專利名稱：一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法
一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及煙草組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方 法。
背景技術(shù)：
煙草(Nicotiana tabacum 1^.),屬爺科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana) —年 生草本植物。煙草是植物轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良受體和細胞遺傳學的模式植物，常被用來開展外源 基因的表達和功能驗證，同時，在生物工程領(lǐng)域被用來作為一種植物生物反應(yīng)器有效表達 一些有實用價值的蛋白如人血清蛋白、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、疫苗、抗體、工業(yè)酶、生物多聚物等， 另外，利用煙草尼古丁的神經(jīng)毒性可用來制造殺蟲劑，還可以從煙草中提取蘋果酸、檸檬酸 等物質(zhì)。煙草組織培養(yǎng)工作開展較早，主要包括花粉培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)和外植體愈傷誘導(dǎo)等， 目前，花藥培養(yǎng)成為了煙草組織培養(yǎng)的主要手段，但花藥培養(yǎng)存在花藥萌發(fā)時間偏長、加倍 效率較低、后期工作量大、花藥壁體細胞愈傷組織的干擾、后代群體遺傳同源性稍低及難以 獲得大量有突破性的育種材料等缺點，且對于花粉較少的植物難以獲得大量目標材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有煙草組織培養(yǎng)的不足，提供一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方 法，從花藥中快速大量釋放并獲取花粉，在花粉處于液體培養(yǎng)的游離狀態(tài)下用秋水仙素對 其實施加倍處理，花藥萌發(fā)時間短、加倍效率高，較好的解決花藥培養(yǎng)過程中存在的諸多問 題，為煙草作為植物生物反應(yīng)器的規(guī)?；a(chǎn)提供大量正常普通栽培種材料載體，同時為 煙草分子生物學研究尤其是數(shù)量性狀的遺傳機理剖析提供大批高質(zhì)量的雙單倍體株系作 為基礎(chǔ)試驗材料。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案由以下操作步驟構(gòu)成(1)、花蕾采取保存于晴天在煙草植株主花序或側(cè)花序上采取無病蟲、生長良好 的單核發(fā)育中晚期的適齡花蕾一株或多株，將取好的花蕾迅速用冰盒保存；O)、花藥消毒將步驟1中保存在冰盒內(nèi)的花蕾在超凈工作臺上剝?nèi)』ɡ僦谢?藥，然后將剝?nèi)〉幕ㄋ幱脽o菌紗布或無菌市售絲襪包裹浸入70-75%濃度的酒精中消毒 10-15s,快速取出立即浸入飽和Ca(Cno)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒過程中輕 輕晃動燒杯使其消毒充分，最后用無菌水沖洗多次；(3)、花粉獲取取出經(jīng)步驟2消毒好的花藥放入圓底試管中，加入l_3ml的B5花 粉提取液，輕輕碾成勻漿，倒入裝有300-400目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，并用離心管收集 濾液，向裝有濾液的離心管中加入B5花粉提取液至設(shè)定刻度，離心處理后去上清液，再加 入B5花粉提取液重新懸浮，二次離心后再去上清液；0)、花粉加倍與培養(yǎng)向步驟3中兩次離心后得到的花粉中加入含有濃度為 50-70mg/L秋水仙素的N16液體培養(yǎng)基，使其重新懸浮后分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中，密4封好后靜置于溫度為30-33°C的避光環(huán)境下培養(yǎng)48-7池，對花粉進行加倍處理；然后將加 倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到離心管，離心處理后去上清液，加入N13液體培養(yǎng)基，分裝入培養(yǎng)皿 中，再次靜置于低溫環(huán)境下暗培養(yǎng)14-21d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中裝入加倍花粉的培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見胚時，便將其 置于23-26°C恒溫搖床上，振蕩暗培養(yǎng)7-10d，并對其進行定時觀察，將達到子葉期的胚轉(zhuǎn) 入B5花粉提取液或MS固體培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，其溫度為25-27°C，每日光照8_10h ；(6)、煙苗移栽待煙苗煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時，敞開瓶口煉苗 2-3d，然后將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，便移栽到溫室的花缽中假植或者于煙 苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中。