ZFNs)系統(tǒng))是將花粉中外源基因剪切掉的方法。在這類體系中，花粉特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位點(diǎn)特異重組酶將其識(shí)別位點(diǎn)旁側(cè)的轉(zhuǎn)基因元件準(zhǔn)確切除，而不影響花粉的正常生成和功能，但是這種方法的效率較低。最新發(fā)展的loxP/FRTs系統(tǒng)可以被Cre或FLP任何一種重組酶識(shí)別，相比Cre/ IoxP和FLP/FRTs，具有更高的效率(Luo，K. et al.，2007)，但是這一技術(shù)目前只在煙草中得到了驗(yàn)證。雄性不育是另外一種廣泛應(yīng)用于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物中避免花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因漂移的方法。Mariani等利用Barnases基因創(chuàng)造了煙草和油菜的雄性不育系，雄性不育株系做母本，野生型株系做父本，獲得的雜交種借助Barstar基因恢復(fù)育性。然而，其負(fù)效應(yīng)表現(xiàn)在，與對(duì)照相比，以花粉為食物的昆蟲如油菜花露尾甲長(zhǎng)成成蟲的數(shù)量明顯減少。而且，有證據(jù)表明，barnase對(duì)動(dòng)物和人類細(xì)胞具有毒性，因此需要植物特異表達(dá)barnase的部位不是被食用的部分。另外，Barnase在應(yīng)用方面還存在著很多問題，例如雄性不育性狀具有溫度敏感性，容易受環(huán)境影響而不穩(wěn)定、即使在花粉特異啟動(dòng)子下，barnase的毒性也有可能會(huì)泄露表達(dá)在植物體其它部位，從而引起各種重要農(nóng)藝性狀的變化、barnase在后代分離中存在不穩(wěn)定性等。因此，這種方法也不是理想的控制轉(zhuǎn)基因漂移的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種有效阻止轉(zhuǎn)基因植物通過花粉傳播至其它水稻品種、野生近緣種、野草以及其它植物的方法。此方法的核心技術(shù)是利用花粉形成后期特異啟動(dòng)子PG47驅(qū)動(dòng)花粉致死基因ZM-AA1，將攜帶有轉(zhuǎn)基因的花粉殺死，而不帶轉(zhuǎn)基因的花粉仍然能夠正常發(fā)揮功能。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)帶有轉(zhuǎn)基因的花粉粒因?yàn)閿y帶有一個(gè)植物來源的糖代謝基因而完全失活，效率高達(dá)100%，降低了由花粉介導(dǎo)的基因漂移造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)；2)花粉致死基因由花粉發(fā)育后期特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，對(duì)另外一半不攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒的形成和功能完全無影響；3)外源基因可以通過雌配子傳遞。本發(fā)明通過以下方案來實(shí)現(xiàn)首先構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，將花粉致死基因置于花粉發(fā)育后期特異性啟動(dòng)子PG47下游，紅色熒光蛋白所基因置于愈傷組織和種皮特異性啟動(dòng)子END2下游，兩個(gè)基因表達(dá)盒緊密連鎖；然后利用野生型水稻品種中花11幼胚或成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將外源基因?qū)耄皇荏w細(xì)胞在共培養(yǎng)后的30天內(nèi)利用熒光顯微鏡進(jìn)行三次篩選，將穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的愈傷組織分化成幼苗；對(duì)轉(zhuǎn)化幼苗進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和花粉活性鑒定。本發(fā)明依次通過以下步驟來實(shí)現(xiàn)
1)載體構(gòu)建將花粉致死基因連接于花粉發(fā)育后期特異性啟動(dòng)子下游，使表達(dá)該融合基因的花粉敗育。將篩選標(biāo)記基因融合于愈傷組織和種皮特異性啟動(dòng)子下游，從而可以對(duì)轉(zhuǎn)化個(gè)體的愈傷組織和種皮進(jìn)行篩選。將二者緊密連鎖構(gòu)建于表達(dá)載體的T-DNA區(qū)。2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻，通過篩選標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選， 進(jìn)而分化成再生植株。3)分子生物學(xué)檢測(cè)利用PCR，Southern blot方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選及鑒定。4)花粉致死能力的測(cè)定采用I2-KI染色法，觀察轉(zhuǎn)基因植株上的花粉類型并判斷其育性。5)利用X2-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株自交所結(jié)種子種熒光種子(轉(zhuǎn)基因種子)與非熒光種子(非轉(zhuǎn)基因種子)的比例是否附合1:1。


