專利名稱：一種利用白菜型油菜拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳變異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物新品系選育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種利用白菜型油菜拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳變異的方法。其國際專利分類號(hào)為A01H1/04。
背景技術(shù)：
甘藍(lán)型油菜(Mrassica napus, AACC )是由白菜型油菜(Λ rap a, AA)和甘藍(lán)(Λoleracea, CC)自然雜交，染色體加倍進(jìn)化而來的異源四倍體。與白菜型油菜相比，甘藍(lán)型油菜狹窄的遺傳基礎(chǔ)限制了其遺傳改良。利用白菜型油菜的遺傳變異創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜是拓寬甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源的重要途徑。傳統(tǒng)創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜的方法有兩種，一種是通過甘藍(lán)與白菜型油菜雜交，獲得的人工合成甘藍(lán)型油菜。該方法雖然能有效拓寬現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜的遺傳基礎(chǔ)(參見kyis等.Plant Breeding. 2003，122 :473_478)，但是由于白菜型油菜與甘藍(lán)的雜交親和性障礙，需采用胚挽救等技術(shù)獲得雜種(參見Wen等.Euphytica. 2008，162 :81-89)，并且獲得的人工合成甘藍(lán)型油菜自交結(jié)實(shí)性差，其倍性穩(wěn)定需要的周期長(參見Robert等PlantCell. 2007,19 :3403_3417)，這些不足限制了該方法的廣泛使用。另外一種方法，通過甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜雜交，然后對(duì)雜交后代或者與甘藍(lán)型油菜回交后代進(jìn)行選育，獲得含有白菜型油菜遺傳背景的甘藍(lán)型油菜。該方法雖然被育種家廣為采用，但是因?yàn)殡s交的低世代出現(xiàn)大量非整倍體，使得選育的周期長，選育的過程繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速有效地利用白菜型油菜廣泛的遺傳變異創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜的方法，拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)。本發(fā)明方法是將傳統(tǒng)的利用白菜型油菜與甘藍(lán)雜交獲得新型甘藍(lán)型油菜，和利用白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交，在后代中選育新型甘藍(lán)型油菜的方法，革新為利用基因型為AACCCC六倍體為橋梁，與白菜型油菜有性雜交，獲得新型甘藍(lán)型油菜的方法。從而達(dá)到利用白菜型油菜的遺傳基礎(chǔ)拓寬現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源。本發(fā)明的具體方法如下
本方法通過用甘藍(lán)(CC)與現(xiàn)有雙低優(yōu)良性狀的甘藍(lán)型油菜(AACC)雜交、染色體加倍獲得一種六倍體(AACCCC)，以該六倍體為橋梁，與白菜型油菜雜交，創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜，拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)，具體包括以下步驟1.六倍體的獲得
選取優(yōu)良的甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)有性雜交，授粉7-10天后對(duì)幼胚進(jìn)行胚挽救獲得種間雜種。利用秋水仙堿誘導(dǎo)染色體加倍，或者組織培養(yǎng)中，植株自然加倍，獲得異源六倍體。2.新型甘藍(lán)型油菜的創(chuàng)建
以六倍體作為母本，人工去雄，授予遺傳變異豐富的白菜型油菜花粉，或者以白菜型油菜為母本，授予六倍體的花粉，種子成熟后收獲，獲得新型甘藍(lán)型油菜。
3.新型甘藍(lán)型油菜的鑒定
利用形態(tài)學(xué)、花粉育性以及細(xì)胞學(xué)觀察來鑒定獲得的新型甘藍(lán)型油菜。獲得的新型甘藍(lán)型油菜形態(tài)介于親本之間，有較好的花粉育性育性，染色體數(shù)目為38條。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)雜交合成異源六倍體，并以六倍體作為橋梁，與遺傳變異豐富的白菜型油菜雜交，獲得具有白菜型油菜遺傳成分的甘藍(lán)型油菜。該方法簡便、快速有效地利用白菜型油菜廣泛的遺傳變異拓寬現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源。
