專利名稱：花藥絨氈層特異表達(dá)啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻β -1,3-葡聚糖苷酶基因Osgl 基因啟動子的分離鑒定和應(yīng)用。該啟動子被命名為OSGP (即Osgll^omoter)，是花藥絨氈層 特異表達(dá)啟動子。將其應(yīng)用于研究基因在花藥絨氈層的表達(dá)。特別是將其用于構(gòu)建特定的 表達(dá)載體，使特定的基因在花藥絨氈層特異表達(dá)，達(dá)到創(chuàng)造基因工程雄性不育系和恢復(fù)系 的目的。
背景技術(shù)：
水稻是模式植物，也是世界上最重要的兩大糧食作物之一。水稻營養(yǎng)價值高，我國 有60%以上的人口，亞洲有4/5以上的人口以稻米為主食。隨著我國人口的不斷增加，人均 土地不斷減少，如何保證中國的糧食安全已成為當(dāng)前水稻生產(chǎn)中的熱點難點問題。利用水 稻的雜種優(yōu)勢，培育高產(chǎn)、抗病良種水稻是解決這一問題的主要途徑。水稻雜種優(yōu)勢研究始于上世紀(jì)60年代。袁隆平率先在我國開展水稻雌性不育研 究，并提出通過選育雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢復(fù)系的三系法途徑來利用 水稻的雜種優(yōu)勢。花藥和花粉特異性表達(dá)的基因及其調(diào)控序列的研究是利用基因工程創(chuàng)造 植物雄性不育系和恢復(fù)系的基礎(chǔ)。至今植物雄性不育的研究廣泛應(yīng)用于基因工程育種，對 花藥特異性表達(dá)基因調(diào)控序列的研究，已經(jīng)取得很大的進(jìn)展。在煙草中克隆得到的TA^基 因啟動子中的TGAAATCA及ACTAAGTC兩調(diào)控元件決定了該基因在花藥絨氈層特異表達(dá)。擬 南芥中分離得到的A9基因的啟動子只在花藥絨氈層中起作用。玉米花粉特異性基因加13 啟動子中QELEMENTZMZM13序列可以增強該基因在花粉中的特異表達(dá)。水稻花藥特異啟動 子0sg6B含有兩個花藥特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件GTGANTG10和P0LLEmLELAT52。這些 啟動子主要應(yīng)用于構(gòu)建特定的表達(dá)載體，使特定的基因在花藥絨氈層特異表達(dá)，創(chuàng)造基因 工程雄性不育系和恢復(fù)系。本發(fā)明是鑒定了一個水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osgl的啟動子。該啟動子具 有花藥絨氈層表達(dá)的特異性。通過啟動子活性分析，將該啟動子用于使特定的基因在花藥 絨氈層特異表達(dá)，創(chuàng)造基因工程雄性不育系和恢復(fù)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有花藥絨氈層表達(dá)特異性的植物內(nèi)源啟動子及其 應(yīng)用。本發(fā)明啟動子來源于粳稻合江19的基因組。通過分離和研究水稻β-1，3_葡聚 糖苷酶基因(Osgl)的啟動子(0SGP，即Osgl Promoter)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該啟動子具有花藥絨 氈層特異性。本發(fā)明啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，序列全長1000bp。根據(jù)植物順 式調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫(PLACE)的搜索，本發(fā)明所提供的啟動子區(qū)域含有多個組織特異性順式 作用元件(如圖1所示)。其中在50-54，532-536，711-715，820-824，829-833位堿基含有花粉表達(dá)相關(guān)的應(yīng)答元件GTGANTG10，在365-370，417-422，435-440，893-898位堿基含有 花粉特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件P0LLEmLELAT52，在110-116堿基位含有花粉表達(dá)特異 的增強元件QELEMENTZMZM13。本發(fā)明技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，對其替換、缺失 或增加一個或幾個核苷酸，獲得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非應(yīng)答原件或作用原 件，替換一個或幾個堿基。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)SEQ ID No. 1的序列獲得具有控制 基因花藥絨氈層特異表達(dá)的DNA功能片段。因此，本發(fā)明所述的啟動子還包括SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，如，缺失44位后的CTC核苷酸， 或在133位插入GT核苷酸，或?qū)?45位的T去掉且具有相同功能的核苷酸序列；以及由SEQ ID No. 1產(chǎn)生的具有控制基因花藥絨氈層特異表達(dá)的DNA功能片段。這種功能片段可以是 能夠控制基因在水稻花藥絨氈層特異表達(dá)的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明啟動子用于構(gòu)建組織特異表達(dá)的表達(dá)載體。此外還 可以將目的基因可操作地連接到本發(fā)明的啟動子之下，構(gòu)建得到表達(dá)盒，進(jìn)一步可將該表 達(dá)盒導(dǎo)入植物表達(dá)載體，獲得組織特異表達(dá)的重組表達(dá)載體。