圖1顯示了實(shí)施例1中植物表達(dá)載體PSPT05結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了實(shí)施例2中經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后表達(dá)紅色熒光蛋白的水稻愈傷組織。圖3顯示了實(shí)施例2中經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后獲得的再生水稻植株。圖4顯示了實(shí)施例3中部分植株的PCR鑒定(M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；負(fù)/陰性對(duì)照；+ :正/陽(yáng)性對(duì)照)。圖5顯示了實(shí)施例4中部分轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot鑒定(N 陰性對(duì)照，M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照)。 圖6顯示了實(shí)施例5中花粉I2-KI染色后的花粉粒。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖具體描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不限于此。本發(fā)明實(shí)施例中具體涉及兩個(gè)基因，和RP。ZM-AAl編碼淀粉酶，在花粉發(fā)育后期特異性啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，它可在成熟花粉后期表達(dá)出淀粉酶，從而降解花粉粒中的淀粉，最終使花粉敗育，其核苷酸序列及氨基酸序列分別見SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ； ^基因用作篩選標(biāo)記基因，來源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，它可編碼紅色熒光蛋白，可被激發(fā)出紅色熒光，便于轉(zhuǎn)基因的愈傷組織和種子的篩選，其核苷酸序列及氨基酸序列分別見 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID N0. 4。實(shí)施例1 構(gòu)建表達(dá)載體
本發(fā)明中轉(zhuǎn)化所使用表達(dá)載體名稱為PSPT05 (附圖1)。該載體是在pPZP基礎(chǔ)上人工構(gòu)建而來。表達(dá)載體上有2個(gè)基因表達(dá)盒:Z￥-AAJ基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒由來自玉米的花粉發(fā)育后期特異性啟動(dòng)子PG47驅(qū)動(dòng)(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 5)，并由來自玉米的終止子IN2-1終止轉(zhuǎn)錄(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 6)，另外轉(zhuǎn)運(yùn)肽ZM-BTl融合于ZM-AAl基因與PG47啟動(dòng)子之間，ZM-BTl的核苷酸序列見SEQ ID N0. 7，報(bào)告/篩選標(biāo)記基因RP基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒由來自玉米的愈傷組織和種子特異性啟動(dòng)子END2驅(qū)動(dòng)(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 8)，并由來自馬鈴薯的終止子PIN II終止轉(zhuǎn)錄，PIN II的苷酸序列見SEQ ID N0. 9。T-DNA區(qū)段內(nèi)不含抗生素抗性標(biāo)記基因，也不含除草劑篩選標(biāo)記基因。實(shí)施例2 獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株
將實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化載體用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株AGLO中，用于轉(zhuǎn)化野生型中花11誘導(dǎo)的愈傷組織。利用紅色熒光蛋白對(duì)轉(zhuǎn)化愈傷組織進(jìn)行篩選，附圖2為表達(dá)外源基因的愈傷組織，進(jìn)一步將其分化再生出表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化植株(附圖3)。實(shí)施例3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)
取實(shí)施例2中的轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以/ 基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，對(duì)Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物片段為789bp。擴(kuò)增程序?yàn)?940C IOmin ；94°C lmin，60°C lmin, 72°C Imin ；37 循環(huán)；72°C IOmin0 正向引物序列為 5，-GGACTTGAACTCCACCAGG-3，；反向引物序列為5，-ATAATGCCAATACGACACC-3，。附圖 4 為部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果，說明外源基因已整合至水稻受體基因組中。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blot檢測(cè)
對(duì)Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA進(jìn)行Southern Blot檢測(cè)，以鑒定外源基因在水稻轉(zhuǎn)化受體中的整合情況。取實(shí)施例2中Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以/^基因序列中的M6bp核苷酸片段為探針，選用NEB公司的Ih I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為 200ul 基因組 DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、損a I 4ul (20U/ul)并用無離子水將體系補(bǔ)足至200 uL· 37°C溫育6小時(shí)。附圖5為部分轉(zhuǎn)基因植株Southern Blot檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，外源基因已整合至受體水稻基因組中。實(shí)施例5 花粉致死能力的測(cè)定
采用I2-KI染色法，觀察轉(zhuǎn)基因水稻花粉的形態(tài)并判斷其育性(附圖6)。共調(diào)查了花粉1995粒，正?？捎ǚ蹫?015粒(50. 8%)，不育花粉為980粒2%)。對(duì)二者是否符合 1:1分離規(guī)律進(jìn)行了 X2-檢驗(yàn)(自由度為1)。X2值為0.614，遠(yuǎn)低于顯著水平0.05時(shí)的臨界值3. 814，證明二者比例在P < 0. 05水平符合1:1。因此認(rèn)為基因殺花粉功能徹底。
