專利名稱：新型巴氏桿菌菌株的制作方法
新型巴氏桿菌菌株相關(guān)專利的交叉引用本申請(qǐng)要求于2009年1月沈日提交的第61/147，174號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，該申請(qǐng)的全部，包括所有的附圖
、表格或圖示。
背景技術(shù)：
據(jù)估計(jì)，目前植物寄生線蟲(chóng)對(duì)世界農(nóng)業(yè)造成的作物損失每年超過(guò)1000億美元。防止這種損害成為一個(gè)重大挑戰(zhàn)。隨著熏蒸劑甲基溴的即將減少，發(fā)展和注冊(cè)用于線蟲(chóng)防治的新的合成化合物已迫在眉睫。植物病原線蟲(chóng)特別地難以控制是因?yàn)樗麄凅w外覆蓋著一層厚厚的、不透水的角質(zhì)層或蟲(chóng)體壁，并且具有極少數(shù)的感官神經(jīng)元。由于許多害蟲(chóng)防治化合物是作為神經(jīng)毒素使用，植物病原線蟲(chóng)暴露于體外的神經(jīng)元的數(shù)量之少使得殺線蟲(chóng)化合物的有效目標(biāo)面積減少，，結(jié)果導(dǎo)致具有極高神經(jīng)毒素性能的殺線蟲(chóng)化合物的開(kāi)發(fā)。此外，因?yàn)橹参锊≡€蟲(chóng)存在于土壤或植物根部，所以將植物病原線蟲(chóng)暴露給防治試劑難以實(shí)現(xiàn)并且由于這些有毒的化合物的使用使得地下水位處于污染的危險(xiǎn)中?；谏窠?jīng)毒素的殺線蟲(chóng)劑的使用已被證明污染地下和地表水。因此，為了公眾健康原因，這些化合物中的許多正從市場(chǎng)上退出。腎形線蟲(chóng)，別名腎線蟲(chóng)(Rotylenchulus reniformis)，是線蟲(chóng)屬中最具經(jīng)濟(jì)重要性的種類。雌性腎形線蟲(chóng)部分地生長(zhǎng)在植物根部?jī)?nèi)，它們對(duì)植物的根系造成重大損害。術(shù)語(yǔ)“腎形的”是指成熟雌性線蟲(chóng)的腎形的身體。腎形還能致使植物對(duì)其他致病有機(jī)體更敏感。腎形線蟲(chóng)寄生于各種植物的根部，包括棉花，豇豆，甘薯，大豆，菠蘿，茶，以及各種蔬菜例如番茄，秋葵，南瓜(squash)，和萵苣(lettuce)。腎形線蟲(chóng)的致病性對(duì)農(nóng)業(yè)影響極大。例如，在美國(guó)路易斯安那州腎形線蟲(chóng)使棉花產(chǎn)量減少40 60%，同時(shí)伴隨著枯萎病 (Fusarium wilt)的增力口。栽種前對(duì)土壤進(jìn)行熏蒸是一種廣泛采用的防治線蟲(chóng)的方法。甲基溴是使用最廣泛的熏蒸劑之一，但由于其具有破壞臭氧性能，被提名停止使用。此外，這種土壤熏蒸法的實(shí)施不加選擇地殺死土壤中的有機(jī)體，面臨著在除去致病有機(jī)體的同時(shí)除去有益微生物的危險(xiǎn)。在世界范圍基礎(chǔ)上，一種有效的、對(duì)環(huán)境有益的殺線蟲(chóng)劑的整體市場(chǎng)份額估計(jì)接近10 億美元。早在1888 年，巴氏桿菌(Pasteuria)首次被 Metchnikoff (Annales de 1' Institut Pasteur2 :165-170)描述為水蚤的一種寄生細(xì)菌。隨后，Cobb描述了一種 Ix ^ ii. Dorylaimus bulbiferous ^ Ei 1 If lif (Pasteuria) (2nd ed. Hawaiian Sugar Planters Assoc. , Expt.Sta. Div. Path. Physiol. Bull. 5 163-195,1906)。細(xì)菌的生命周期開(kāi)始于內(nèi)孢子粘合到土壤中線蟲(chóng)的角質(zhì)層。巴氏桿菌在線蟲(chóng)體內(nèi)增殖，并且經(jīng)過(guò)幾個(gè)已有記錄的形態(tài)學(xué)階段，包括菌絲結(jié)構(gòu)和菌體，最終形成內(nèi)孢子。當(dāng)線蟲(chóng)體解體時(shí)內(nèi)孢子被釋放。細(xì)菌在線蟲(chóng)體內(nèi)的生長(zhǎng)減少或抑制線蟲(chóng)排卵，嚴(yán)重地限制了線蟲(chóng)繁殖的速率。宿主作物的經(jīng)濟(jì)損失通常是由線蟲(chóng)的第一子代造成的，這種損失可以利用巴氏桿菌通過(guò)降低植物根部區(qū)域子代線蟲(chóng)的含量而得到阻止的。盡管巴氏桿菌菌株已經(jīng)在多種線蟲(chóng)種類上生成，例如南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita) [Verdeho,S.禾口 R. Mankau. 1986. Journal of Nematology, 18 :635]禾口花生牛艮結(jié)線蟲(chóng)(Meliodogyne arenaria)[美國(guó)專利US6，919，197]，但是目前為止還沒(méi)有在腎形線蟲(chóng)上觀察到或成功地培育出巴氏桿菌菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的、有利的寄生于腎形線蟲(chóng)的巴氏桿菌菌株。該菌株已由美國(guó)菌種保藏委員會(huì)(American Type Culture Collection)保藏，保藏編號(hào)為ATCC PTA-9643。這些細(xì)菌能夠產(chǎn)生具有獨(dú)特的和有用的性能的內(nèi)孢子，這些內(nèi)孢子能夠附著到線蟲(chóng)上，侵染線蟲(chóng)，在線蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)并再生成孢子，并且殺死腎形線蟲(chóng)和其他植物致病線蟲(chóng)。