專利名稱：防治多種細菌性病害的生防菌株4at8的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，屬于農(nóng)作物防病治病領域，專用于蔬果類多種細菌性病害的無公害防治。背景技術(shù)：
細菌性病害是不同于真菌性病害的另一類植物病害，在溫室蔬菜作物上發(fā)生極為普遍。而且?guī)缀跞珵橥羵餍圆『?，在防治上應嚴格實行土傳病害的綜合防治措施。但是，又不同于土傳真菌性病害，植株一旦染病，多是整株感染，且病情發(fā)展迅速，會很快死亡。在茄科植物上通常發(fā)生的有番茄青枯病，番茄潰瘍病、番茄軟腐病、番茄瘡痂病、辣(甜椒)青枯病、辣(甜椒)軟腐病、辣(甜椒)瘡痂病、茄子青枯病等；黃瓜的細菌性果斑病等是瓜果類作物上較常發(fā)現(xiàn)的一類病害；水稻白葉枯、水稻細菌性條斑病等也是影響糧食產(chǎn)量質(zhì)量的重要病害。屬于世界性病害之一的茄科作物青枯病，是由Wh/ ⑶ari 引起的細菌性枯萎病，該病多在結(jié)果期開始發(fā)病，發(fā)病初期白天萎蔫，夜晚恢復，2 — 3天后，不再恢復，枯萎死亡，但植株仍保持綠色；發(fā)病植株的莖基部維管束變褐，用手擠壓，有乳白色粘液滲出。該病菌可危害50多科300多種植物。一般以番茄、馬鈴薯、芝麻、花生、大豆、辣椒等茄科蔬菜以及煙草、香蕉等經(jīng)濟作物受害較重。隨著新寄主的發(fā)現(xiàn)，以及氣溫轉(zhuǎn)暖等因素， 青枯病發(fā)生越來越普遍，并且日趨嚴重，每年在全球范圍內(nèi)造成的經(jīng)濟損失不少于120億兀。番茄潰瘍病也是比較常見的細菌病害之一，多為整株染病，發(fā)病初期植株下部葉片向上縱卷，凋萎下垂，部分植株出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，發(fā)病后期，病葉葉緣枯黃，葉脈間變黃，全葉變褐枯萎，但不脫落；而且會導致莖部出現(xiàn)狹長條斑，后期病斑開裂；還會產(chǎn)生大量氣生根，莖干髓部中空腐爛，散發(fā)出臭味，嚴重時植株枯死。番茄潰瘍病是一種毀滅性病害，自 1985年在北京市發(fā)現(xiàn)后，已相繼在內(nèi)蒙古、山西、河北、黑龍江、吉林、遼寧等省、自治區(qū)發(fā)生為害。嚴重發(fā)病的地塊番茄減產(chǎn)達25% — 75%。我國已將其列為檢疫對象以防止和控制病害的發(fā)生蔓延。瓜果類的細菌性角斑病也是溫室棚栽條件下發(fā)病比較嚴重的病害之一，該病菌為假單胞菌，在大棚和露地黃瓜的整個生育期均可發(fā)生。主要危害葉片，也危害莖蔓和果實。 葉片受害時，葉正面病斑淡褐色，背面受葉脈限制呈多角形，表面可見乳白色菌膿；果實上的病斑可向內(nèi)擴展，蔓延至種子。在大棚和露地，發(fā)病都比較嚴重，在3(Γ50%之間，嚴重時可達100%。嚴重危害水稻的水稻白葉枯是由黃單胞菌屬引起的細菌性病害。植物初期葉尖及邊緣有黃綠色斑點，之后沿葉脈形成蒼白色、黃褐色長條斑，最后變灰白色而枯死。發(fā)病株容易倒伏，會嚴重影響稻穗結(jié)實率。一般會使水稻減產(chǎn)20 30%，嚴重時可達50飛0%。。目前，對于細菌性病害，在化學防治上，長期以來，多用農(nóng)用鏈霉素、可殺得、甲霜銅、DTM等。但是由于長期使用此類藥品，多數(shù)細菌性病害已經(jīng)對其產(chǎn)生了很強的抗藥性， 再用這類藥品進行防治，效果差，已經(jīng)難以控制病菌危害與發(fā)展。同時，細菌性病害，多為土傳病害，具有寄主范圍廣，抗逆性強，難以防治等特點，在生產(chǎn)中，缺乏有效的化學農(nóng)藥進行防治，而且化學農(nóng)藥會污染水、土壤等，破壞土壤結(jié)構(gòu)，影響生態(tài)環(huán)境；直接危害非靶標的微生物，對人畜極不安全，這些因素都使得化學農(nóng)藥的使用得到嚴重的限制。因此，非化學性防治措施目前已成為防治細菌性病害的核心，而生物防治則是其中最有前途的方法?，F(xiàn)有技術(shù)中按照本實驗室的菌體保藏液方法，菌體可室溫保存2 3年。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對當前防治植物多種細菌性病害使用化學農(nóng)藥污染嚴重，使用成本過高，并且現(xiàn)有技術(shù)中沒有對多種細菌性病害同時具有較高防效的生防制劑等問題，提供一種防治多種細菌性病害的單一生防菌菌株及制劑，該菌劑的防效在60%以上。技術(shù)方案
一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，熒光假單胞菌(作洲而膨/？浙 /Azore1S⑶/^)，2010年5月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 3834。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。生防菌株4AT8用于制備生防菌劑的方法，
1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)ISOrpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；