序列表
〈110〉北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司
北京凱拓迪恩生物技術(shù)研發(fā)中心有限責(zé)任公司 〈120〉一種有效降低轉(zhuǎn)基因植物通過花粉介導(dǎo)基因漂移的方法 〈160〉 9
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 1 〈211〉 1561 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 1
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc240
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tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg360
ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac420
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<210> 2 <211> 519 <212> PRT
<213> 玉米(Zea mays) <400> 2
Met Ala Ala Thr Met Ala Val Thr Thr Met Val Thr Arg Ser Lys Glu 151015
Ser Trp Ser Ser Leu Gln Val Pro Ala Val Ala Phe Pro Trp Lys Pro
202530
Arg Gly Gly Lys Thr Gly Gly Leu Glu Phe Pro Arg Arg Ala Met Phe
354045
Ala Ser Val Gly Leu Asn Val Cys Pro Gly Val Pro Ala Gly Arg Asp
505560
Pro Arg Glu Pro Asp Pro Lys Val Val Arg Ala Ala Cys Gly Leu Val 65707580
Gln Ala Gln Val Leu Phe Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Cys Lys Gln
859095
Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Lys Ala Gln Val Asp Asp lie Ala
100105110
Lys Ala Gly Val Thr His Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val
115120125
Ser Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser
130135140
Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Glu Leu Lys Ser Leu lie Ala Ala Phe His 145150155160
Gly Arg Gly Val Gln Cys Val Ala Asp lie Val lie Asn His Arg Cys
165170175
Ala Glu Lys Lys Asp Ala Arg Gly Val Tyr Cys lie Phe Glu Gly Gly
180185190
Thr Pro Asp Asp Arg Leu Asp Trp Gly Pro Gly Met lie Cys Ser Asp
195200205
Asp Thr Gln Tyr Ser Asp Gly Thr Gly His Arg Asp Thr Gly Glu Gly
210215220
Phe Ala Ala Ala Pro Asp lie Asp His Leu Asn Pro Arg Val Gln Arg 225230235240
Glu Leu Ser Ala Trp Leu Asn Trp Leu Arg Ser Asp Ala Val Gly Phe245250255
Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Pro Ala Val Ala
260265270
Arg Met Tyr Val Glu Ser Thr Gly Pro Pro Ser Phe Val Val Ala Glu
275280285
lie Trp Asn Ser Leu Ser Tyr Ser Gly Asp Gly Lys Pro Ala Pro Asn
290295300
Gln Asp Gln Cys Arg Gln Glu Leu Leu Asp Trp Thr Arg Ala Val Gly 305310315320
Gly Pro Ala Met Ala Phe Asp Phe Pro Thr Lys Gly Leu Leu Gln Ala
325330335
Gly Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asn Ala
340345350
Ala Gly Leu lie Gly Trp Ala Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Asp
355360365
Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Gln Lys Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp
370375380
Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala Tyr lie Leu Thr His Pro Gly Val Pro 385390395400
Cys lie Phe Tyr Asp His Met Phe Asp Trp Asn Leu Lys Gln Glu lie
405410415
Ser Thr Leu Ser Ala lie Arg Ala Arg Asn Gly lie Arg Ala Gly Ser
420425430
Lys Leu Arg lie Leu Val Ala Asp Ala Asp Ala Tyr Val Ala Val Val
435440445
Asp Glu Lys Val Met Val Lys lie Gly Thr Arg Tyr Gly Val Ser Ser