本發(fā)明還包括所公開(kāi)的巴氏桿菌菌株的突變體，這些突變體本質(zhì)上具有相同的或改進(jìn)的殺線蟲(chóng)性能。突變體的制造程序?yàn)槲⑸镱I(lǐng)域公知技術(shù)。例如，廣泛應(yīng)用紫外線和亞硝基胍達(dá)到突變目的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所列舉的微生物的變體。這些變體可以通過(guò)，例如多核苷酸序列，這些多核苷酸序列與來(lái)自所列舉的分離的微生物的序列有高度同源性來(lái)識(shí)別，除此之外，這些變體與分離的微生物一樣具有期望的防治腎形線蟲(chóng)的生物活性。本發(fā)明進(jìn)一步包括組合物以及組合物防治植物致病線蟲(chóng)的應(yīng)用，所述的組合物包含殺線蟲(chóng)有效量的所公開(kāi)的巴氏桿菌菌株的內(nèi)孢子。在一種實(shí)施方式中，一種植物種子首先用粘附劑處理，該粘附劑能夠粘附巴氏桿菌孢子和/或包含孢子的組合物。這些粘附劑可以是，例如，一種膠和/或一種或多種聚合物或共聚物。粘附劑的例子包括但不限于膠(例如ELMERS 膠)、聚醋酸乙烯酯、硅樹(shù)脂材料、以及天然的無(wú)機(jī)材料(例如硅膠和粘土)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種種子，該種子至少在其部分表面包覆有巴氏桿菌組合物，其中巴氏桿菌組合物包含有效量的用于線蟲(chóng)防治的巴氏桿菌孢子。序列簡(jiǎn)要說(shuō)明SEQ ID NO 1是根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式所得到的細(xì)菌的部分16S rDNA序列。SEQ ID NO 2是根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式得到的細(xì)菌的部分spoIIAB序列。SEQ ID NO :3是根據(jù)本發(fā)明提供的一種實(shí)施方式所得到的細(xì)菌的部分atpA序列。SEQ ID NO 4是根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式所得到的細(xì)菌的部分atpF序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的細(xì)菌新菌株具有防治包括腎形線蟲(chóng)在內(nèi)的植物致病線蟲(chóng)的殺線蟲(chóng)活性。微生物培養(yǎng)物保藏于美國(guó)菌種保藏委員會(huì)(ATCC，10801University Blvd. ,Manassas, Va. 20110-2209)。保藏物于2008年12月4日保藏，已經(jīng)由保藏中心指定ATCC序列登陸號(hào) (accession number)為 PTA-9643。本發(fā)明培養(yǎng)物業(yè)已在確保在本專利申請(qǐng)由專利與商標(biāo)專員根據(jù)37CFR 1. 14和 35U. S. C122條款決定是否授權(quán)的未決期間可以獲得培養(yǎng)物的條件下保藏。當(dāng)本申請(qǐng)的相應(yīng)文件或其后續(xù)申請(qǐng)?zhí)峤坏膰?guó)家的專利法有要求時(shí)，該培養(yǎng)物是可以獲得的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，培養(yǎng)物的可得性不構(gòu)成破壞政府授予的專利權(quán)而實(shí)施本發(fā)明的許可。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)保藏物將根據(jù)微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏并使公眾可得到，即，保藏物將被悉心保藏，以在自最近一次請(qǐng)求提供保藏樣本起至少五年的時(shí)間內(nèi)保持其存活并不受污染，且無(wú)論任何情況下，在自保藏日起至少30年的時(shí)間內(nèi)或在任何可以發(fā)放公開(kāi)培養(yǎng)物的專利的實(shí)施期間保持其存活并不受污染。當(dāng)有請(qǐng)求提供樣本而保藏處由于保藏物的狀態(tài)不能提供時(shí)，保藏者明白其有更換保藏物的責(zé)任。當(dāng)一項(xiàng)公開(kāi)保藏培養(yǎng)物的專利授權(quán)時(shí)，所有對(duì)于公眾獲得培養(yǎng)保藏物的限制將不能撤回地被取消。此處使用的“分離的”是指菌株被從它自然存在的環(huán)境中移走。因此，分離的菌株可以以，例如，一種生物學(xué)上的純培養(yǎng)物，或以與農(nóng)用載體相連的孢子(或其他菌株形式) 存在。此處使用的術(shù)語(yǔ)“包含”進(jìn)一步仔細(xì)考慮這些方案，在這些方案中組合物和/或方
法由或基本上由列舉的組分和/或步驟組成。此處使用的“基本上由......組成”是指下
