專利名稱：含有絲狀真菌的顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物健康產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及以工業(yè)水平生產(chǎn)在水中高度可分散且含有植物健康劑(特別是食線蟲真菌)的顆粒的方法。本發(fā)明還包括因此而獲得的水可分散顆粒。
背景技術(shù)：
多年來已知的是，攻擊幾乎所有類型農(nóng)作物的植物寄生線蟲每年造成的損失全球總計約5億美元。由于植物寄生線蟲對化學(xué)處理具有極強的耐受性，它們的破壞意味著要使用選擇性差且一般對自然環(huán)境有害的產(chǎn)品。從1992年在里約熱內(nèi)盧舉行的地球峰會開始，且根據(jù)最近的生物環(huán)境法，逐年禁止多種常規(guī)的殺線蟲劑，使得取決于氣候區(qū)域和農(nóng)作物，農(nóng)民對于可能多少有些變得嚴(yán)重的問題得不到保護。因此，更關(guān)注于替代方法或有機方法，這意味著不使用常規(guī)化學(xué)殺蟲劑。然而，為了得到發(fā)展，“有機”控制方案的這些方法不僅需要證明它們自身的效力，而且它們對于農(nóng)民來說還必須如常規(guī)產(chǎn)品那樣易于實際實現(xiàn)。在有機殺蟲劑方法中，拮抗微生物的使用在實際中變得越來越普通。例如，已知有基于細菌(即，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis))擴散的抗蚊處理。類似的，可以使用蠟蚧輪枝菌(Verticillium leucanii)幼蟲的寄生真菌的孢子來控制影響蔬菜作物的粉風(fēng)，如溫室白粉風(fēng)(Trialeurodes vaporariorum)。絲狀真菌(半知菌類，一般被稱為霉菌)的特征在于通常透明的、直徑在微米范圍內(nèi)的薄管狀結(jié)構(gòu)(菌絲)；菌絲整體形成菌絲體；它們通過分生孢子無性繁殖。屬于叢梗孢科(Moniliales)的一些絲狀真菌(特別是圓錐節(jié)叢孢菌(Arthrobothrys conoides Dreschsler))已證明對線蟲有用它們以食用線蟲為生，從而為具有這些寄生蟲的土壤消為了有效利用絲狀真菌，必須獲得含有高真菌數(shù)且易于控制和向土壤施用的穩(wěn)定制劑。然而很不幸，這些真菌(特別是食線蟲真菌)的生產(chǎn)和儲存技術(shù)仍是經(jīng)驗性的，且到目前為止所獲得的結(jié)果仍不完全令人滿意。專利申請No. W0-A-2005078067記載了用于絲狀真菌生長的有效培養(yǎng)基，但是并沒有指明配制和/或施用的具體方法。專利申請GB-A-857161記載了用食線蟲真菌培養(yǎng)物進行表面處理的無機載體(浮石、蛭石、石棉絨)的制備。美國專利US 5，811，092說明了用食線蟲真菌培養(yǎng)物對玉米粒進行表面處理；經(jīng)如此處理的玉米與小部分土壤混合以形成接種物并將后者分布到要處理的土壤中；該方法一般是有效的，但是所述玉米粒的真菌數(shù)的變化相當(dāng)大，且在土壤中的施用極少是均一的。專利申請No. US 2007/0292932說明了適合對土壤施用的、含有食線蟲真菌的膠凝顆粒的制備；然而，這些顆粒的制備、儲存和處理相當(dāng)復(fù)雜。此外，現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品在水中極少是可分散的，且需要以固體形式分散在土壤中；這些固體顆粒保持在表面中，且不能使真菌適當(dāng)?shù)卮┩傅酵寥栏畹膶又?；只有以土壤進一步運動動作(犁耕)為代價才能實現(xiàn)所述穿透。