專利名稱：半滑舌鰨三倍體魚苗批量化誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)遺傳育種技術(shù)，是一種采用物理學(xué)方法誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體的方 法。
背景技術(shù)：
半滑舌鰨(Cynoglossussemiliaevis)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科 (Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus)，俗名鰨米、舌頭魚、龍利等，是我國特有的名貴經(jīng) 濟(jì)海水魚類，屬于近海溫水性底層魚類。其味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者 歡迎，其市場價(jià)值極高。半滑舌鰨養(yǎng)殖已在我國沿海地區(qū)普遍開展起來，其養(yǎng)殖業(yè)年產(chǎn)值達(dá) 15-20億元人民幣。但是，由于半滑舌鰨雌雄大小差異懸殊，雄性生長速度緩慢，而雌性個(gè)體 在性成熟后又因?yàn)楦共啃韵俾∑稹⒂绊懥舜笠?guī)格商品魚的外觀和質(zhì)量，影響了其商業(yè)價(jià)值， 因而嚴(yán)重影響了漁民養(yǎng)殖的積極性以及半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。三倍體魚因染色體組成不平衡，性腺不能發(fā)育成熟，屬于不育的魚類。因此，采用 現(xiàn)代生物技術(shù)手段，研究半滑舌鰨多倍體誘導(dǎo)技術(shù)，研制出三倍體魚，抑制其性腺發(fā)育，將 生殖腺發(fā)育消耗的能量用于生長，克服性腺發(fā)育時(shí)期的生長停滯和魚肉質(zhì)量下降等不利影 響。這樣既可以解決雌魚性腺發(fā)育影響商品魚質(zhì)量的問題，又可以解決雄魚生長過慢的問 題。這對(duì)于縮短半滑舌鰨養(yǎng)殖周期，提高半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)量、提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，推動(dòng)半 滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重大的應(yīng)用價(jià)值。鑒于魚類不育技術(shù)在遺傳育種、漁業(yè)生產(chǎn)、水環(huán)境保護(hù)和水生生物遺傳多樣性保 護(hù)上的重要意義和應(yīng)用價(jià)值，國際上也非常重視魚類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物不育技術(shù)的研究。而 制作不育魚類的主要途徑是生產(chǎn)三倍體。因?yàn)槿扼w魚類具有性腺不能發(fā)育、不能過度繁 殖、促進(jìn)生長以及提高魚肉品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，因而受到普遍的重視。魚類多倍體的絕大多數(shù)研究 工作是在淡水魚類上開展的。迄今已先后獲得了虹鱒、銀大馬哈魚、大鱗大馬哈魚、大西洋 鮭等魚類三倍體；除虹鱒外，日本還開展了誘導(dǎo)三倍體香魚的研究與開發(fā)，發(fā)現(xiàn)三倍體香魚 的生長速率和抗寒能力都明顯優(yōu)于二倍體香魚，很受消費(fèi)者和養(yǎng)殖家的歡迎，具有很大的 商業(yè)價(jià)值和開發(fā)潛力。但是迄今為止，有關(guān)海水魚類三倍體魚苗的批量化誘導(dǎo)，在國內(nèi)外尚 未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立通過靜水壓誘導(dǎo)大量生產(chǎn)半滑舌鰨三倍體魚苗的技術(shù)方法， 達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)三倍體魚苗的目的；通過三倍體魚苗的生產(chǎn)克服半滑舌鰨雌雄大小差異懸 殊、雄性生長緩慢、雌性性腺發(fā)育過大、影響商品魚質(zhì)量和外觀等問題，從而提高半滑舌鰨 養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下包括二個(gè)方面一、半滑舌鰨三倍體魚苗的誘導(dǎo)；二、半滑舌鰨三倍體魚苗的鑒 定。