2)當培養(yǎng)至OD值在0.5 0.8之間時，將種子菌液以1:100體積比加入LB培養(yǎng)液中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 24小時。然后4000rpm離心IOmin,每IOOOml培養(yǎng)液獲得 13 16g濕菌，每克濕菌含4X 101° IO15個菌體。取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012cfu/mlo其中，種子培養(yǎng)LB培養(yǎng)液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L， 調(diào)節(jié)PH值為7. 0 ；菌體保藏液為0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的 Tween20o所述生防菌劑可以用于防治茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害。有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對茄科植物的青枯病、番茄潰瘍病、 黃瓜細菌性果斑病、水稻白葉枯等多種細菌性病害開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬果類及水稻等農(nóng)作物的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于相關(guān)產(chǎn)品的出口貿(mào)易。生防菌4AT8菌體和上清在平板拮抗試驗中顯示對番茄青枯病、番茄潰瘍病、黃瓜細菌性條斑病、水稻白葉枯病原菌有較好的抑制作用；溫室試驗表明，該菌劑對番茄青枯病、番茄潰瘍病、黃瓜細菌性條斑病、水稻白葉枯病均有顯著的防治效果；溫室大棚試驗表明，該菌劑對番茄青枯病、番茄潰瘍病、黃瓜細菌性條斑病、水稻白葉枯病具有較好的防效， 防效在60 75%。該菌劑用濕菌與本實驗室的菌體保藏液按1 :40(g/ml)配成菌劑，可室溫保存2 3年。該菌劑除了可以再移栽時灌根使用外，還可以在移栽前與有機肥混合制成堆肥，然后隨肥料在整地過程中埋到土壤中使用。四


圖1生防熒光假單胞菌4AT8菌體和發(fā)酵上清對青枯病病原菌的拮抗結(jié)果； 圖2生防熒光假單胞菌4AT8菌體和發(fā)酵上清對番茄潰瘍病病原菌的拮抗結(jié)果； 圖3生防熒光假單胞菌4AT8菌體和發(fā)酵上清對水稻白葉枯病原菌的拮抗結(jié)果。五
具體實施例方式
一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，熒光假單胞菌(作洲而膨/？浙 fluorescens),從河北小麥根圍土中分離得到。生防菌株4AT8用于制備生防菌劑的方法，
1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)ISOrpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；
2)當培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時，將種子菌液以1 :100體積比加入LB培養(yǎng)液中， 300C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，。然后4000rpm離心lOmin，每IOOOml培養(yǎng)液獲得 13 16g濕菌，每克濕菌含4X 101° IO15個菌體。取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 IX 1012CfU/ml。其中，種子培養(yǎng)LB培養(yǎng)液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20。上述生防菌劑用于防治茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害。實施方法(1)熒光假單胞菌4AT8菌體和上清平板拮抗試驗
選擇供試病原菌番茄青枯菌 ZJ3721 (Malstonia solanacearum, JG Li et al.，2010， Popff of Ralstonia solanacearum, a new two-domain harpin targeting the plant cell wall)、番茄潰瘍ACCC 01233 iClavibacter組義力/識/？日/？從，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)、白葉枯ACCC 03530 {Xanthomonas orj^ae，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)。將病原菌番茄潰瘍菌、白葉枯在NA培養(yǎng)液(牛肉浸膏3g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉 lg/L，蔗糖10g/L，pH=7. 0)，將病原菌番茄青枯菌在YGPA (葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L， 蛋白胨5g/L,，pH=7. 0)中培養(yǎng)16-24 h至CFU為108/ml)，加入熔化冷卻至40°C左右的相應固體培養(yǎng)基中，體積比1:200，再1:200加入10%TTC (氯化三苯四氮唑)染料。將培養(yǎng)基每20mL倒入9 cm直徑的平板中。待冷卻凝固后，牙簽接種生防菌4AT8或打孔加入4AT8 生防菌發(fā)酵上清lOOul。24 h后記錄抑菌圈環(huán)徑。(2)溫室試驗中，培養(yǎng)基質(zhì)中播種番茄，黃瓜，待番茄、黃瓜長至4葉期，選長勢一致的植株移栽到塑料杯中進行試驗。將4AT8菌劑稀釋濃度至lxl08CFU/ml后灌根使用，7 天后，將病原菌稀釋濃度為lxl07CFU/ml灌根使用，其中黃瓜細菌性角斑病使用發(fā)病田塊的土壤。(3)溫室大棚試驗