具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明方法的一種具體實(shí)施方式
，但并不是對(duì)本發(fā)明方法的限定，任何不超離本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的變換，仍應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:
1.六倍體的獲得
以甘藍(lán)(品系為K154-2)為母本，剝蕾去雄，授予甘藍(lán)型油菜(品系為GH-6)的花粉，有性雜交；或者以甘藍(lán)型油菜(品系為GH-6)為母本，剝蕾去雄，授予甘藍(lán)(品系為K154-2)的花粉，有性雜交。以甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)作為母本，剝蕾去雄，授予甘藍(lán)(品系R9054)的花粉，有性雜交。采用胚挽救方式獲得種間雜種試管苗。通過快繁技術(shù)獲得大量的試管苗，利用秋水仙堿誘導(dǎo)染色體加倍，或者組織培養(yǎng)中，植株自然加倍，獲得三種雜交方式的六倍體株系，分別是Η-1，Η-2，Η-3。胚挽救方法具體步驟是摘取授粉7-10天后的子房，70%的酒精滅菌30s，無菌水洗一次，用10 %的次氯酸鈉表面消毒15min，無菌水洗三次，每次5min，剝離幼胚，接種到含有洲蔗糖，1/2 MS培養(yǎng)基中。(1/2 MS培養(yǎng)基的成分是NH4N03(825mg/L)+ KNO3 (950mg/L)+ CaCl2. 2H20 (220mg/L) + MgSO4. 7H20 (185mg/L) + KH2PO4 (85mg/L) + KI (0. 83mg/L)+ H3BO3 (6. 2mg/L) + MnSO4. 4H20 (22. 3mg/L) + ZnSO4. 7H20 (8. 6mg/L) + Na2MoO4. 2H20(0. 25mg/L) + CuSO4. 5H20 (0. 025mg/L) + CoCl2. 6H20 (0. 025mg/L) + Na2EDTA (37. 3mg/L) + FeSO4JH2O (27. 8mg/L) + 肌醇(lOOmg/L) + 煙酸(0. 5mg/L) + 鹽酸吡哆醇(VB6)(0. 5mg/L) + VB1 (0.1mg/L) +甘氨酸(2. Omg/L))。放置到18小時(shí)光照，8小時(shí)暗處理，20°C的光照培養(yǎng)室中培育。秋水仙堿誘導(dǎo)具體方法對(duì)發(fā)芽的植株轉(zhuǎn)入MS + 3mg/L IBA + 0. 2mg/L NAA培養(yǎng)基中快繁2-3次，獲得大量植株用于秋水仙堿誘導(dǎo)加倍。實(shí)驗(yàn)材料于100mg/L秋水仙堿+ MS + 3mg/L IBA + 0. 2mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天，發(fā)現(xiàn)膨大愈傷后，然后轉(zhuǎn)入MS +3mg/L IBA + 0. 2mg/L NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天成苗，最后轉(zhuǎn)入MS + 0. 5mg/L IBA生根。種植田間，檢測其花粉育性和結(jié)實(shí)性，篩選染色體加倍成功的六倍體。2.新型甘藍(lán)型油菜的創(chuàng)建
以六倍體植株H-I，H-2,和H-3為母本，進(jìn)行人工去雄，授予白菜型油菜花粉，或者以白菜型油菜為母本，授予六倍體的花粉，有性雜交。獲得新型甘藍(lán)型油菜。實(shí)施例2
以甘藍(lán)(品系為K1M-2)與甘藍(lán)型油菜(品系為GH-6)雜交獲得的六倍體(H-I)作為母本，人工去雄，授予兩個(gè)春性白菜型油菜(Pusa Kalyani, Tori 7)、兩個(gè)冬性白菜
4型油菜(Svalof 0308，CGN07221)和半冬性白菜型油菜(Si Yue Man, 6Y733,6Y812,7F158, 7F159, 7F161, 7M67)的花粉。發(fā)現(xiàn)六倍體與不同生態(tài)型的白菜型油菜雜交的可交配性均強(qiáng)，達(dá)到平均結(jié)實(shí)率為8. 76粒/莢。種子成熟，獲得新型甘藍(lán)型油菜。實(shí)施例3
以甘藍(lán)型油菜(品系為GH-6)與羽衣甘藍(lán)(品系為K1M-2)雜交獲得的六倍體(H-2)作為母本，人工去雄，授予半冬性油菜(Si Yue Man，6Y733，6Y812，Chiffu，7F180, 7F181, 7F182, 7F183)，兩個(gè)春性白菜型油菜(Pusa Kalyani, Tori 7)、兩個(gè)冬性白菜型油菜(Svalof 0308，CGN07221)的花粉，以及白菜型油菜7F018與7F136的雜交種QF032花粉，其與不同生態(tài)型的白菜型油菜雜交的可交配性均強(qiáng)，平均結(jié)實(shí)率為8.2粒/莢。以6Y812作為母本，與H-2雜交的結(jié)籽率為6. 49粒/莢。種子成熟，獲得新型甘藍(lán)型油菜。實(shí)施例4
以甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)與甘藍(lán)(品系R9054)雜交獲得的六倍體(H-3)作為母本，授予白菜型油菜6Y733的花粉，結(jié)籽率為2. 3粒/莢；反交的結(jié)籽率為4. 42粒/莢。種子成熟，獲得新型甘藍(lán)型油菜。以上獲得的新型甘藍(lán)型油菜的鑒定