一、半滑舌鰨三倍體魚苗的誘導(dǎo)它的技術(shù)內(nèi)容包括1、半滑舌鰨未受精卵的采集及授精；2、三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間 的確定；3、誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體靜水壓休克壓力和處理時(shí)間的確定。1、半滑舌鰨未受精卵的采集及授精選擇性成熟的半滑舌鰨雌魚，采用人工擠壓腹部法采卵，將采集的魚卵置于室溫 20-24°C的干燥燒杯中；將采集的新鮮半滑舌鰨精液加入未受精卵中，精液和卵的授精最 小體積比為500 μ L :50-100ml，干法授精，輕輕搖動(dòng)混勻，后加入2倍于卵量體積溫度為
20-24°C的海水完成授精過程。2、三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間的確定在授精后不同時(shí)間(l，2，3，4，5，6，7，8min)，將授精卵分別放入靜水壓機(jī)的壓力 缸中進(jìn)行靜水壓休克處理，靜水壓為34-36Mpa，處理時(shí)間4-5min，后將授精卵分別移入
21-23°C海水中培養(yǎng)。根據(jù)受精率和三倍體誘導(dǎo)率的高低，確定半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)的最佳 起始時(shí)間為授精后4. 5-5. 5min。3、誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體靜水壓休克壓力和處理持續(xù)時(shí)間的確定在授精后4. 5-5. 5min，將授精卵分別置于觀，32，36，40或44MPa靜水壓下處理 3-4分鐘后，分別移入21-23°C海水中培養(yǎng)，根據(jù)受精率和三倍體誘導(dǎo)率的高低，確定半滑 舌鰨三倍體誘導(dǎo)的最佳靜水壓休克壓力為36-40MPa。在授精后4. 5-5. 5min，將授精卵置于36_40MPa靜水壓下分別處理2，4，6或8分 鐘，根據(jù)受精率和三倍體誘導(dǎo)率的高低，確定半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)的最佳靜水壓休克處理 時(shí)間為4分鐘。二、半滑舌鰨三倍體魚苗的鑒定它的技術(shù)內(nèi)容包括1.通過DNA含量鑒定半滑舌鰨三倍體魚苗；2.通過染色體分 析鑒定半滑舌鰨三倍體魚苗。1.通過DNA含量鑒定半滑舌鰨三倍體魚苗采用商業(yè)上可獲得的PARTEC倍性測定儀(PA)及一步法染色試劑進(jìn)行三倍體胚胎 或魚苗的倍性鑒定。采用正常二倍體胚胎或魚苗作對(duì)照，通過分析胚胎或魚苗細(xì)胞DNA的 含量確定倍性，二倍體胚胎或魚苗細(xì)胞DNA含量絕大多數(shù)集中在沈-觀處，而三倍體魚苗絕 大多數(shù)細(xì)胞中的DNA含量在39-42處，是二倍體魚苗的1. 5倍，從而確定細(xì)胞DNA含量在 39-42的胚胎或魚苗為三倍體。2.通過染色體分析鑒定半滑舌鰨三倍體魚苗半滑舌鰨二倍體魚苗的染色體數(shù)目為2n = 42條；而三倍體魚苗的染色體數(shù)目應(yīng) 該為3n = 63，在授精后4. 5-5. 5min,將授精卵置于36_40MPa靜水壓下處理4分鐘，產(chǎn)生的 魚苗中95%以上的個(gè)體含有63條染色體者，即這些魚苗為三倍體魚苗。本發(fā)明與已有技術(shù)對(duì)比其特點(diǎn)是本發(fā)明建立了采用靜水壓方法直接誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體魚苗的方法，確定了三倍 體誘導(dǎo)的適宜起始時(shí)間、適宜的靜水壓休克壓力和處理時(shí)間。同時(shí)建立了三倍體魚苗鑒定 的方法。本發(fā)明建立的三倍體魚苗誘導(dǎo)方法可高效、可靠誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體魚苗，且三倍體 魚苗的誘導(dǎo)效率較高，本方法誘導(dǎo)的魚苗的三倍體比例高達(dá)95%以上。
4體魚苗倍性整齊、不含二倍體和四倍體。本發(fā)明首次建立了靜水壓批量化誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體魚苗的技術(shù)方法，其特點(diǎn)是 操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)、易行、安全可靠，為半滑舌鰨性別控制和多倍體育種開辟了新的技術(shù) 途徑，可推廣應(yīng)用于幾乎所有魚類，對(duì)魚類性別控制具有重要意義。


圖1 三倍體魚苗和二倍體魚苗細(xì)胞DNA含量比較A 正常二倍體魚苗細(xì)胞DNA含量；B 三倍體魚苗DNA含量。圖2 三倍體魚苗和二倍體魚苗染色體比較A 正常二倍體魚苗染色體；B 三倍體魚苗染色體。