所述方法還包括染色體倍性的檢測步驟，其具體操作如下從步驟5中獲得的煙 株上采取小面積的無菌苗葉片放置在無菌試驗臺或是玻璃器皿中，向葉片滴加細胞裂解 液，之后，立即將其切碎，然后將切碎的葉片置于流式細胞儀中檢測染色體倍性；或者從步 驟5中獲得六片真葉以上的煙株上上采取葉片，取葉片的下表皮并置于載玻片上，滴入一 滴碘-碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的顯微鏡下觀 察其染色體倍性。步驟1中所述的適齡花蕾為花粉發(fā)育時期為單核靠邊期、花萼與花冠等長的花 蕾，其蕾長范圍在2. 0-2. 3cm之間。步驟2中飽和Ca(Cno)2溶液濃度為10%，其消毒時間為8-lOmin ；無菌水沖洗2_3 次，每次為3-5min。步驟3中第一次離心和步驟4中的離心時間為5-6min，轉(zhuǎn)速為1000-1100r/min， 步驟3中第二次離心時間為5-6min，轉(zhuǎn)速500_600r/min。步驟4選用直徑為7. 5cm的培養(yǎng)皿或IOOml的玻璃三角瓶，分裝到培養(yǎng)皿或玻璃 三角瓶中的花粉混合液其密度為3蕾/ml-4蕾/ml，每皿2ml或每瓶10ml。步驟4中的第一次避光培養(yǎng)的溫度為32°C，第二次避光培養(yǎng)的溫度為25°C。步驟5中恒溫搖床的振蕩轉(zhuǎn)速為55-65r/min。本發(fā)明對不同煙草類型均適用，尤其適用于普通煙草類型中的烤煙、白肋煙等。 用本發(fā)明的方法對烤煙和白肋煙的離體花粉進行液體培養(yǎng)，具有花粉萌發(fā)成胚時間短、加 倍效率高、產(chǎn)量大及較容易獲得優(yōu)良變異育種中間材料等優(yōu)點，在DH群體構(gòu)建、育種材料 提純復(fù)壯、種質(zhì)資源創(chuàng)新、多倍體育種及花粉發(fā)育進程研究等方面內(nèi)容，具有較大的實用 價值?？蔀闊煵葑鳛橹参锷锓磻?yīng)器的規(guī)模化生產(chǎn)提供大量正常普通栽培種材料載體， 同時為煙草分子生物學研究尤其是數(shù)量性狀的遺傳機理剖析提供大批高質(zhì)量的雙單倍體 (doubled haploid,DH)株系作為基礎(chǔ)試驗材料，也可以為煙草細胞學、胚胎學、突變體研究 以及生理學等生命科學基礎(chǔ)理論研究提供良好的研究對象。


圖1為已知普通栽培種烤煙流式細胞儀倍性檢測圖；圖2為單倍體流式細胞儀倍性檢測圖；圖3為雙單倍體流式細胞儀倍性檢測圖；圖4為單倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測示意圖5為雙單倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測示意圖；圖6為多倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測示意圖
具體實施例方式實施例1、烤煙花粉的離體液體培養(yǎng)(1)、花蕾采取于晴天取典型煙草植株主花序上無病蟲、生長良好的適齡花蕾，其 外觀表現(xiàn)為花萼與花冠大致等長，蕾長在2. 1-2. 21cm之間，取好的花蕾迅速用冰盒4_7°C 保存；O)、花藥消毒在超凈工作臺內(nèi)用鑷子小心將步驟1中花蕾的花藥剝?nèi)〕觯缓?用無菌市售絲襪包裹花藥浸入濃度為70%的酒精中消毒15s，快速取出立即浸入濃度為 10%的飽和次氯酸鈣(Ca(ClO)2)溶液中消毒8min，不時輕輕晃動燒杯以使其消毒充分，最 后用無菌水沖洗2次，每次5min ；(3)、花粉獲取取步驟2中消毒好的花藥放入圓底大試管中，加入2ml的B5花粉 提取液，用玻璃棒輕輕碾成勻漿，倒入裝有300目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，用IOml的離心 管收集濾液，加B5花粉提取液至所需刻度，離心6min，轉(zhuǎn)速lOOOr/min，棄上清液，加B5花 粉提取液重新懸浮，離心6min，轉(zhuǎn)速500r/min ；(4)、花粉加倍與培養(yǎng)將步驟3中離心后的上清液去掉，加入含有濃度為55mg/L 秋水仙素的N16液體培養(yǎng)基重新懸浮后，分裝到直徑為7. 5cm的培養(yǎng)皿中，密度約為3蕾/ ml-4蕾/ml，每皿^il，32°C靜置避光培養(yǎng)56h，然后將加倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到IOml離心 管，離心6min，轉(zhuǎn)速lOOOr/min，去上清液，加入N13液體培養(yǎng)基，分裝入直徑為7. 5cm培養(yǎng) 皿，每皿約anl，25°C靜置暗培養(yǎng)18d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見胚時，置于25°C恒溫搖床上，振 蕩暗培養(yǎng)8d，轉(zhuǎn)速為65r/min，達到子葉期的胚可轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基上進行電腦自動控制 的繼代培養(yǎng)，溫度為25°C，每日光照他。(6)、染色體倍性檢測可以取出步驟e中獲得的煙株上的上層葉片，葉片面積大 小為2cmX2cm左右，放入細胞裂解液后，立即用鋒利的刀片切碎，然后將該混合液置于流 式細胞儀(PARTEC，德國)中檢測染色體倍性，上樣后流式細胞儀自動生成代表該樣品染色 體倍性的DNA含量分布圖(如圖2、3)。