因此，不考慮上述發(fā)展，到目前為止已確定的產(chǎn)品無一完全令人滿意。具體的困難在于提供干燥的顆粒產(chǎn)品(其因此易于儲存和控制)，所述產(chǎn)品在水中具有高分散性并且確保培養(yǎng)物具有十分令人滿意的存活性，后兩種條件在干燥條件下是不利的。本發(fā)明基于用于以工業(yè)水平以能夠確保穩(wěn)定性、存活性和易用性的干燥顆粒形式生產(chǎn)絲狀真菌(更特別的是食線蟲真菌)的方法。具體地，本發(fā)明使得能夠獲得具有高真菌數(shù)、易于控制和向土壤施用、能夠在經(jīng)處理表面上發(fā)揮高的、均一的殺線蟲劑活力的組合物；所述組合物可通過簡單、廉價且對菌絲體存活性無害的制備方法獲得。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明說明了用于將絲狀真菌摻入到特定固相制劑中的方法，特別地，該特定固相制劑經(jīng)研究能夠?qū)⒄婢唵?、均一并且有效地施用到土壤中。本發(fā)明基于對絲狀真菌培養(yǎng)物的處理，其導(dǎo)致獲得具有高真菌數(shù)并且易于在水中分散的干燥顆粒。所述處理包括在將培養(yǎng)基接種絲狀真菌之后與生粉和改性淀粉混合。然后，將所得的產(chǎn)物與特定填料和可能的營養(yǎng)素以適合于形成易于成粒的糊狀物的比例混合；回收通過已知技術(shù)本身可獲得的顆粒并將其干燥至確定的含水量，該含水量一般在5至15%之間。因此，所獲得的顆粒產(chǎn)品特別適合于保護菌絲體的存活性，在觸摸時是干燥的，易于由操作員控制并且在水中是高度可分散的。更具體而言，該方法包括以下步驟a)在適合的液體培養(yǎng)基中使絲狀真菌生長確定的一段時間；b)將a)的產(chǎn)物與生粉和改性淀粉混合；c)將b)的產(chǎn)物與適合的填料和可能的營養(yǎng)素混合以獲得可成粒的糊狀物；d)形成顆粒，將顆?；厥?，然后將其干燥，從而將顆粒的含水量降至5至15%之間的值。本發(fā)明的另一個目的在于上述顆粒產(chǎn)品，其具體地包含b)點中所使用的組分。本發(fā)明還包括包含上述顆粒產(chǎn)品的殺線蟲劑組合物，以及上述產(chǎn)品用于處理被線蟲所感染的土壤和/或培養(yǎng)物中的用途。


圖1示出作為參考的在先技術(shù)的顆粒懸液(右側(cè))和本發(fā)明的可分散顆粒懸液 (左側(cè))的攪拌之間的比較。
具體實施例方式本發(fā)明可以應(yīng)用于所有通常已知的絲狀真菌；有利的是，所使用的真菌為殺線蟲真菌，屬于(例如)叢梗孢科(Moniliales)；在該科中特別優(yōu)選的是節(jié)叢孢屬 (Arthrobotrys)圓錐節(jié)叢孢種(conoides)的真菌，特別是圓錐節(jié)叢孢菌(Arthrobotrys conoides Dreschsler)。絲狀真菌培養(yǎng)基可以選自本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基。根據(jù)一優(yōu)選實施方式，絲狀真菌培養(yǎng)基包含選自糖蜜、麥芽浸膏、蔗糖的至少一種碳源和選自酵母浸膏和所謂“玉米漿”的至少一種有機氮源。在專利申請W0-A-2005078067中廣泛說明了該培養(yǎng)基的制備，該專利申請通過弓I用并入本文。在該培養(yǎng)基中，碳源優(yōu)選占培養(yǎng)基干重的70至85重量％，而上述有機氮源占培養(yǎng)基干重的15至30重量％。該培養(yǎng)基還可以包含由硝酸鹽或銨鹽組成的無機氮源。在一般情況下，這種無機氮源在真菌生長期間逐漸加入到培養(yǎng)基中，該無機氮源的量不超過培養(yǎng)基干重的10重量％ (優(yōu)選5至8重量％之間)。