專利名稱：一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及五節(jié)芒(i/^ca/^Am基于胚性愈傷的組培快繁技術(shù) 領(lǐng)域，更具體涉及一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法，它適應(yīng)于以五節(jié)芒幼穗為 外植體通過(guò)愈傷誘導(dǎo)途徑獲得幼苗，以及增值、生根、馴化與移栽。
背景技術(shù)：
國(guó)內(nèi)關(guān)于芒屬植物的組培快繁技術(shù)，在20世紀(jì)90年代就有相關(guān)報(bào)道，他們分 別采用了幼葉、下胚軸、幼根，幼穗作為外植體進(jìn)行芒屬植物的快繁技術(shù)，但其出愈率和分 化率都各不相同，以幼穗的繁殖效率最高，但并未獲得胚性愈傷。另外，在2005年也有關(guān)于 芒屬植物組培快繁技術(shù)的報(bào)道，利用了莖稈扦插技術(shù)得到了幼苗，但是這也是利用的器官 發(fā)生途徑，并未得到胚性愈傷。而我們的研究是利用幼穗為外植體得到了胚性愈傷，再繼 續(xù)做分化、移栽等實(shí)驗(yàn)。因此可以直接做轉(zhuǎn)基因等相關(guān)后續(xù)試驗(yàn)，不僅達(dá)到了快速高效的目 的，同時(shí)為五節(jié)芒的轉(zhuǎn)基因操作提供了可靠的組培體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法，方法易 行，操作簡(jiǎn)便，繁殖系數(shù)大，獲得的愈傷繁殖率高，約為100%。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
中國(guó)是芒屬植物資源分布的中心，并且五節(jié)芒的分布范圍較廣。五節(jié)芒能在荒山、荒 坡、丘陵、江河湖灘等無(wú)敵貧瘠的地方生長(zhǎng)，它不僅適應(yīng)性非常強(qiáng)，而且可以解決能糧之爭(zhēng) 的矛盾。五節(jié)芒的生長(zhǎng)周期短，一般其生長(zhǎng)周期在180天左右，光合作用和光形態(tài)建成相對(duì) 較短，收獲后不影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，生物量大，可燃性強(qiáng)，作為能源消耗時(shí)可以實(shí)現(xiàn)(X)2的 零排放。鑒于目前全世界范圍內(nèi)的能源危機(jī)和國(guó)內(nèi)較少的相關(guān)科學(xué)研究，科研工作者應(yīng)該 充分利用中國(guó)這類優(yōu)質(zhì)的草本生物質(zhì)資源，對(duì)這類植物進(jìn)入深一步的研究。本發(fā)明的內(nèi)容 包括以五節(jié)芒幼穗為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷的初代培養(yǎng)基，生苗繼代培養(yǎng)基，以及幼苗的生 根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本發(fā)明建立基于胚性愈傷的五節(jié)芒組培快繁體系，增值率高(5-6倍)，增值穩(wěn)定， 根系健壯，移栽成活率高，是適于商業(yè)擴(kuò)繁五節(jié)芒的成熟技術(shù)。一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法，其步驟是
1、 幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗，幼穗內(nèi)種子尚未形成，中軸也比較 軟，還沒(méi)形成基本的分支。2、 用初代培養(yǎng)基進(jìn)行初代誘導(dǎo)將其剪成2-3厘米小段，先用75% (體積比，以 下相同)酒精消毒(30-35s)，然后用0. 1% (質(zhì)量體積比，以下相同)氯化汞浸泡(3-5分鐘)， 再用無(wú)菌水沖洗(3-5次)，將其接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。經(jīng)過(guò)(30-35天)的初代 誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷。培養(yǎng)條件為2418°C，每天光照14-16小時(shí)(采用人工光源照射)，光 強(qiáng)為2000LX。初代培養(yǎng)基為以下配方選其一 A =MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KTl-5mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L 或 B =MS 培養(yǎng)基附加激動(dòng)素 KTl_7mg/L，萘 乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，6 水氯化鎂 MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L。采 用這兩種培養(yǎng)基中的任何一種培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)出狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，生長(zhǎng)9-11天 在幼穗基部開始出愈，愈傷狀態(tài)良好，為白色或淡黃色松散愈傷。3、用生苗培養(yǎng)基對(duì)生苗繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生 苗，(25-30天)繼代一次，增殖系數(shù)為5-6。培養(yǎng)條件為M_28°C，每天光照14-16小時(shí)(采用 人工光源照射)，光強(qiáng)為2000LX。生苗培養(yǎng)基配方為以下配方選其一 :k :MS培養(yǎng)基附加激動(dòng) 素 KTl-ang/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L，蔗糖 30g/L，活性炭 3_8g/L。PhytagelR 3g/L 或 B MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KTl-ang/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L, 6水氯化鎂MgCl2 · 6H20800mg/ L，蔗糖30g/L，活性炭3-8g/L , PhytagelR 3g/L。將胚性愈傷轉(zhuǎn)到其中任何一種生苗培養(yǎng) 基之后2-4天，愈傷開始轉(zhuǎn)綠，6-8天開始分化出芽，9-11天左右即可形成小幼苗。4、 用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)所生幼苗在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根， 培養(yǎng)(25-30天)，生根率達(dá)70%以上。