述情況，該情況下增加的組分和/或步驟只是那些不影響組合物和/或方法的殺線蟲(chóng)活性的組分和/或步驟。此處使用的“殺線蟲(chóng)有效量”是指能夠殺死，防治，或侵染線蟲(chóng)；延遲線蟲(chóng)生長(zhǎng)或繁殖；減少線蟲(chóng)種群；和/或減少由線蟲(chóng)引起的作物損失的巴氏桿菌孢子量。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了巴氏桿菌菌株ATCC PTA-9643和它的突變體。突變體的制備程序是微生物領(lǐng)域公知的技術(shù)。例如，廣泛應(yīng)用紫外線和亞硝基胍來(lái)達(dá)到突變目的。該菌株已經(jīng)被鑒定為新的巴氏桿菌菌株。SEQ ID NOs :1-4是本發(fā)明細(xì)菌的一些基因的多核苷酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有殺線蟲(chóng)活性的巴氏桿菌ATCC PTA-9643的變體。 在一種實(shí)施方式中，一個(gè)“變體”具有一個(gè)多核苷酸序列，其在高嚴(yán)格度條件下與SEQ ID NO 1-4中至少一個(gè)，優(yōu)選2，3或所有的4個(gè)序列雜交?！半s交”是指一個(gè)反應(yīng)，該反應(yīng)中一種或多種多核苷酸反應(yīng)生成一個(gè)復(fù)合體，通過(guò)雙鏈核酸分子(DNA-DNA，DNA-RNA，或RNA-RNA)中一個(gè)特定嘌呤和一個(gè)特定嘧啶之間的氫鍵使該復(fù)合體穩(wěn)定。主要的特定配對(duì)為鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶以及腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶。 各種等級(jí)的雜交嚴(yán)格度均可使用。條件越嚴(yán)格，復(fù)合結(jié)構(gòu)就要求更高的互補(bǔ)性。條件的嚴(yán)格度可以通過(guò)溫度，探針濃度，探針長(zhǎng)度，離子強(qiáng)度，時(shí)間，等等來(lái)控制。優(yōu)選地，雜交是在高嚴(yán)格度條件下通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)實(shí)施的，該技術(shù)描述在， 例如，Keller, G. H.和 Μ. M. Manak 的《DNA Probes))和姐妹篇((DNA Probes =Background, Applications, Procedures》($禾中片反*，二片反，Nature Publishing Group，1993)。 ^ Cold Spring Harbor Laboratory Press 出片反白勺((Molecular Cloning manuals)) 中，包 舌 Sambrook 禾口尺ussell 的〈〈Molecular Cloning :A Laboratory Manual)) (2001)中有廣泛描述。這些出版物中的每一種的整體內(nèi)容通過(guò)引用并入本發(fā)明。用于雜交的高嚴(yán)格度條件的非限制性例子是，在65°C至少約6X SSC和1%SDS，先在約42°C下用含約20% (ν/ν)甲酰胺的0. IX SSC洗滌lOmin，然后在65°C下用0. 2X SSC 和0. 1% SDS洗滌。雜交條件的非限制性例子為低于特定溶液中特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或 25°C。Tm 是取決于離子強(qiáng)度和PH的溫度，在該溫度下50%的目標(biāo)序列雜交得到一個(gè)完全匹配探針。Tffl典型地隨著Na+濃度增加而升高，因?yàn)殁c陽(yáng)離子會(huì)靜電屏蔽核甘酸的磷酸根陰離子，并最小化他們之間的斥力。引入的洗滌可以是約5，10，15，20，25，30min,或更久一次，且如果需要可以增加嚴(yán)格度。Tffl的估算為本領(lǐng)域所公知。例如，熔點(diǎn)溫度可能由下列公式描述(Beltz，G. Α.， ΚΑ. Jacobs,Τ. H. Eickbush,P. Τ. Cherbas,and F. C. Kafatos,Methods of Enzymology,R. Wu, L. Grossman and K. Moldave[eds. ]Academic Press, New York 100:266-285,1983)。Tm = 81. 5°C +16. 6Log[Na+] +0. 41 (% G+C) -0. 61 (% 甲酰胺)-600/堿基對(duì)中的復(fù)合長(zhǎng)度(length of duplex)。一種更準(zhǔn)確的Tm的估算可以通過(guò)最近鄰模型獲得。參見(jiàn)[Breslauer， et al. ， Proc.Natl. Acad. Sci. USA,83 :3746-3750(1986) ] 、 [SantaLucia, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95 1460-1465 (1998)] > 文 ^ [All￡wi&&ffltaLuci￡i， Biochemistry 36 10581-94(1997)]以及[Sugimoto et al.，Nucleic Acids Res.，24 :4501-4505 (1996)]。 Tm也可以根據(jù)常規(guī)方法，通過(guò)在一種精選溶液中采用差示掃描量熱法(Duguid et al., Biophys J，71 =3350-60,1996)，或者采用本領(lǐng)域公知的其他方法，例如紫外監(jiān)測(cè)熔融進(jìn)行測(cè)定。隨著雜交條件的嚴(yán)格度增加，可以獲得更高等級(jí)的同源性?？捎糜阼b定此處所述的DNA序列的存在的典型方法包括但不限于使用特定的寡核苷酸檢測(cè)特定的DNA序列雜交，DNA直接測(cè)序，限制性內(nèi)切酶降解，核糖核酸酶保護(hù)，化學(xué)裂解，以及連接酶介導(dǎo)檢測(cè)法。巴氏桿菌ATCC PTA-9643的變體的一個(gè)例子是一種包含多核苷酸的菌株，該菌株超過(guò)85，90，95，98，或99%的序列與SEQ ID NOS :1_4中任何一個(gè)或全部序列一致。Fl-Atpase 的晶體結(jié)構(gòu)由[Stocker 等，Structure, 15(8) :904-914(2007)]給出， 并且Fl-Atpase的功能已經(jīng)得到了廣泛研究，參見(jiàn)，例如[Itoh等.