第一優(yōu)選的培養(yǎng)基由75-85%的麥芽浸膏和15_25 %的酵母浸膏組成，該百分比是基于培養(yǎng)基干重的按重量計所給出的。另一種可用的培養(yǎng)基包含60-65%的糖蜜、 10-15%的蔗糖、10-15%的玉米漿和10-15%的酵母浸膏。另外，這種培養(yǎng)基還含有5_8% 的無機氮源，特別是磷酸氫二銨。最后一種優(yōu)選的培養(yǎng)基含有兩種碳源，即25-30%之間的麥芽浸膏和40-45%之間的糖蜜以及25-30%之間的玉米漿。麥芽浸膏是通過發(fā)芽的谷類(一般為大麥)所獲得的。當(dāng)發(fā)芽時，會產(chǎn)生酶，特別是會產(chǎn)生淀粉酶，其使得淀粉轉(zhuǎn)化為糖。麥芽浸膏含有約60%的麥芽糖、維生素及其它多種少量元素。糖蜜是制糖業(yè)的副產(chǎn)品，并且為粘稠棕黑色液體的形式，其含有10%的水、35% 的蔗糖、20%的其它糖類和15%的灰分。酵母浸膏是通過釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的自溶作用獲得的，并且為淺黃色細粉的形式，其易溶于水。酵母浸膏含有肽、 游離氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基以及水溶性維生素B類。酵母浸膏的總氮含量為10%，α-胺氮含量為5%。玉米漿是通過在50°C下在含有二氧化硫的水中浸漬玉米24-48小時所獲得的。二氧化硫試劑使得能夠?qū)@玉米粒的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合并具有在浸漬期間防止不希望有的微生物發(fā)展的優(yōu)勢。玉米漿的總氮含量為7%，α胺氮含量為1.7%并且還含有5%的糖、 4 %的鉀、3 %的磷和17 %的礦物質(zhì)。在根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，優(yōu)選在23至30°C的恒定溫度下，使絲狀真菌在上述培養(yǎng)基中生長5-10天的時間。為了生產(chǎn)所述顆粒，制備由改性淀粉和生粉組成的混合物。在該混合物中，改性淀粉優(yōu)選占按重量計30-60% (更優(yōu)選地為33%)，而生粉即剩余的70-40% (更優(yōu)選地為67% )，這些百分比指的是干物質(zhì)。優(yōu)選的改性淀粉為純膠 (Cleargum,辛烯基琥珀酸淀粉鈉)，它是通過蠟質(zhì)玉米淀粉的酶催化水解所獲得的產(chǎn)物。所述生粉可以是任何谷類粉或其它淀粉性產(chǎn)品；優(yōu)選為玉米粉。在所述混合物與培養(yǎng)基混合前，在沸水中以40-60%的重量比(更優(yōu)選是相對于水52%的重量比)對所述混合物進行適當(dāng)?shù)叵♂?。例如，IOOg溶于沸水中的物質(zhì)由17g改性淀粉、35g生粉和48g水組成。冷卻后，向該第一混合物中優(yōu)選以1 1的體積比添加上述培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基中先前已接種了絲狀真菌并使其生長。然后，向所得溶液中加入適合的填料和可能的營養(yǎng)素，它們與配方中的其它物質(zhì)一起賦予真菌穩(wěn)定性和營養(yǎng)，并且使得能夠獲得具有所需一致性和體積的顆粒。優(yōu)選地，所述填料為硅藻土，并且所述營養(yǎng)素選自面粉和糖。優(yōu)選的填料為 Celaton FPM 0. 08，其為基于顆粒尺寸約0. 08微米的硅藻殼體(單細胞二氧化硅藻)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品能夠吸收限定量的水，從而使得能夠獲得具有所需體積的顆粒，因此保護微生物抵抗可能的外部侵襲(溫度變化、濕度等)。