450455460
Val Val Pro Ser Asp Phe His Pro Ala Ala His Gly Lys Asp Tyr Cys 465470475480
Val Trp Glu Lys Ala Ser Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His Leu Gln
485490495
Leu Arg Leu Leu Ser Leu Val Leu His Cys Lys His Ser Ser Thr Thr
500505510
Leu His Asn Val Phe Ser Leu 515
<210> 3 <211> 678 <212> DNA <213>人工合成<400> 3
atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60 accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120 cacaacaccg tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180 ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240 gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300 gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360 aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420 atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480 acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540 tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600 atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660 caccacctgt tcctgtag678
<210> 4 <211> 225 <212> PRT <213>人工合成 <400> 4
Met Ala Ser Ser Glu Asn Val lie Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val 151015
Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu lie Glu Gly Glu
202530
Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val
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Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp lie Leu Ser Pro Gln
505560
Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp lie Pro 65707580
Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val
859095
Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser
100105110
Leu Gln Asp Gly Cys Phe lie Tyr Lys Val Lys Phe lie Gly Val Asn
115120125
Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu
130135140
Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu 145150155160
Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu165170175
Phe Lys Ser lie Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr
180185190
Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp lie Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr
195200205
Thr lie Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe 210215220
Leu 225
<210> 5 <211> 2771 <212> DNA
<213> 玉米(Zea mays) <400> 5
agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatctgcacc ggacactgtc tggtggcata 60 ccagacagtc cggtgtgcca gatcagggca cccttcggtt cctttgctcc tttgcttttg 120 aaccctaact ttgatcgttt attggtttgt gttgaacctt tatgcacctg tggaatatat 180 aatctagaac aaactagtta gtccaatcat ttgtgttggg cattcaacca ccaaaattat 240 ttataggaaa aggttaaacc ttatttccct ttcaatctcc ccctttttgg tgattgatgc 300 CSLSLCSLCSLSLSLC caaagaaaat atataagtgc agaattgaac tagtttgcat aaggtaagtg 360 cataggttac ttagaattaa atcaatttat acttttactt gatatgcatg gttgctttct 420 tttattttaa cattttggac cacatttgca ccacttgttt tgttttttgc aaatcttttt 480 ggaaattctt tttcaaagtc ttttgcaaat agtcaaaggt atatgaataa gattgtaaga 540 agcattttca agatttgaaa tttctccccc tgtttcaaat gcttttcctt tgactaaaca 600 aaactccccc