，“Mechanically driven ATP synthesis by Fl-Atpase, "Nature 427(6973) :407-8 Q004)]，以及其中引用的參考文獻(xiàn)。在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，atpA的變異序列編碼的多肽保留了至少1處，2處，3 處,4處，5處或所有SEQ ID NO :4與來(lái)自分支巴氏桿菌(Pasteuria ramosa)的NCBI gi 93007315的相應(yīng)部分的差異。spoIIAB 蛋白質(zhì)是一種抗-σ 因子。參見(jiàn)[Duncan和 Losick，Proc Natl Acad Sci USA, 90 (6) :2325-2329(1993)] ο 多種晶體結(jié)構(gòu)是可得的。參見(jiàn)[Masuda 等，J Mol Biol, 340(5) :941-956(2004)] ； [Campbell 等，Cell，108 (6) :795-807 (2002) ] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，spoIIAB的變異序列編碼的多肽保留了至少1處，2處，3處，4處，5處或所有 SEQ ID NO :4 與來(lái)自穿刺巴氏桿菌(Pasteuria penetrans)的 NCBI gi 301732 和 / 或來(lái)自分支巴氏桿菌的NCBI gi93007308的相應(yīng)部分的差異。大腸桿菌ATP合成酶b亞基的結(jié)構(gòu)性和功能性數(shù)據(jù)被給出，例如在[Del Rizzo 等，J Mol Biol, 364(4) :735-46(2006)]；和[Claggett 等，J Bacteriol, 189 (15) M63-5471(2007)]。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，atpF的變異序列編碼的多肽保留了至少 1處，2處，3處，4處，5處或所有SEQ ID NO :3與來(lái)自穿刺巴氏桿菌的NCBI gi 41019057和 /或來(lái)自分支巴氏桿菌的NCBI gi93007313的相應(yīng)部分的差異。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，經(jīng)常規(guī)的核糖體序列分析，寄生于腎形線蟲(chóng)的穿刺巴氏桿菌菌株，相比于任何目前已知的巴氏桿菌菌株，從系統(tǒng)發(fā)育上更接近于ATCC PTA-9643(或者，作為一種選擇，相比于任何已知的非腎形線蟲(chóng)寄生的穿刺巴氏桿菌菌株， 更接近ATCCPTA-9643)。多種適用于16s rDNA分析的工具和數(shù)據(jù)是本領(lǐng)域已知的。由“nr” 數(shù)據(jù)庫(kù)的NCBI Blast返回的下列序列登陸號(hào)提供了通過(guò)NCBI標(biāo)識(shí)符(gi number)引用的 16s 核糖體序列:157357381 ； 145690675 ；55168340 ；215499254 ；29169172 ；197777542 ；
153816650；189353846 ；154483090 ；27360487 ；153816533 ；27359371 ；10039641 ；
153816651；153813776 ；169191254 ；77959837 ；223489039 ；224155181 ；197766214 ； 197782632 ；223475320 ；165924309 ；225111262 ；50363539 ；169189407 ；119632772 ； 167630417 ；147836457 ；321193 ；47570202 ；229499565 ；29565682 ；5531888 ；27360062 ； 197763227 ；121592110 ；227495267 ；3256603 ；197781048 ；154500167 ；154500794 ； 150251526 ；197735635 ；153813782 ；167425567 ；212632978 ；15921449 ；218151942 ； 163781875 ；169869672 ；78033426 ；157354103 ；40062645 ；115762746 ；83595848 ； 196018328 ；115379816 ；1780806 ；198417694 ；154500170 ；108707408 ；224033543 ； 223947683 ；226443382 ；237831283 ；195614328 ；194703406 ；212274346 ；149633895 ； 118086080 ；119178984 ；74007189 ；197768010 ；191162148 ；219461701 ；169213810 ； 167630416 ；19927 ；196018322 ；182701819 ；156341374 ；115467400 ；126433538 ； 119190145 ；56422945 ；50545958 ；223466311 ；212507121 ；197762411 ；169194840 ； 192291641 ；152012802 ；3831447 ；67903352 ；3256604 ；171686416 ；158294661 ；154273901 ； 119720343。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，16s rDNA的變異序列編碼的RNA保留了至少1 處，2處，3處，4處，5處，或所有與本段闡述的一種或多種(或任意組合)的16s rDNA的差異。在某些實(shí)施方式中，本段中用NCBI標(biāo)識(shí)符表示的16srDNA可以從請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明中排除。