因此，本發(fā)明還包括由上述啟 動子構(gòu)建的表達(dá)盒，以及含有上述表達(dá)載體或表達(dá)盒的表達(dá)載體或重組載體。本發(fā)明啟動子可以用于制備轉(zhuǎn)基因植物。比如，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法以及花 粉管通道等方式獲得轉(zhuǎn)基因植物。從而可以通過引入抗蟲、抗病等基因，培育出抗蟲、抗病 植物，提高植物抗蟲和/或抗病活性。本發(fā)明的啟動子可用于制備本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)基因植 物，用于控制外源或內(nèi)源基因在植物花器官，優(yōu)選在花藥的絨氈層中的特異表達(dá)，優(yōu)選的植 物為水稻、小麥、玉米等單子葉植物，最優(yōu)選為水稻。本發(fā)明的啟動子還可以應(yīng)用于基因工程培育雄性不育系和恢復(fù)系，特別適于應(yīng)用 于基因工程培育水稻雄性不育系和恢復(fù)系。在本發(fā)明實施例中，利用所述啟動子OSGP構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 遺傳轉(zhuǎn)化方法將所述載體轉(zhuǎn)化水稻品種，可以在植物的花藥絨氈層觀察到報告基因GUS的 表達(dá)，表明本發(fā)明提供的啟動子OSGP可以控制基因在植物的花藥絨氈層中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點和效果1.本發(fā)明的啟動子為花藥絨氈層特異表達(dá)，可以用于基因在花藥絨氈層特異表達(dá) 的研究。2.本發(fā)明的啟動子為花藥絨氈層特異表達(dá)，可以用于創(chuàng)造植物雄性不育系和恢復(fù) 系。


圖1為啟動子OSGP的序列，下劃線顯示的堿基表示的是花粉特異相關(guān)的應(yīng)答元件 GTGANTG10, P0LLEN1LELAT52 用方框顯示，QELEMENTZMZM13 用圓角矩形顯示。圖2為定量PCR檢測OSGP所控制的Osgl在水稻不同部位的表達(dá)量。圖3為表達(dá)載體pCAMBIA1381z-0SGP的物理圖譜，該載體含有潮霉素抗性篩選基 因，啟動子被融合到GUS基因5’端非翻譯區(qū)。圖4為轉(zhuǎn)化啟動子OSGP的水稻的⑶S活性檢測，圖A、B、C分別為水稻減數(shù)分裂末 期，小孢子早期，小孢子中期的花藥；圖D、E、F分別為減數(shù)分裂末期，小孢子早期，小孢子中期的花藥橫切面，圖中藍(lán)色為⑶S在水稻花藥絨氈層特異表達(dá)。標(biāo)尺長度為100 μ m。
具體實施例方式以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1 啟動子的分離和鑒定發(fā)明人選取水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osgl的轉(zhuǎn)錄起始位點上游11Λ的范圍 作為候選啟動子區(qū)域進(jìn)行PCR擴增。設(shè)計引物:F(GCTCTAGAGTCGACGAATAATGCCTTC) (SEQ ID No 2)和 R (CGGGATCCGAAGGAGATCCTTTGTCCCATA) (SEQ ID No. 3)，下劃線表示添加的限制性 酶切位點。首先利用引物以粳稻合江19的基因組DNA(CTAB法抽提，Zhang QF等，1992， Genetic diversity and differentiation of indica and japonica rice detected by RFLP anaysis. Theor. App 1. Genet. 83，495-499)為模板進(jìn)行擴增，反應(yīng)條件是94°C 2min ； 94°C 15sec，58°C 30sec，72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C 5min)。PCR 產(chǎn)物回收后連入 pGEM-T 載 體上，連接反應(yīng)PCR 產(chǎn)物 1 μ l，pGEM-T 0. 5μ 1, IU T41igase, 5Xbuffer 2口1，總10口1體 積，4°C連接過夜；連接產(chǎn)物與大腸桿菌DHlOB混勻，42°C熱激90s，加400 μ 1 LB，復(fù)蘇45分 鐘，取200 μ 1涂于含氨芐霉素的LA平板，37°C，過夜。篩選陽性克隆并測序。結(jié)果證實擴 增序列為預(yù)期的啟動子序列。將該序列輸入PLACE數(shù)據(jù)庫，即給出了該啟動子包含多個花 粉特異性相關(guān)應(yīng)答順式作用元件(圖1)。結(jié)果表明，在水稻Osgl的啟動子區(qū)域有花粉特異 相關(guān)的應(yīng)答元件 GTGANTG10、P0LLEN1LELAT5 和 QELEMENTZMZM13。GTGANTG10 基序在 Osgl 的啟動子區(qū)域有7個重復(fù)。P0LLEmLELAT52在Osgl的啟動子區(qū)域有4個重復(fù)。實施例2 =Osgl基因在水稻中的表達(dá)以水稻品種合江19為材料，取其種子、根、葉、葉鞘以及不同時期的花藥。用 Invitrogen 白勺 TRIzol M 總 RNA, # M Fermentas 白勺 RevertAid first strand cDNA synthesis kit反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈。用ABI PRISM 7300對不同時間處理的材料的Osgl 進(jìn)行PCR檢測。PCR的IOul反應(yīng)體系加入了 0. 15ul的EvrGreen，反應(yīng)條件是94°C 2min ； 94°C 5sec，58°C 10sec，72°C 10sec，40個循環(huán)。