在可用作營養(yǎng)素的面粉當(dāng)中，優(yōu)選玉米粉。這是能夠吸收比自身體積大幾倍的水量的天然產(chǎn)品，并且在特定的情況下，它還有助于構(gòu)成顆粒的體積。此外，玉米粉是顆粒中所含絲狀真菌的重要營養(yǎng)源并且當(dāng)分散到要處理的土壤中時，它是立即可用的。糖有助于提高真菌的存活性，具體地，有助于穩(wěn)定細胞膜。在本發(fā)明的方法目的中，將上述的填料和可能的營養(yǎng)素加入到b)點所形成的混合物中。當(dāng)僅使用填料時，所述填料優(yōu)選為硅藻土。當(dāng)填料與營養(yǎng)素一起使用時，優(yōu)選使用硅藻土和面粉的混合物，其中可以加入少量的糖。優(yōu)選的混合物是由按重量計30-50% (特別是33%)的填料和剩余70-50% (特別是67%)的面粉組成的。如果使用糖，則糖相對于填料和面粉的混合物一般以按重量計10-20%之間的量存在。將填料和可能的營養(yǎng)素以混合形式或單獨地加入到b)點所述的混合物中直至獲得緊密的糊狀物。優(yōu)選地，在所述糊狀物中，在c)點使用的填料和可能的營養(yǎng)素的混合物按重量計占15%至50%。例如，將34g填料和營養(yǎng)素的混合物加入到IOOg于b)點所述的混合物中。一般地，如此獲得的糊狀物的含水量在30至60%之間的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在35至 55%之間，更優(yōu)選地為約47%。因此，對所得混合物進行常規(guī)成粒處理，如(例如)擠出，從而獲得了直徑尺寸優(yōu)選地在3至5mm的顆粒。在顆粒干燥前，顆粒的含水量與糊狀物的基本相同?？梢栽跓o菌氣流中、在25-30°C的溫度下進行顆粒干燥。干燥后，含水百分比降低至低于13%的值，優(yōu)選地在9至10%的范圍內(nèi)。通過這種方式，所述顆粒達到所需的一致性和體積。本發(fā)明包括由上述方法獲得的顆粒產(chǎn)品。這種產(chǎn)品為顆粒形式，觸摸時干燥，并且特別地，其特征在于含有一種或多種絲狀真菌、步驟b)中所述的改性淀粉和生粉，以及步驟c)中所述的適當(dāng)填料和可能的營養(yǎng)素。所述顆粒產(chǎn)品可以照這樣使用，或根據(jù)本身已知的方法與其它常規(guī)成分一起配制；所得的殺蟲劑組合物等同地構(gòu)成了本發(fā)明的目的。最后，本發(fā)明擴展至上述產(chǎn)品用于處理被對絲狀真菌敏感的線蟲或其它寄生蟲感染的基底中的用途。本發(fā)明存在多種優(yōu)勢，這些優(yōu)勢羅列如下。對于生產(chǎn)-操作次數(shù)低，這使得能夠保持該過程的無菌性；-考慮到起始來源中的含水量已經(jīng)很低，所以干燥快速；-高度可分散的產(chǎn)品，這使得能夠更好地評價微生物含量；-保護微生物活力的工藝。對于用戶-高度可分散的制劑使得實現(xiàn)不同的用途撒在裸露的土壤上，另外有利地，可以加入到灌溉系統(tǒng)中；-將產(chǎn)品加入到灌溉用水中，消除了分散殺線蟲劑所需的額外處理；液體產(chǎn)品均勻地分散在表面上，并且有利地，還分散在土壤更深的層中，而不需要用于移動土壤的耕犁或其它操作；-在環(huán)境溫度中，在輕微攪拌下快速在水中發(fā)生分散(在幾秒內(nèi))；-低含水量的顆粒制劑產(chǎn)生易于用戶操作、接觸時干燥、可流動、易于從加料斗裝卸等并且對容器壁不具有顆粒粘附性的產(chǎn)品。出于說明性和非限制性目的提供本發(fā)明的下列實施例，所述實施例是使用叢梗孢科(Moniliales)的絲狀真菌、特別是使用圓錐節(jié)叢孢菌(Arthrobotrys conoides Dreschsler)絲狀真菌制備的。實驗部分實施例1在含有1. 