tgaataaaat tctcctctta gctttcaaga gggttttaaa tagatatcaa 660 ttggaaatat atttagatgc taattttgaa aatataccaa ttgaaaatca acataccaat 了20 ttgaaattaa acataccaat ttaaaaaatt tcaaaaagtg gtggtgcggt ccttttgctt 780 tgggcttaat atttctcccc ctttggcatt aatcgccaaa aacggagact ttgtgagcca 840 tttatacttt ctccccattg gtaaatgaaa tatgagtgaa agattatacc aaatttggac 900 agtgatgcgg agtgacggcg aaggataaac gataccgtta gagtggagtg gaagccttgt 960 cttcgccgaa gactccattt ccctttcaat ctacgactta gcatagaaat acacttgaaa 1020 acacattagt cgtagccacg aaagagatat gatcaaaggt atacaaatga gctatgtgtg 1080 taatgtttca atcaaagttt cgagaatcaa gaatatttag ctcattccta agtttgctaa 1140 aggttttatc atctaatggt ttggtaaaga tatcgactaa ttgttctttg gtgctaacat 1200 aagcaatctc gatatcaccc ctttgttggt gatccctcaa aaagtgatac cgaatgtcta 1260 tgtgcttagt gcggctgtgt tcaacgggat tatccgccat gcagatagca ctctcattgt 1320 cacataggag agggactttg ctcaatttgt agccatagtc cctaaggttt tgcctcatcc 1380 aaagtaattg C 3. C 3. C 3.3. C 3.3. tgtcctgcgg caatatactt ggcttcggcg gtagaaagag 1440 ctattgagtt ttgtttcttt gaagtccaag acaccaggga tctccctaga aactgacaag 1500tccctgatgt gctcttccta tcaattttac accctgccca atcggcatct gaatatccta1560
ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat1620
atctcatgat tcttttcacg gccctaaggt gaacttcctt aggatcggct tggaatcttg1680
cacacatgca tatagaaagc atactatctg gtcgagatgc acataaatag agtaaagatc1740
ctatcatcga ccggtatacc ttttggtcta cggatttacc tcccgtgtcg aggtcgagat1800
gcccattagt tcccatgggt gtcctgatgg gcttggcatc cttcattcca aacttgttga1860
gtatgtcttg aatgtacttt gtttggctga tgaaggtgcc atcttggagt tgcttgactt1920
gaaatcctag aaaatatttc aacttcccca tcatagacat ctcgaatttc ggaatcatga1980
tcctactaaa ctcttcacaa gtagatttgt tagtagaccc aaatataata tcatcaacat2040
aaatttggca tacaaacaaa acttttgaaa tggttttagt aaagagagta ggatcggctt2100
tactgactct gaagccatta gtgataagaa aatctcttag gcattcatac catgctgttg2160
gggcttgctt gagcccataa agcgcctttg agagtttata aacatggtta gggtactcac2220
tatcttcaaa gccgagaggt tgctcaacat agacctattc accccatttg atcacttttt2280
tggtccttca ggatctaata gttatgtata atttagagtc tcttgtttaa tggccagata2340
tttctaatta atctaagaat ttatgatatt ttttaatttt ttatcatgtc tgatgagaat2400
taacataaag gctcaattgg gtcctgaatt aataatagag tgaaaattaa tccagaggct2460
ctattagaac cttcaattag taataccaag atatatataa gatagtagag tatagtttaa2520
atgttggcat tgttcattct ttcttttgtt atttaattta tgctttccac ggtggttagt2580
ggttacttct gaagggtcca aataatgcat gaagagtttg aggacaagaa gtctgcccta2640
aaaatagcga tgcaaaggca tggtgtccaa gccatacata tagcgcacta attttatcag2700
cagaacaatg gtatttatag gtcctagtgc ccaggcaaca agagacacga ataaagcatc2760
gatcacgaca c2771 〈210〉 6 〈211〉 348 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 6
gatctgacaa agcagcatta gtccgttgat cggtggaaga ccactcgtca gtgttgagtt60
gaatgtttga tcaataaaat acggcaatgc tgtaagggtt gttttttatg ccattgataa120
tacactgtac tgttcagttg ttgaactcta tttcttagcc atgccaagtg cttttcttat180
tttgaataac attacagcaa aaagttgaaa gacaaaaaaa aaaacccccg aacagagtgc240
tttgggtccc aagctacttt agactgtgtt cggcgttccc cctaaatttc tccccctata300