大量的所述的細(xì)菌可以采用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)。孢子形成自細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)階段后期發(fā)生，產(chǎn)生成熟的、休眠孢子。巴氏桿菌內(nèi)孢子在干燥下不受損傷。因此，他們能在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。培育巴氏桿菌的方法為本領(lǐng)域所公知，并且包括，例如在US5，094，954和 US7, 067, 299中描述的方法，前述兩個(gè)專利在整體上通過(guò)引用并入本發(fā)明。本發(fā)明進(jìn)一步提供有益于害蟲(chóng)防治的細(xì)菌內(nèi)孢子組合物。典型的例子是對(duì)線蟲(chóng)有致病性并在活的線蟲(chóng)組織內(nèi)部或表面生長(zhǎng)的細(xì)菌內(nèi)孢子組合物。內(nèi)孢子可以通過(guò)添加表面活性劑，分散劑，惰性載體和其他組分制成可濕性粉劑， 濃縮液體，顆粒劑(granules)或其他制劑，以獲得一種殺線蟲(chóng)組合物，該組合物便于對(duì)特定目標(biāo)線蟲(chóng)的處理和應(yīng)用。商業(yè)成品總是具有高濃度的內(nèi)孢子，典型地超過(guò)Ix IO7個(gè)孢子/ml或g干產(chǎn)品， 優(yōu)選超過(guò)Ix IO9孢子/ml或g干產(chǎn)品。本發(fā)明所述的組合物還可以包括一種或多種下列成分其他殺蟲(chóng)劑，包括僅作用于地下的化合物；殺菌劑，如克菌丹，福美雙，甲霜靈，咯菌腈，惡霜靈，以及這些材料的同分異構(gòu)體，等等；除草劑，包括氨基甲酸鹽、硫代氨基甲酸酯、乙酰胺、三嗪類、二硝基苯胺、甘油醚、噠嗪酮、尿嘧啶、苯氧羧酸類(phenoxys)、尿素和苯甲酸；除草安全劑，如苯并惡嗪、 二苯甲基衍生物、N, N-二烯丙基二氯乙酰胺、各種二鹵代?；?、惡唑烷基和噻唑烷基化合物、乙酮類、萘酐化合物和肟衍生物；肥料；生物防治試劑，如其他選自下列自然產(chǎn)生或重組的細(xì)菌和真菌根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬、木霉屬、球囊菌屬、粘帚霉屬和菌根菌屬。這些制劑和應(yīng)用過(guò)程為本領(lǐng)域公知，且與商業(yè)巴氏桿菌菌株一起使用。殺線蟲(chóng)化合物可以通過(guò)噴霧或涂敷于葉子表面來(lái)防治植物致病線蟲(chóng)。另外一種可以采用的方法是將內(nèi)孢子混入顆粒劑中，非必需地包含一種引誘劑， 并將這些顆粒劑應(yīng)用于土壤以防治土棲線蟲(chóng)。典型地，一接觸水，孢子就從顆粒中釋放，然后孢子附著到線蟲(chóng)上并侵染線蟲(chóng)，孢子接觸并侵染線蟲(chóng)。制劑后的孢子也可以作為種子包衣應(yīng)用于根部處理或植物整體處理。內(nèi)孢子的應(yīng)用量需具備有效殺線蟲(chóng)性。在一種實(shí)施方式中，內(nèi)孢子量少于1夸脫 (quart)/英畝足以有效防治線蟲(chóng)。有利地，所述的組合物易于使用傳統(tǒng)的應(yīng)用設(shè)備進(jìn)行應(yīng)用。內(nèi)孢子的作用方式使抗性演變不大可能發(fā)生。大部分可獲得的殺線蟲(chóng)劑必須在栽種前施加于土壤中，因?yàn)檫@些化學(xué)品會(huì)在其他方面對(duì)植物造成傷害。相比之下，巴氏桿菌菌株不會(huì)對(duì)植物造成傷害，且可以在任意時(shí)間應(yīng)用。本發(fā)明另一個(gè)方面提供了用本發(fā)明的巴氏桿菌組合物處理過(guò)的種子。一種實(shí)施方式提供的種子，至少在種子部分表面面積包覆巴氏桿菌組合物。在一種具體的實(shí)施方式中， 巴氏桿菌處理過(guò)的種子含有的孢子濃度為從約IO6至約IO9個(gè)孢子/粒種子。每粒種子含有的孢子量可以更多，例如1XIO10,1 X IO11或1 X IO12個(gè)孢子/粒種子。本發(fā)明材料和方法可以用于減少植物種類的損害，所述的植物種類包括但不限于，四季豆、草坪草、甘薯、西紅柿、棉花、玉米、大豆、秋葵、萵苣、南瓜小果、蔬菜、菠蘿、茶、 小麥、大麥、稻和油菜(Canola)。下面是實(shí)施例，用以舉例說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的步驟。這些實(shí)施例不應(yīng)理解為是限制性的。所有的百分比是基于重量且所有溶劑混合比是基于體積，除非另有說(shuō)明。實(shí)施例1-種子處理依照本發(fā)明，通過(guò)巴氏桿菌孢子包衣植物種子，巴氏桿菌孢子可以有效傳遞以防治植物致病性線蟲(chóng)。巴氏桿菌孢子可以隨意地包到種子上或，優(yōu)選地，先將巴氏桿菌孢子制成液體或固體組合物，然后包到種子上。例如，可以通過(guò)如下方法制備包含孢子的固體組合物將固體載體與孢子懸浮液混合，直到固體載體在孢子懸浮液中達(dá)到飽和。然后將混合物干燥獲得期望的微粒(particles)。固體載體優(yōu)選顆粒劑。顆粒劑可以是，例如，來(lái)自AXISbW硅藻土顆粒和/或來(lái)自 PROFILEb的綠色度粘土顆粒。各種添加劑，例如粘附劑、分散劑、表面活性劑及營(yíng)養(yǎng)和緩沖成分，也可以包含在載體和孢子懸浮液混合物中。在一種具體的實(shí)施方式中，除孢子外，包衣可以進(jìn)一步包含一層粘附劑層。所述的粘附劑應(yīng)該是無(wú)毒的、生物可降解的，且?guī)д掣叫缘?。