以萌發(fā)種子的Osgl的表達(dá)量為1，對水稻 其他部位的Osgl的表達(dá)量進(jìn)行相對定量的計算(Lagarde D等，1996，Tissue-specific expression of Arabidopsis AKTl gene is consistent with a role inK+nutrition. Plant J. 9，195-20；3)。相對定量結(jié)果顯示，Osgl的表達(dá)量在減數(shù)分裂后期、小孢子早期的 表達(dá)量較高(圖2)。實施例3 啟動子表達(dá)活性鑒定本發(fā)明的實施方案就是構(gòu)建啟動子的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻品種合江 19，⑶S顯色及組織切片觀察該啟動子的組織特異表達(dá)活性。具體操作如下首先將實施例1中獲得的含啟動子的T載體擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用)(ba I和BamH I酶切，反應(yīng)體系總體積20 μ 1 含啟動子的T載體約5 μ 1 (1 μ g)、1 X反應(yīng)緩沖液、XbaI 和BamHI各0. 5U，混勻后37°C酶切過夜，瓊脂糖凝膠電泳回收所需片段。pCAMBIA1381z載體酶切體系同上，試劑盒純化回收載體片段。將啟動子片段連入pCAMBIA1381z載 體，連接反應(yīng)回收產(chǎn)物 1 μ 1，pCAMBIA1381z 0. 5μ 1, IU T41igase, IOXbuffer 1 μ 1, 總10 μ 1體積，4 °C連接過夜，構(gòu)建成pCAMBIA1381z-0SGP (圖3)。通過酶切驗證陽性 克隆后電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994， Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6 :271-282) ^ pCAMBIA1381z-0SGP載體導(dǎo)入水稻品種。將獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株不同時期花藥分別進(jìn)行GUS活性染色(Lagarde D等， 1996, Tissue-specific expression of Arabidopsis AKTl gene is consistent with a role in K+nutrition. Plant J. 9，195-203)。染色后材料在體視鏡觀察拍照后，用FAA固定， 切片后在顯微鏡下觀察(Hao PY等，2008Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice :an important mechanism for host resistance. Plant Physiol 146 :1810-1820)。觀察結(jié)果表明，主要在水稻花粉絨氈層顯示為藍(lán)色(圖4)。表明OSGP為花藥絨氈 層特異性表達(dá)的啟動子。
權(quán)利要求
1.一種水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osgl的啟動子0SGP，其為1)SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，且具有相同 功能的核苷酸序列；或3)由SEQID No. 1產(chǎn)生的具有控制基因在花藥絨氈層特異表達(dá)的DNA功能片段。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述DNA功能片段為包含花粉特異相關(guān)的 應(yīng)答元件GTGANTG10、P0LLEN1LELAT5和QELEMENTZMZM13的用以控制基因在水稻花藥絨氈 層特異表達(dá)的DNA片段。
3.含有權(quán)利要求1或2所述啟動子構(gòu)建的表達(dá)盒。
4.含有權(quán)利要求1或2所述啟動子的植物表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其為pCAMBIA1381z-0SGP。
6.權(quán)利要求1或2所述的啟動子OSGP制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
8.權(quán)利要求1或2所述的啟動子OSGP在基因工程培育雄性不育系和恢復(fù)系中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述的啟動子OSGP在基因工程培育水稻雄性不育系和恢復(fù)系中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。從水稻(Oryza Sativa L.)中分離并克隆了一種水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osg1的啟動子(OSGP，即Osg1Promoter)，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，控制該基因在水稻花藥絨氈層特異表達(dá)。啟動子含有GTGANTG10、POLLEN1LELAT52及QELEMENTZMZM13等順式作用元件。本發(fā)明克隆的啟動子可以作為花藥絨氈層特異性表達(dá)的啟動子使用。
文檔編號A01H5/00GK102146404SQ20101062031
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者萬凌琳, 何光存, 杜波, 祝莉莉, 閘雯俊 申請人:武漢大學(xué)