田間試驗共設三個處理A、生防菌劑4AT8 ；B、化學藥劑(70%農(nóng)用鏈霉素SP1000倍液和25%葉枯寧400倍液);C、空白對照。每個小區(qū)16m2，小區(qū)間設三行隔離區(qū)，各處理按完全隨機區(qū)組排列，重復4次，全試驗共12個小區(qū)。試驗前按試驗方案分好小區(qū)，開好隔離溝，每畝使用量為1000毫升109CFU/ml的生防菌劑4AT8。分別統(tǒng)計各種病害的病害嚴重度，并且計算防效。試驗結(jié)果
(1)生防菌4AT8拮抗病原菌試驗結(jié)果生防熒光假單胞菌4AT8菌體和發(fā)酵上清對青枯病(圖1)、潰瘍病(圖2)以及水稻白葉枯(圖3)顯示較好的平板抑制效果。(2)溫室試驗表明，生防菌4AT8在溫室內(nèi)對青枯病(表1 )、潰瘍病(表2)以及黃瓜細菌性角斑病(表3)的防效在80%以上，對病原菌起到了很好的控制作用。(3)田間試驗表明，生防菌4AT8對生防菌4AT8在溫室內(nèi)對青枯病(表4)、潰瘍病 (表5)、黃瓜細菌性角斑病(表6)以及水稻白葉枯(表7)都有較好的抗病效果。表1 生防菌劑4AT8對番茄青枯病的溫室防治效果
權(quán)利要求
1.一種防治多種生防細菌性病害的生防菌株4AT8，是熒光假單胞菌(作洲而膨/？浙 /Azore1S⑶/^)，2010年5月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 3834。
2.用權(quán)利要求1所述生防菌株4AT8制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述生防菌劑在防治茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害中的應用。
4.權(quán)利要求2所述生防菌劑的制備方法，包括1)將權(quán)利要求1所述生防菌株4AT8接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)ISOrpm振蕩培養(yǎng)， 12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；2)當培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時，將種子菌液以1 :100體積比加入LB培養(yǎng)液中， 300C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，然后4000rpm離心lOmin，每IOOOml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4X 101° IO15個菌體，取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑， 成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012cfu/mlo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的方法，其中，種子培養(yǎng)LB培養(yǎng)液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為 7.0 ；菌體保藏液為0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其主要特征在于，所用LB培養(yǎng)液配置方法為氯化鈉 10g/L,胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，屬于植物保護技術(shù)領域。該菌是熒光假單胞菌，將該菌接種于本實驗室研發(fā)的培養(yǎng)液中，30℃250rpm發(fā)酵20～24小時，然后6000rpm離心10min，取濕菌與菌體保藏液按140(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012cfu/ml。對茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害的田間防效在60-75%，同時該菌劑還有改善土壤微環(huán)境等作用。
文檔編號A01N63/02GK102154157SQ20101060866
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者嚴芳, 楊明明, 郭堅華, 陳云 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學