這樣的材料包括但不限于，聚醋酸乙烯酯；聚醋酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纖維素，例如甲基纖維素，羥甲基纖維素和羥甲基丙基纖維素；糊精；藻酸鹽；糖；糖蜜；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；蛋白質(zhì)；脂肪；油；阿拉伯膠；明膠；糖漿和淀粉。更多的例子可以在例如美國(guó)專利US7，213，367中找到，該專利的整體內(nèi)容以引用的方式并入本發(fā)明。粘附劑層可以幫助孢子附著在種子表面并阻止可能發(fā)生的脫落。此外，包衣還可以包含其他化學(xué)或生物試劑，所述的化學(xué)或生物試劑與巴氏桿菌孢子結(jié)合對(duì)防治線蟲(chóng)和/ 或其他害蟲(chóng)產(chǎn)生有益效果。包衣還可以包含有助于促進(jìn)種子發(fā)芽、和/或植物生長(zhǎng)和/或健康狀況的肥料和其他成分。因此，本發(fā)明提供了一種在植物種子上形成巴氏桿菌包衣的方法。在一種具體實(shí)施方式
中，所述的方法包括，將含有飽和量的巴氏桿菌孢子的干燥的顆粒混合物與用粘附劑包衣的種子結(jié)合。盡管種子處理方法可以應(yīng)用于任何生理狀態(tài)的種子，但優(yōu)選種子處于足夠堅(jiān)硬狀態(tài)以使處理過(guò)程沒(méi)有損害產(chǎn)生。典型地，從地里收割植物；從植物上取下種子；并且將種子與任何其他非種子植物材料分離。種子優(yōu)選地在一定程度上具有生物學(xué)上的穩(wěn)定性，以使得處理方法不會(huì)對(duì)種子造成生物學(xué)上的損害。在一種具體實(shí)施方式
中，例如，處理方法應(yīng)用于已被收割、清理且干燥至水分含量按重量計(jì)低于約15%的玉米種子。在一種另一種實(shí)施方式中，在用巴氏桿菌孢子處理前或處理過(guò)程中，種子已經(jīng)先被干燥，再用水和/或其他材料預(yù)處理，然后被再次干燥。在上述的限制內(nèi)，處理方法可以在種子收獲和種子播種之間的任意時(shí)間應(yīng)用于種子。此處使用的術(shù)語(yǔ)“未播種的種子”是指包括在種子收獲和出于種子發(fā)芽和植物生長(zhǎng)的目的將種子播種下地之間的任意時(shí)期的種子。此處使用的，當(dāng)提及未播種的種子用包含巴氏桿菌的組合物進(jìn)行處理，，該處理方法并不包括那些將巴氏桿菌應(yīng)用到土壤而非種子的實(shí)施方式。巴氏桿菌孢子典型地以殺蟲(chóng)劑制劑的形式應(yīng)用于種子。這種制劑可以包含一種或多種其他需要的組分，包括但不限于液體稀釋劑，粘結(jié)劑，在應(yīng)力條件下保護(hù)種子的填充劑和增塑劑，以改善包衣的柔韌性、粘附力和/或覆蓋性。此外，可以在制劑中加入干燥劑，如碳酸鈣，高嶺土或膨潤(rùn)粘土，珍珠巖，硅藻土或任何其他的吸附材料。這些組分在種子處理方法中的使用為本領(lǐng)域公知，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利US5，876，739。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，可以容易地從現(xiàn)有技術(shù)中選擇需要的組分用于制劑。本發(fā)明所述的種子也可以用下列一種或多種成分處理其他殺蟲(chóng)劑，包括那些僅作用于地下的化合物；殺菌劑，如克菌丹，福美雙，甲霜靈，咯菌腈，惡霜靈，以及每一種材料的異構(gòu)體，等等；除草劑，包括選自下列物質(zhì)的化合物草甘膦，氨基甲酸酯鹽，硫代氨基甲酸酯，乙酰胺，三嗪類，二硝基苯胺，甘油醚，噠嗪酮，尿嘧啶，苯氧羧酸類(Phenoxys)，尿素和苯甲酸；除草安全劑，例如苯并惡嗪，二苯甲基衍生物，N, N-二烯丙基二氯乙酰胺，各種二鹵代酰基、惡唑烷基和噻唑烷基化合物，乙酮類、萘酐化合物和肟衍生物；肥料；生物防治試劑，如其他自然產(chǎn)生或重組的細(xì)菌和真菌，選自根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬、木霉屬、球囊菌屬、粘帚霉屬和菌根菌屬。這些成分的加入方式可以是作為種子表面單獨(dú)的層膜，或作為選擇，可以作為巴氏桿菌組合物的組成部分。優(yōu)選地，本發(fā)明用于種子處理的新組合物或其他成分的用量不應(yīng)抑制種子萌發(fā)， 或?qū)ΨN子造成植物性毒素?fù)p害。本發(fā)明用于處理種子的制劑可以是懸浮液；乳劑；微粒在水性介質(zhì)(例如水)中形成的漿體；可濕性粉劑；可濕性顆粒劑(干燥易流動(dòng))；和干燥顆粒劑。如果制成懸浮液或漿體，制劑中活性成分的濃度以重量計(jì)優(yōu)選約0. 5%至約99% (w/w)，更優(yōu)選5-40%或由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員制成其他制劑。如上所述，本發(fā)明所述的制劑可以包含其他常規(guī)的無(wú)活性的或惰性的成分。這些惰性成分包括但不限于常規(guī)的粘著劑；分散劑比如甲基纖維素(例如，Methocel A15LV 或Methocel A15C，作為分散劑/粘著劑的組合試劑用于種子處理中)；聚乙烯醇(例 ta Elvanol 51-05)；卵磷脂(例如Yelkinol P)；聚合物分散劑(例如聚乙烯吡咯烷酮 /醋酸乙烯酯PVPIVA S-630)；增稠劑(例如，粘土增稠劑如Van Gel B，用于增加微粒懸浮液的粘度并減少微粒懸浮液的沉淀)；乳劑穩(wěn)定劑；表面活性劑；防凍劑化合物(例如尿素)；染料；著色劑，等等。適用于本發(fā)明的另外的惰性成分可以在McCutcheon' s, vol.1, “ Emulsifiers and Detergents, “ MC Publishing Company, Glen Rock, N. J.，U.S.A.，1996中查到。適用于本發(fā)明的另外的惰性成分可以在McCutcheon' s, vol.2, “ Functional Materials, “ MC Publishing Company,Glen Rock,N. J. ,U. S. A., 1996中查到。