2升培養(yǎng)基的2升反應(yīng)器中獲得絲狀真菌培養(yǎng)物。該反應(yīng)器是由配備了螺旋攪拌器、溫度調(diào)節(jié)器和冷卻器、進氣口以及用于檢測PHW2濃度和溫度的探頭的圓底容器組成的。在接種圓錐節(jié)叢孢(A. conoides)真菌分生孢子前，對由20g/l的麥芽浸膏和4g/ 1的酵母浸膏所組成的裝置滅菌。在約27°C的溫度下，將該培養(yǎng)物在接種后保持6天。在培養(yǎng)期間，對培養(yǎng)基采樣以確定干重(g/Ι)，并因此確定繁殖體的數(shù)目(CFU/1)。為了確定干重，將20ml培養(yǎng)基過濾，然后在烘箱中在100°C下干燥M小時。對Iml培養(yǎng)基確定繁殖體的數(shù)目。在指定的時間段結(jié)束時獲得了約8g/l的真菌，其繁殖體數(shù)目等于每升6ΧΙΟ9。將含有純膠(Cleargum)和玉米淀粉(1 1的重量比)的混合物以按重量計
的濃度分散在沸水中。冷卻后，以與先前加入的水相同的比例加入含有真菌的培養(yǎng)基。然后，相對于該第一混合物以按重量計的量將Celaton FPM0. 08加入到如此獲得的混合物中，直至獲得緊密的糊狀物。通過刮刀將該糊狀物引入到注射器中，然后以固定的量分散到鋁箔上。在最大30 V的氣流下干燥數(shù)分鐘后，產(chǎn)品的含水百分比等于7. 9 %，并且顆粒自由地與鋁箔分離。在9ml無菌水和幾種稀釋劑中引入顆粒后，有可能確定顆粒所含的繁殖體數(shù)目， 其等于8 X IO3CFU/顆粒(關(guān)于五個顆粒確定值的算術(shù)平均數(shù))，對應(yīng)于50 %的存活百分比。 對于本文所述的方法類型來說，該百分比被認為是非常令人滿意的。實施例2使用實施例1的同一真菌培養(yǎng)物進行了對該實施例的測試，但是改變了配方的比例。將含有18%純膠(Cleargum)和36%玉米淀粉的混合物在適量的沸水中混合從而形成了 45%的總混合物。冷卻后，以與先前所加入水的量相等的量加入含有真菌的培養(yǎng)基。然后，以相對于該第一混合物按重量計25%的量，將Celaton FPM 0. 08加入到如此獲得的混合物中，直到獲得緊密的糊狀物。在30°C的氣流中干燥幾分鐘后，產(chǎn)品的水分百分比等于 8.8%。在9ml無菌水和幾種稀釋劑中溶解顆粒后，可以確定顆粒中所含的繁殖體數(shù)目。繁殖體數(shù)目為IXlO4CFU/顆粒，相當(dāng)于66%的存活百分比。對于本文所述類型的方法來說， 該百分比被認為是最佳的。實施例3本實施例的測試基于實施例1的同一真菌培養(yǎng)物，但是改變了配方中的比例。含有16%純膠(Cleargum)和31. 5%玉米淀粉的混合物與52. 5%的沸水混合。冷卻后，以與先前所加入水的量相等的量加入含有真菌的培養(yǎng)基。然后，以相對于該第一混合物按重量計45%的量，將由玉米淀粉和46% CelatonFPM 0. 08組成的混合物加入到如此獲得的混合物中，直至獲得緊密的糊狀物。在30°C下在氣流中干燥幾分鐘后，所得產(chǎn)品的濕度百分比等于9%。在9ml無菌水和幾種稀釋劑中溶解顆粒后，可以確定顆粒中所含的繁殖體數(shù)目， 其等于1.2X IO4CFU/顆粒，相當(dāng)于83%的存活百分比。對于本文所述類型的方法來說，該百分比被認為是高的。在18至25°C之間的溫度下，在塑料容器中儲存一個月后，存活百分比(與顆粒制備后立即觀察到的繁殖體數(shù)目相比的繁殖體數(shù)目)仍很高，大約為95%。實施例4通過磁力攪拌器，在500rpm的輕微攪拌條件下攪拌5分鐘，將150g實施例3中獲得的顆粒產(chǎn)品在環(huán)境溫度下分散到IOOOml水中。同時，在相同條件下處理150g根據(jù)US2007/(^^932(參考文獻)的實施例1所獲得的膠狀顆粒。在攪拌結(jié)束時，目視觀察兩溶液以評價產(chǎn)品的溶解狀況。從圖1可以清楚地看出，參考膠狀顆粒1仍是完整的、不溶解的并且沉積在溶液底部；相反，本發(fā)明實施例3 的顆粒2完全分散。(圖1)。