tctcactcac ttgtcacatc agcgttctct ttcccctata tctccacg348 〈210〉 7 〈211〉 225 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 7
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca60ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg225 〈210〉 8 〈211〉 944 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 8
gatccagctt cgcttagttt ttagtttttg gcagaaaaaa tgatcaatgt ttcacaaacc60
aaatattttt ataacttttg atgaaagaag atcaccacgg tcatatctag gggtggtaac120
aaattgcgat ctaaatgttt cttcataaaa aataaggctt cttaataaat tttagttcaa180
aataaatacg aataaagtct gattctaatc tgattcgatc cttaaatttt ataatgcaaa240
atttagagct cattaccacc tctagtcata tgtctagtct gaggtatatc caaaaagccc300
tttctctaaa ttccacaccc aactcagatg tttgcaaata aatactccga ctccaaaatg360
taggtgaagt gcaactttct ccattttata tcaacatttg ttattttttg tttaacattt420
cacactcaaa actaattaat aaaatacgtg gttgttgaac gtgcgcacat gtctccctta480
cattatgttt ttttatttat gtattattgt tgttttcctc cgaacaactt gtcaacatat540
catcattggt ctttaatatt tatgaatatg gaagcctagt tatttacact tggctacaca600
ctagttgtag ttttgccact tgtctaacat gcaactctag tagttttgcc acttgcctgg660
catgcaactc tagtattgac acttgtatag catataatgc caatacgaca cctgccttac720
atgaaacatt atttttgaca cttgtatacc atgcaacatt accattgaca tttgtccata780
cacattatat caaatatatt gagcgcatgt cacaaactcg atacaaagct ggatgaccct840
ccctcaccac atctataaaa acccgagcgc tactgtaaat cactcacaac acaacacata900
tcttttagta acctttcaat aggcgtcccc caagaactag taac944 〈210〉 9 〈211〉 318 〈212〉 DNA
〈213〉馬鈴薯{Solanum tuberosum) 〈400〉 9
agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca60
catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac120
tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac180
gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat240
aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg300
tgttttgcga atgcggcc318
權(quán)利要求
1.一種防止外源基因從轉(zhuǎn)基因植物漂移到其它植物和環(huán)境中的方法，此方法包括a)一段編碼玉米α-淀粉酶基因的核苷酸序列，所述序列連接于花粉特異性啟動(dòng)子；b)將(a)中的核苷酸序列轉(zhuǎn)化水稻；c)將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株。
2.權(quán)利要求書1中，花粉特異性啟動(dòng)子為PG47啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求書1中獲得的轉(zhuǎn)基因植株包含由花粉特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的玉米α-淀粉酶基因，并與熒光篩選標(biāo)記基因FP緊密連接。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種有效地降低轉(zhuǎn)基因植物通過花粉傳播導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的方法。本方法中，兩個(gè)緊密連鎖的基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)入中花11野生型材料，這兩個(gè)基因表達(dá)盒是，1)花粉致死基因，ZM-AA1,由花粉發(fā)育后期特異性啟動(dòng)子PG47驅(qū)動(dòng)；2)熒光篩選標(biāo)記基因FP,由愈傷組織/種皮特異性啟動(dòng)子END2驅(qū)動(dòng)。攜帶單拷貝轉(zhuǎn)基因的單株在自交結(jié)實(shí)過程中，沒有攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒能與雌配子正常受精而結(jié)實(shí)，而攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒在花粉發(fā)育后期敗育，不能與雌配子受精，從而降低了轉(zhuǎn)基因在環(huán)境中漂移的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102477443SQ20101056355
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者萬向元, 周君莉, 王海洋, 鄧興旺 申請(qǐng)人:北京凱拓迪恩生物技術(shù)研發(fā)中心有限責(zé)任公司, 北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司