對(duì)新型甘藍(lán)型油菜進(jìn)行形態(tài)學(xué)，花粉育性和細(xì)胞學(xué)的鑒定。鑒定結(jié)果顯示，所有的六倍體與白菜型油菜的雜交種的形態(tài)介于六倍體與白菜型油菜之間，花粉育性平均為90. 54%,染色體數(shù)目與甘藍(lán)型油菜的染色體數(shù)目一致，為38條?；ǚ塾澡b定的具體方法天氣晴朗，取當(dāng)天新開的花2朵，取出長、短雄蕊各一枚，滴一滴醋酸洋紅染液，將花粉抖落在玻片上，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。大而圓，且能被染成紅色的為可育花粉，不能被染上色的小而癟的花粉為不育花粉。每單株觀察花粉的總數(shù)在200-300個(gè)左右。細(xì)胞學(xué)鑒定的具體方法取植株幼小花蕾，用0. 002M的8-羥基喹啉處理，并置于室溫(25°C)中，處理3-4h后用卡諾固定液(乙醇冰醋酸=3:1)固定Mh以上，4°C保存。固定好的子房用IM HCl在60°C恒溫水浴鍋中水解Smin，用10%改良卡寶品紅染色敲片壓片，在顯微鏡下觀察并記錄染色體數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種利用白菜型油菜拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳變異的方法，其特征在于所述本方法通過用甘藍(lán)(CC)與甘藍(lán)型油菜(AACC)雜交、染色體加倍獲得一種六倍體(AACCCC)，以該六倍體為橋梁，與白菜型油菜雜交，創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜，具體包括以下步驟(1)六倍體的獲得選取甘藍(lán)型油菜(AACC)與甘藍(lán)(CC)有性雜交，授粉7-10天后對(duì)幼胚進(jìn)行胚挽救獲得種間雜種；然后利用秋水仙堿誘導(dǎo)染色體加倍，或者組織培養(yǎng)中，植株自然加倍，獲得基因組結(jié)構(gòu)為AACCCC的異源六倍體；(2)新型甘藍(lán)型油菜的創(chuàng)建以所述異源六倍體作為母本，人工去雄，授予白菜型油菜花粉，或者以白菜型油菜為母本，授予六倍體的花粉，種子成熟后收獲，獲得新型甘藍(lán)型油菜。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的利用白菜型油菜拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳變異的方法，其特征在于所述胚挽救方法具體步驟是摘取授粉7-10天后的子房，70%的酒精滅菌30s，無菌水洗一次，用10 %的次氯酸鈉表面消毒15min，無菌水洗三次，每次5min，剝離幼胚，接種到含有洲蔗糖，MS培養(yǎng)基中，放置到18小時(shí)光照，8小時(shí)暗處理，20 ！的光照培養(yǎng)室中培育。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1和2所述的利用白菜型油菜拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳變異的方法，其特征在于所述利用秋水仙堿誘導(dǎo)染色體加倍的具體方法如下對(duì)發(fā)芽的植株轉(zhuǎn)入MS +3mg/L IBA + 0. 2mg/L NAA培養(yǎng)基中快繁2_3次，獲得大量植株用于秋水仙堿誘導(dǎo)加倍；實(shí)驗(yàn)材料于100mg/L秋水仙堿+ MS + 3mg/L IBA + 0. 2mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天，發(fā)現(xiàn)膨大愈傷后，然后轉(zhuǎn)入MS + 3mg/L IBA + 0. 2mg/L NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天成苗，最后轉(zhuǎn)入MS + 0. 5mg/L IBA生根；種植田間，檢測其花粉育性和結(jié)實(shí)性，篩選染色體加倍成功的六倍體。
全文摘要
一種利用白菜型油菜拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳變異的方法，包括利用甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)雜交，染色體加倍獲得一種六倍體，將六倍體與遺傳變異豐富的白菜型油菜雜交，獲得新型甘藍(lán)型油菜。其特征是以六倍體為橋梁，與遺傳變異豐富的白菜型油菜雜交，可以快速、簡便有效地獲得具白菜型油菜遺傳成分的新型甘藍(lán)型油菜，拓寬現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜的種質(zhì)資源。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102550390SQ20101060718
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者付東輝, 李加納, 李勤菲, 梅家琴, 錢偉 申請人:西南大學(xué)