以已知普通栽培種烤煙(圖1)作為對照來調(diào)整流 式細胞儀，使代表對照樣品DNA含量的波峰位于100道附近。然后測定待測樣本的波峰，出 現(xiàn)在50道和100道附近的峰值分別代表單倍體合單雙倍體，從而確定各再生植株的染色體 倍性。(7)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時，敞開瓶口煉苗2-3d，可 移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中，移栽前務(wù)必徹底清洗煙 苗根系上附帶的培養(yǎng)基，然后待開花可套袋結(jié)實。由步驟(6)檢測出來試驗結(jié)果表明，在隨機檢測的57個樣品中，有44個為雙單倍 體，占77. 2%，因此，用本發(fā)明方法對烤煙花粉進行離體液體培養(yǎng)加倍效率可達75%以上。實施例2、白肋煙花粉的離體液體培養(yǎng)(1)、花蕾采取于晴天取典型煙草植株側(cè)花序上無病蟲、生長良好的適齡花蕾，其 外觀表現(xiàn)為花萼與花冠大致等長，蕾長在2. 0-2. ^cm之間，取好的花蕾迅速用冰盒4-7°C保存；O)、花藥消毒在超凈工作臺內(nèi)用鑷子小心剝?nèi)〔襟E1中花蕾的花藥，然后用無 菌紗布包裹花藥浸入濃度為75%的酒精中消毒10s，快速取出立即浸入濃度為10%的飽和 次氯酸鈣(Ca(ClO)2)溶液中消毒lOmin，不時輕輕晃動燒杯以使其消毒充分，最后用無菌水 沖洗3次，每次5min ；(3)、花粉獲取取步驟2中消毒好的花藥放入圓底大試管中，加入3ml的B5花粉 提取液，用玻璃棒輕輕碾成勻漿，倒入裝有400目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，用IOml的離心 管收集濾液，加B5花粉提取液至所需刻度，離心5min，轉(zhuǎn)速1 lOOr/min，棄上清液，加B5花 粉提取液重新懸浮，離心5min，轉(zhuǎn)速600r/min ；(4)、花粉加倍與培養(yǎng)將步驟3中離心后的去上清液，加入含有濃度為65mg/L秋 水仙素的N16液體培養(yǎng)基重新懸浮后，分裝到IOOml的玻璃三角瓶中，密度約為3蕾/ml_4 蕾/ml，每瓶10ml，32°C靜置避光培養(yǎng)69h，然后將加倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到IOml離心管，離 心5min，轉(zhuǎn)速llOOr/min，去掉上清液，加入N13液體培養(yǎng)基，分裝入直徑為7. 5cm培養(yǎng)皿， 每皿約anl，25°C靜置避光培養(yǎng)20d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見胚時，置于25°C恒溫搖床上，振 蕩暗培養(yǎng)10d，轉(zhuǎn)速為55r/min，達到子葉期的胚可轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，溫度為 25°C，每日光照10h，電腦自動控制。(6)、染色體倍性檢測取步驟e中六片真葉以上的煙株葉片，用手小心地撕下葉 片的下表皮并置于載玻片上，滴一滴1 %碘-碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制 好的切片放在40X的顯微鏡下，每切片隨機選取5個氣孔觀察計數(shù)(如圖4、5、6)，以每個 氣孔葉綠體平均個數(shù)在14個以下的為單倍體(如圖4)，14-24個的為雙單倍體(如圖5)， M個以上的為多倍體(如圖6)。(7)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時，敞開瓶口煉苗2-3d，可 移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中，移栽前務(wù)必徹底清洗煙 苗根系上附帶的培養(yǎng)基。由步驟6檢測的試驗結(jié)果表明，在隨機檢測的89個樣品中，有67個雙單倍體，占 75.3%，因此，用本發(fā)明方法對白肋煙花粉進行離體液體培養(yǎng)加倍效率可達70%以上。權(quán)利要求
1.一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于按以下操作步驟進行(1)、花蕾采取保存于晴天在煙草植株主花序或側(cè)花序上采取無病蟲、生長良好的單 核發(fā)育中晚期的適齡花蕾一株或多株，將取好的花蕾迅速用冰盒保存；(2)、花藥消毒將步驟1中保存在冰盒內(nèi)的花蕾在超凈工作臺上剝?nèi)』ɡ僦械幕?