具體實(shí)施例方式采用同源精子與半滑舌鰨卵子授精，在受精后一定時(shí)間，對(duì)受精卵進(jìn)行靜水壓休 克處理，抑制受精卵第二極體的釋放，可以成功誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體魚苗的產(chǎn)生，建立半滑 舌鰨三倍體魚苗高效誘導(dǎo)技術(shù)，對(duì)于半滑舌鰨的性別控制，進(jìn)行不育苗種養(yǎng)殖，提高半滑舌 鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量、產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和巨大的推廣應(yīng)用潛力。下面以半滑舌鰨為例，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容包括二個(gè)方面一、半滑舌鰨三倍體魚苗的誘導(dǎo)；二、半滑舌鰨 三倍體魚苗的鑒定。一、半滑舌鰨三倍體魚苗的誘導(dǎo)它的技術(shù)內(nèi)容包括1、半滑舌鰨未受精卵的采集及授精；2、三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間 的確定；3、靜水壓誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體休克壓力和處理時(shí)間的確定；4.靜水壓誘導(dǎo)半滑舌 鰨三倍體魚苗結(jié)果匯總。1、半滑舌鰨未受精卵的采集及授精選擇性成熟的半滑舌鰨雌魚，采用人工催產(chǎn)方法誘導(dǎo)親魚排卵，采用人工擠壓腹 部法采卵，采集的魚卵置于室溫20-24°C的干燥燒杯中；將采集的新鮮半滑舌鰨精液加入 未受精卵中，精液和卵的授精最小體積比為500 μ L :50-100ml，干法授精，輕輕搖動(dòng)混勻， 加入2倍于卵量體積的溫度為23-M°C的海水完成授精過程。授精過程在IOOOml燒杯中進(jìn) 行。2、三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間的確定本發(fā)明采用靜水壓處理抑制受精卵第二極體排出，從而使染色體加倍的方法進(jìn)行 三倍體誘導(dǎo)。即在授精后不同時(shí)間(l，2，3，4，5，6，7，8min)，將授精卵放入靜水壓機(jī)的壓力 缸中進(jìn)行靜水壓休克處理，靜水壓處理的壓力為34-36Mpa，靜水壓處理時(shí)間為4-5min，處 理完畢后將授精卵移入21-23°C海水中培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)受精率，三倍體比率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)授精卵在 授精后3-7min進(jìn)行靜水壓休克處理，都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體魚苗，且以授精后4. 5-5. 5min 的誘導(dǎo)率最高，可達(dá)到90%。從而確定半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)的最佳起始時(shí)間為授精后 4. 5-5. 5min。3、靜水壓誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體休克壓力和處理時(shí)間的確定確定靜水壓休克起始時(shí)間后，設(shè)定靜水壓壓力梯度為觀，32，36，40和44MPa，持續(xù)處理4分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受精卵在32，36和40MPa壓力下都能獲得一定比例的三倍體魚 苗，而只有在靜水壓壓力36和40MPa時(shí)誘導(dǎo)三倍體魚苗的效果最好，因此確定半滑舌鰨三 倍體誘導(dǎo)最佳的靜水壓壓力為36-40MPa。(見表1)。最后篩選靜水壓處理持續(xù)時(shí)間，將梯度范圍設(shè)為2，4，6和8分鐘，進(jìn)行靜水壓休克 處理。計(jì)數(shù)后代中三倍體產(chǎn)生情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半滑舌鰨受精卵在36MI^壓力下休克處 理2-8分鐘，均有魚苗孵化出膜。但是隨著壓力持續(xù)時(shí)間的加大，孵化率急劇下降，只有在 休克處理4分鐘時(shí)，誘導(dǎo)三倍體魚苗的效果最好。(見表2)表1 靜水壓誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體休克壓力的確定(海水溫度23°C左右，授精后 5min，壓力持續(xù)時(shí)間為^iin)
權(quán)利要求