權(quán)利要求
1.一種制備含有絲狀真菌的顆粒的方法，該方法包括a)將絲狀真菌培養(yǎng)物與至少一種改性淀粉和生粉混合；b)將填料和可能的營養(yǎng)素加入到a)的產(chǎn)物中，從而獲得隨后會進行成粒和干燥的糊狀物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述絲狀真菌屬于叢梗孢科，優(yōu)選為圓錐節(jié)叢孢菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有一種或多種碳源和/或氮源，所述碳源和/或氮源優(yōu)選地選自麥芽浸膏、酵母浸膏、糖蜜、蔗糖、玉米漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所述改性淀粉為純膠，所述生粉為玉米粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述改性淀粉和所述生粉以30 70至60 40 之間的重量比存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的方法，其中步驟b)中加入的所述填料為硅藻土，而所述可能的營養(yǎng)素選自一種或多種面粉和糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中在步驟b)中，向a)中所得的混合物中添加重量比在30 70至50 50之間的填料和面粉的混合物，并且任選地加入糖，從而獲得了含水量在30至60%之間、優(yōu)選在35至55%之間的糊狀物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的方法，其中將步驟b)中所得的顆粒干燥至含水百分比低于 13%，優(yōu)選在9至10%之間。
9.一種顆粒產(chǎn)品，包含一種或多種絲狀真菌、至少一種改性淀粉、至少一種生粉、適合的填料和可能的營養(yǎng)素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的顆粒產(chǎn)品，其中所述改性淀粉為純膠，所述生粉為玉米粉， 并且所述填料為硅藻土，所述可能的營養(yǎng)素以糖為代表。
11.根據(jù)權(quán)利要求9-10所述的顆粒產(chǎn)品，其中所述絲狀真菌屬于叢梗孢科，優(yōu)選地為圓錐節(jié)叢孢菌。
12.通過權(quán)利要求1-8中所述的方法獲得的顆粒產(chǎn)品。
13.殺蟲劑組合物，包含如權(quán)利要求9-12中所述的產(chǎn)品。
14.如權(quán)利要求9-13中所述的產(chǎn)品或組合物在處理由對絲狀真菌敏感的線蟲或其它寄生蟲所感染的基底中的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中將所述產(chǎn)品或組合物分散在液體媒介中并通過噴霧施用到所述基底上。
全文摘要
在制備含有絲狀真菌的顆粒的方法中，將絲狀真菌培養(yǎng)物與至少一種改性淀粉和生粉混合，然后將填料和可能的營養(yǎng)素加入到所得的產(chǎn)物中，從而獲得了隨后會進行成粒和干燥的糊狀物。
文檔編號A01N25/14GK102316742SQ201080008262
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者伊麗莎白·潘喬德-米拉貝爾 申請人:烏里阿·卡薩勒有限公司