培養(yǎng)條件為M_28°C，每天光照14-16小時(shí)(采用人工 光源照射)，光強(qiáng)為2000LX。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以下配方選其一 A:l/2 MS培養(yǎng)基附加激動(dòng) 素 KT2-;3mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L，WiytagelR 3g/L 或 B :MS 培養(yǎng)基附加激 動(dòng)素 KT2-;3mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. :3mg/L，蔗糖 30g/L，活性炭 3_8g/L，PhytagelR3g/L0 將 長(zhǎng)到10-15厘米的幼苗轉(zhuǎn)到任意一種生根培養(yǎng)基上，大概4-6天幼苗就會(huì)分化出大量白色 或黃色的根，且根系發(fā)達(dá)。5、馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長(zhǎng)健壯的、株高在10-15厘米的組培苗移栽到由蛭 石組成的馴化苗圃中馴化。每天早上7點(diǎn)定時(shí)給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15 - 20d 后，視幼苗長(zhǎng)勢(shì)，即可移栽到苗圃中。溫室條件為15°C _25°C，照明使用鹵光，光照(14-16 小時(shí))，光照強(qiáng)度為2000LX。移栽到苗圃后，幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯，根系發(fā)達(dá)，存活率較 高，獲得了大量健壯的五節(jié)芒幼苗。本方法胚性愈傷出愈率高，愈傷再誘導(dǎo)生苗率高，組培苗馴化移栽后，成活率高， 適用于五節(jié)芒種苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以及為后續(xù)轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
a)本發(fā)明消毒方法簡(jiǎn)單，且效率高，初代污染率幾乎為零。b)本發(fā)明得到的愈傷繁殖率高，約為100%。c)本發(fā)明一次得到了組培快繁和轉(zhuǎn)基因組培體系，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因工作 打下基礎(chǔ)。


圖1為一種五節(jié)芒體胚愈傷示意圖。此圖為五節(jié)芒以幼穗為外植體又到處的愈傷，從圖中可以看到，愈傷組織呈淡黃 色或白色，結(jié)構(gòu)松散。圖2為一種五節(jié)芒幼苗示意圖。此圖為愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上幼苗的生長(zhǎng)圖，圖中可見幼苗長(zhǎng)勢(shì)較好，生命力強(qiáng)， 并有根長(zhǎng)出。圖3為一種五節(jié)芒馴化移栽示意圖。
此圖為幼苗移栽到加有營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法，其步驟是
1、 幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗，幼穗內(nèi)種子尚未形成，中軸也比較 軟，還沒(méi)形成基本的分支。2、 用初代培養(yǎng)基進(jìn)行初代誘導(dǎo)將其剪成2-3厘米小段，先用75%酒精消毒 30s，然后用0. 1%氯化汞浸泡5分鐘，再用無(wú)菌水沖洗三次，將其接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上。經(jīng)過(guò)35天的初代誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷。培養(yǎng)條件為25°C，每天光照16個(gè)小時(shí)，光強(qiáng) 為2000LX。誘導(dǎo)初代培養(yǎng)基為A :MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KTl-5mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/ L，蔗糖30g/L，，PhytagelR 3g/L。生長(zhǎng)10天左右在幼穗基部開始出愈，愈傷狀態(tài)良好，為白 色或淡黃色松散愈傷。3、用生苗培養(yǎng)基對(duì)生苗繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生 苗，30天繼代一次，增殖系數(shù)為5-6。培養(yǎng)條件為25°C，每天光照16個(gè)小時(shí)，光強(qiáng)為2000LX。 生苗培養(yǎng)基配方為A =MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KTl-ang/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L,蔗糖 30g/L，活性炭3-8g/L ,PhytagelR 3g/L。將胚性愈傷轉(zhuǎn)到其中任何一種生苗培養(yǎng)基之后3 天左右，愈傷開始轉(zhuǎn)綠，7天左右開始分化出芽，10天左右即可形成小幼苗。4、用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)所生幼苗在在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生 根，培養(yǎng)30天，生根率達(dá)70%以上。培養(yǎng)條件為25°C，每天光照16個(gè)小時(shí)，光強(qiáng)為2000LX。 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為A 1/2 MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KT2-;3mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L。將長(zhǎng)到10-15厘米的幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，大概5天左右幼苗 就會(huì)分化出大量白色或黃色的根，且根系發(fā)達(dá)。馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長(zhǎng)健壯的、株高在5-6厘米的組培苗移栽到由蛭石組成 的馴化苗圃中馴化。每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15d后，視幼苗長(zhǎng)勢(shì)，即 可移栽到苗圃中。溫室條件20°C，照明使用鹵光，光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000LX。移栽到 苗圃后，幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)健壯，根系發(fā)達(dá)，存活率較高，獲得了大量健壯的五節(jié)芒幼苗。