1. 一種半滑舌鰨三倍體魚苗批量化誘導(dǎo)方法，其特征在于它的方法包括二個(gè)方面 1)、半滑舌鰨三倍體魚苗的誘導(dǎo)；幻、半滑舌鰨三倍體魚苗的鑒定；1)、半滑舌鰨三倍體魚苗的誘導(dǎo)它的技術(shù)內(nèi)容包括(1)、半滑舌鰨未受精卵的采集及授精；(2)、三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間 的確定；C3)、誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體靜水壓休克壓力和處理時(shí)間的確定；(1)、半滑舌鰨未受精卵的采集及授精選擇性成熟的半滑舌鰨雌魚，采用人工擠壓腹部法采卵，將采集的魚卵置于20-24°C的 干燥燒杯中；將采集的新鮮半滑舌鰨精液加入未受精卵中，精液和卵的授精最小體積比為 500 μ L :50-100ml，干法授精，輕輕搖動(dòng)混勻，加入2倍于卵量體積溫度為20_24°C的海水完 成授精過程；(2)、三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間的確定在授精后不同時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7，8!^11)，將授精卵放入靜水壓機(jī)的壓力缸中進(jìn)行 靜水壓休克處理，采用34-36Mpa的靜水壓處理4-5min后，將授精卵分別移入21_23°C海 水中培養(yǎng)；根據(jù)三倍體誘導(dǎo)率的高低，確定半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)的最佳起始時(shí)間為授精后 4. 5-5. 5min ；(3)、誘導(dǎo)半滑舌鰨三倍體靜水壓休克壓力和處理持續(xù)時(shí)間的確定在授精后4. 5-5. 5min,將授精卵分別置于觀，32，36，40或44MPa靜水壓下處理3_4分 鐘后分別移入21-23°C海水中培養(yǎng)，根據(jù)三倍體誘導(dǎo)率的高低，確定半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)的 最佳靜水壓休克壓力為36-40Mpa ；在授精后4. 5-5. 5min,將授精卵置于36_40MPa靜水壓下分別處理2，4，6或8分鐘，根 據(jù)三倍體誘導(dǎo)率的高低，確定半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)的最佳靜水壓休克處理時(shí)間為4分鐘；2)、半滑舌鰨三倍體魚苗的鑒定它的技術(shù)內(nèi)容包括(1).通過DNA含量鑒定半滑舌鰨三倍體魚苗；( .通過染色體分 析鑒定三倍體魚苗；(1).通過DNA含量鑒定半滑舌鰨三倍體魚苗采用PARTEC倍性測定儀(PA)及一步法染色試劑進(jìn)行三倍體胚胎或魚苗的倍性鑒定； 采用正常二倍體胚胎或魚苗作對(duì)照，通過分析胚胎或魚苗細(xì)胞DNA含量，確定二倍體胚胎 或魚苗細(xì)胞DNA含量絕大多數(shù)集中在沈-觀處，而三倍體魚苗絕大多數(shù)細(xì)胞中的DNA含量 在39-42處，是二倍體魚苗的1. 5倍，從而確定細(xì)胞DNA含量在39-42的胚胎或魚苗為三倍 體；(2).通過染色體分析鑒定三倍體魚苗半滑舌鰨二倍體魚苗的染色體數(shù)目為2n = 42條；而三倍體魚苗的染色體數(shù)目應(yīng)該為 3n = 63，在授精后4. 5-5. 5min，將授精卵置于36_40MPa靜水壓下處理4分鐘，產(chǎn)生的魚苗 中95%以上的個(gè)體含有63條染色體，這些魚苗即為三倍體魚苗。
全文摘要
一種半滑舌鰨三倍體魚苗批量化誘導(dǎo)方法，包括三倍體魚苗的誘導(dǎo)方法和鑒定方法；誘導(dǎo)方法包括未受精卵的采集及授精；三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間的確定、靜水壓休克壓力和處理時(shí)間的確定；鑒定方法包括倍性測定儀鑒定和染色體分析鑒定。該方法首次建立了采用靜水壓誘導(dǎo)批量化生產(chǎn)半滑舌鰨三倍體魚苗的方法，篩選到三倍體誘導(dǎo)的適宜起始時(shí)間和靜水壓休克條件，建立了三倍體魚苗批量化誘導(dǎo)的方法。本發(fā)明方法獲得的三倍體魚苗誘導(dǎo)率高達(dá)95％以上。本發(fā)明建立的方法具有先進(jìn)、高效、準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)，在半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)和不育苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，在魚類養(yǎng)殖和育種上具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102119674SQ201010586350
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者季相山, 徐營, 李文龍, 謝明樹, 陳松林 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所