本發(fā)明的包衣制劑可以通過(guò)多種方法應(yīng)用于種子，所述的方法包括但不限于在一個(gè)容器(例如一個(gè)瓶子或袋子)中混合，機(jī)械涂覆，攪拌，噴涂和沉浸。根據(jù)本發(fā)明，多種活性或惰性材料可以用于使種子與殺蟲(chóng)劑接觸，所述的活性或惰性材料是例如常規(guī)的薄膜包衣材料，包括但不限于水溶性薄膜包衣材料，如SEP I RET (S印pic，Inc.，F(xiàn)airfield, N. J.)和 0PAC0AT (Berwind Pharm. Services, ffestpoint, Pa.)。本領(lǐng)域公知的種子包衣方法和組合物經(jīng)由本發(fā)明一種實(shí)施方式中的添加物改性后是有用的。這些包衣方法和應(yīng)用的設(shè)備公開(kāi)在，例如，美國(guó)專利US5，918，413，5，891，246, 5，554，445，5，389，399，5，107，787，5，080，925，4，759，945 和 4，465，017 中。種子包衣組合物公開(kāi)在，例如，美國(guó)專禾U US5, 939，356，5，882，713，5，876，739，5，849，320，5，834，447， 5，791，084,5，661，103,5，622，003,5，580，544,5，328，942,5，300，127,4，735，015, 4，634，587，4，383，391，4，372，080，4，339，456，4，272，417 和 4，245，432 等中。本發(fā)明適用的粘結(jié)劑優(yōu)選地包含由一種粘性聚合物組成，所述的粘性聚合物可以是天然的或合成的，且對(duì)被包衣的種子沒(méi)有植物性毒素影響。粘合劑可以選自聚醋酸乙烯酯；聚醋酸乙烯酯共聚物；乙烯醋酸乙烯酯共聚物(EVA)；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纖維素，包括乙基纖維素，甲基纖維素，羥甲基纖維素，羥丙基纖維素和羧甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉，改性淀粉，糊精，麥芽糊精，藻酸鹽和殼聚糖；脂肪；油；蛋白質(zhì)， 包括明膠和玉米蛋白；阿拉伯膠；蟲(chóng)膠；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木質(zhì)素磺酸鈣； 丙烯酸共聚物；聚乙烯丙烯酸酯；聚環(huán)氧乙烷；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚羥乙基丙烯酸酯；甲基丙烯酰胺單體；和聚氯丁烯。種子處理中使用的巴氏桿菌的量根據(jù)種子類型和活性成分的類型變化，但是處理方法包括使種子與用量可以有效殺蟲(chóng)的巴氏桿菌接觸。此處使用的有效殺線蟲(chóng)的量是指巴氏桿菌的用量可以殺死線蟲(chóng)，或?qū)⒁回灥販p少或延遲線蟲(chóng)造成的損害量。處理方法所用的殺蟲(chóng)劑必須不會(huì)抑制種子萌發(fā)，且在會(huì)對(duì)種子或植物造成損害的線蟲(chóng)生命周期內(nèi)應(yīng)能有效地保護(hù)種子和/或植物。一般，包衣在播種后約Ih到120天內(nèi)有效。殺蟲(chóng)劑形成的包衣優(yōu)選的類型是能夠使殺蟲(chóng)劑通過(guò)擴(kuò)散或運(yùn)動(dòng)緩慢地從基體釋放到周圍介質(zhì)中。
除包衣層外，種子可以用下列一種或多種成分處理其他殺蟲(chóng)劑，包括殺菌劑和除草劑；除草安全劑；肥料和/或生物防治試劑。這些成分可以作為單獨(dú)的層加入或可供選擇地添加于殺蟲(chóng)劑包衣層中。殺蟲(chóng)制劑可以采用多種技術(shù)和機(jī)器應(yīng)用于種子，如流化床技術(shù)，滾壓方法， rotostatic種子處理器(rotostatic seed treater)和鼓輪包衣機(jī)。其他方法，如噴動(dòng)床 (spouted beds)也可以是有用的。種子在包衣前可以被預(yù)先測(cè)量尺寸。包衣后，典型地，種子被干燥，然后被輸送到尺寸測(cè)量器測(cè)量尺寸。這些過(guò)程為本領(lǐng)域公知。巴氏桿菌處理后的種子可以再包覆一層薄膜外覆層用以保護(hù)包衣。這種外覆層為本領(lǐng)域公知，且可以使用流化床和鼓輪薄膜包衣技術(shù)涂覆。在本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式中，巴氏桿菌孢子可以采用固體基質(zhì)引發(fā)引到種子上。例如，將一些巴氏桿菌孢子與一種固體基質(zhì)材料混合，然后將種子放入與固體基質(zhì)材料接觸一段時(shí)間使殺蟲(chóng)劑能夠被引到種子上。然后，任選地種子可以從固體基質(zhì)材料分離出來(lái)并儲(chǔ)存或使用，或者固體基質(zhì)材料與種子的混合物可以直接儲(chǔ)存或種植。本發(fā)明適用的固體基質(zhì)材料包括聚丙烯酰胺，淀粉，粘土，二氧化硅，氧化鋁，土壤，沙，聚脲，聚丙烯酸酯， 或者可以吸收或吸附殺蟲(chóng)劑一定時(shí)間并釋放殺蟲(chóng)劑到種子內(nèi)或種子上的任何其他材料。確定殺蟲(chóng)劑和固體基質(zhì)材料彼此相適應(yīng)是有益的。例如，應(yīng)當(dāng)選擇固體基質(zhì)材料使其能夠以合理的速率釋放殺蟲(chóng)劑，例如在若干分鐘、若干小時(shí)或若干天的時(shí)間內(nèi)釋放完畢。與細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體不同，巴氏桿菌孢子不會(huì)受到干燥的損害，他們可以在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是干燥和其他在包衣方法中使用的苛刻步驟可以應(yīng)用于本發(fā)明的種子包衣，且不會(huì)明顯降低孢子的有效性。