權(quán)利要求
1. 一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法，其步驟是A、幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗；B、用初代培養(yǎng)基進(jìn)行初代誘導(dǎo)將其剪成2-3厘米小段，先用75%體積比的酒精消 毒30-3 ，然后用0. 1%質(zhì)量體積比的氯化汞浸泡3-5分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3-5次，將 其接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)30-35天的初代誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷，培養(yǎng)條 件為2448°C，每天光照14-16，光強(qiáng)為2000LX，初代培養(yǎng)基為A =MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素 KTl-5mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L 或 B :MS 培養(yǎng)基附加激 動(dòng)素 KTl-7mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，6 水氯化鎂 MgCl2 · 6H20800mg/L,蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L，采用這兩種培養(yǎng)基中的任何一種培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，生長(zhǎng) 9-11天在幼穗基部開始出愈，為白色或淡黃色松散愈傷；C、用生苗培養(yǎng)基對(duì)生苗繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生苗，25-30 天繼代一次，增殖系數(shù)為5-6，培養(yǎng)條件為M-28°C，每天光照14-16小時(shí)，光強(qiáng)為2000LX， 生苗培養(yǎng)基配方為A =MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KTl-ang/L，萘乙酸NAAO. 1-0. 3mg/L,蔗糖 30g/L，活性炭3-8g/L，PhytagelR 3g/L或B =MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KTl_2mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L, 6 水氯化鎂 MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖 30g/L,活性炭 3_8g/L，PhytagelR 3g/L，將胚性愈傷轉(zhuǎn)到其中任何一種生苗培養(yǎng)基之后2-4天，愈傷開始轉(zhuǎn)綠，6-8天開始分 化出芽，9-11天形成小幼苗；D、用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)所生幼苗在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，培養(yǎng) 25-30天，培養(yǎng)條件為M_28°C，每天光照14-16小時(shí)，光強(qiáng)為2000LX，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 A 1/2 MS 培養(yǎng)基附加激動(dòng)素 KT2-;3mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L,蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L或B =MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KT2-;3mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L,蔗糖30g/L，活性炭 3-8g/L，WiytagelR3g/L，長(zhǎng)到10-15厘米的幼苗轉(zhuǎn)到任意一種生根培養(yǎng)基上，4_6天幼苗分 化出白色或黃色的根；E、馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長(zhǎng)健壯的、株高在10-15厘米的組培苗移栽到由蛭石組成 的馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，15 - 20d后，移栽到苗圃中， 溫室條件為15°C -25°C，照明使用鹵光，光照14-16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000LX，獲得五節(jié)芒幼田ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法，其步驟是A、幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗；B、用初代培養(yǎng)基進(jìn)行初代誘導(dǎo)剪成小段，用酒精消毒，用氯化汞浸泡，沖洗，接種在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；C、用生苗培養(yǎng)基對(duì)生苗繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生苗，繼代，增殖系數(shù)，每天光照；D、用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)所生幼苗在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)，每天光照；E、馴化移栽在溫室內(nèi)，組培苗移栽到由蛭石組成的馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，移栽到苗圃中，獲得五節(jié)芒幼苗。方法易行，操作簡(jiǎn)便，繁殖系數(shù)大，到的愈傷繁殖率高，約為100%。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102090338SQ20101058990
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者刁英, 周發(fā)松, 胡中立, 胡小虎, 胡暉, 趙玲玲 申請(qǐng)人:湖北光芒能源植物有限公司