藥，然后將剝?nèi)〉幕ㄋ幱脽o菌紗布或無菌市售絲襪包裹浸入70-75%濃度的酒精中消毒 10-1 ，快速取出立即浸入飽和Ca(a0)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒過程中輕 輕晃動燒杯使其消毒充分，最后用無菌水沖洗多次；(3)、花粉獲取取出經(jīng)步驟2消毒好的花藥放入圓底試管中，加入l_3ml的B5花粉 提取液，輕輕碾成勻漿，倒入裝有300-400目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，并用離心管收集濾 液，向裝有濾液的離心管中加入B5花粉提取液至設(shè)定刻度，離心處理后去上清液，再加入 B5花粉提取液重新懸浮，二次離心后再去上清液；(4)、花粉加倍與培養(yǎng)向步驟3中兩次離心后得到的花粉中加入含有濃度為50-70mg/ L秋水仙素的N16液體培養(yǎng)基，使其重新懸浮后分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中，密封好后靜 置于溫度為30-33°C的避光環(huán)境下培養(yǎng)48-7 ，對花粉進行加倍處理；然后將加倍處理后 的花粉轉(zhuǎn)移到離心管，離心處理后去上清液，加入N13液體培養(yǎng)基，分裝入培養(yǎng)皿中，再次 靜置于低溫環(huán)境下暗培養(yǎng)14-21d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中裝入加倍花粉的培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見胚時，便將其置于 23-26°C恒溫搖床上，振蕩暗培養(yǎng)7-10d，并對其進行定時觀察，將達到子葉期的胚轉(zhuǎn)入B5 花粉提取液或MS固體培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，其溫度為25-27°C，每日光照8-lOh ；(6)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時，敞開瓶口煉苗2_3d，然后將 煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，便移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直 接栽種于大田中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法方法，其特征在于 所述方法還包括染色體倍性的檢測步驟，其具體操作如下從步驟5中獲得的煙株上采取 小面積的無菌苗葉片放置在無菌試驗臺或是玻璃器皿中，向葉片滴加細胞裂解液，之后，立 即將其切碎，然后將切碎的葉片置于流式細胞儀中檢測染色體倍性；或者從步驟5中獲得 六片真葉以上的煙株上上采取葉片，取葉片的下表皮并置于載玻片上，滴入一滴碘-碘 化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的顯微鏡下觀察其染色體 倍性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法方法，其特征在于 步驟1中所述的適齡花蕾為花粉發(fā)育時期為單核靠邊期、花萼與花冠等長的花蕾，其蕾長 范圍在2. 0-2. 3cm之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟 2中飽和Ca(Cno)2溶液濃度為10%，其消毒時間為8-lOmin ；無菌水沖洗2_3次，每次為 3-5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟3 中第一次離心和步驟4中的離心時間為5-6min，轉(zhuǎn)速為1000-1 lOOr/min，步驟3中第二次 離心時間為5-6min，轉(zhuǎn)速500_600r/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟4選用直徑為7. 5cm的培養(yǎng)皿或IOOml的玻璃三角瓶，分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中的花粉 混合液其密度為3蕾/ml-4蕾/ml，每皿2ml或每瓶10ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟4 中的第一次避光培養(yǎng)的溫度為32°C，第二次避光培養(yǎng)的溫度為25°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟5 中恒溫搖床的振蕩轉(zhuǎn)速為55-65r/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法。該方法的操作步驟主要是在無菌條件下對經(jīng)過消毒處理后的花藥在B5花粉提取液的作用下通過碾壓快速釋放大量花粉，低速離心收集花粉，先在含有50-70mg/L濃度的秋水仙素的N16液體培養(yǎng)基中32℃靜置避光培養(yǎng)48-72h以進行加倍處理，離心去除秋水仙素后將加倍處理后的花粉在N13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中25℃進行靜置誘胚避光培養(yǎng)14-21d，待肉眼可見胚后置于25℃恒溫搖床上振蕩暗培養(yǎng)7-10d，達到子葉期的胚即可轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，移栽季節(jié)幼苗經(jīng)煉苗后即可移栽入大田開花套袋結(jié)實。該方法具有構(gòu)思新穎、設(shè)計巧妙，科學實用、高效穩(wěn)定、產(chǎn)量大、能大大縮短煙草育種周期等特點。
文檔編號A01H4/00GK102047845SQ20101058472
公開日2011年5月11日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者張俊杰, 曹景林, 林國平, 王毅, 祖秉橋, 蔡長春 申請人:湖北省煙草科研所