本發(fā)明種子的保存期限長(zhǎng)，在種植時(shí)間安排上允許有變化。此外，在運(yùn)輸和一旦播種下地的期間，巴氏桿菌孢子的存活率要比細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體高得多。一般而言，孢子的有效量范圍是從約1 X IO5至1 X IO12 (或更多)個(gè)孢子/粒種子。 優(yōu)選，孢子濃度為約IX IO6至IXlO9個(gè)孢子/粒種子。在一種實(shí)施方式中，為獲得顆?；旌衔?，巴氏桿菌孢子與顆粒劑的比例為約 3 X IO7至5 X IO7個(gè)孢子/g顆粒劑。在一種具體的實(shí)施方式中，約3 5ml含有約2 X IO7 個(gè)孢子/ml緩沖液的巴氏桿菌孢子懸浮液加入到約2g顆粒劑中。比例隨顆粒的類型而定。 例如，約5ml孢子懸浮液可以應(yīng)用于2g AXIS 顆粒劑，而約3ml孢子懸浮液優(yōu)選對(duì)應(yīng)同樣數(shù)量的PROFILE 顆粒劑。粘附劑可以是與種子和土壤生物適合的任何商業(yè)膠，例如包含聚醋酸乙烯酯的艾爾默透明培養(yǎng)膠(Elmer，s clear school glue)。如果孢子產(chǎn)于線蟲(chóng)宿主內(nèi)，可以額外加一個(gè)熱處理步驟以殺死線蟲(chóng)。熱處理步驟可以在孢子懸浮液與顆粒劑混合前應(yīng)用于孢子懸浮液。可供選擇地，該步驟可以在顆?；旌衔镄纬珊髴?yīng)用。此處提及或引用的所有專利，專利申請(qǐng)書(shū)，臨時(shí)申請(qǐng)和公開(kāi)出版物通過(guò)引證的方式整體納入本文中，包括所有的圖示和表格，在一定程度上它們與本說(shuō)明書(shū)的明確教導(dǎo)并不沖突。需要明確的是此處所描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅僅是為了解釋說(shuō)明的目的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員據(jù)此可提出各種修改或變化，且這些都將包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離的巴氏桿菌菌株，保藏于ATCC，ATCC序列登錄號(hào)為PTA-9643，或所述菌株為具有殺線蟲(chóng)活性的保藏菌株的突變體或變體。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的巴氏桿菌菌株，其中菌株為所述保藏菌株的變體，其中所述的變體的多核苷酸序列至少90%與SEQ ID NOS :1_4中的一個(gè)一致。
3.如權(quán)利要求2所述的分離的巴氏桿菌菌株，其中所述的變體的多核苷酸序列至少 95%與 SEQ ID NOS :1_4 中的一個(gè)一致。
4.如權(quán)利要求3所述的分離的巴氏桿菌菌株，其中所述的變體的多核苷酸序列至少 95%與序列SEQ ID NOS :1_4中的每一個(gè)一致。
5.如權(quán)利要求1所述的分離的巴氏桿菌菌株，其保藏于ATCC，ATCC序列登陸號(hào)為 PTA-9643。
6.如權(quán)利要求1所述的分離的巴氏桿菌菌株，其具有防治腎形線蟲(chóng)活性。
7.一種殺線蟲(chóng)組合物，包含殺線蟲(chóng)有效量的權(quán)利要求1所述的巴氏桿菌菌株，和一種農(nóng)用載體。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的載體是一種種子處理劑。
9.一種防治線蟲(chóng)的方法，其中所述的方法包括使線蟲(chóng)與殺線蟲(chóng)有效量的權(quán)利要求1所述的巴氏桿菌菌株接觸。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的線蟲(chóng)為腎形線蟲(chóng)。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，用于保護(hù)作物，所述的作物選自四季豆、草坪草、甘薯、 西紅柿、棉花、玉米、大豆、秋葵、萵苣、南瓜小果、蔬菜、菠蘿、茶、小麥、大麥、稻和油菜。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的作物為棉花。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的巴氏桿菌菌株應(yīng)用于土壤以防治土棲線蟲(chóng)。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的巴氏桿菌菌株在種植前或種植過(guò)程中應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的巴氏桿菌菌株作為種子包衣應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的且有益的巴氏桿菌菌株，該巴氏桿菌菌株對(duì)于腎形線蟲(chóng)具有殺線蟲(chóng)活性。本發(fā)明提供了被稱為ATCC PTA-9643的新細(xì)菌培養(yǎng)物及其突變體。還提供了包含巴氏桿菌菌株或其突變體或變體的殺線蟲(chóng)組合物和用于處理植物致病性及土棲線蟲(chóng)的方法。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102317434SQ201080005264
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月26日
發(fā)明者J·P·沃特斯, T·E·休利特 申請(qǐng)人:巴斯德生物科學(xué)有限公司