專利名稱：甘露糖特異性凝集素前體中包含的信號肽、編碼該信號肽的核酸、以及該信號肽和該核酸 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具有殺昆蟲作用且特異性識別甘露糖的凝集素的基因。具體地，本發(fā)明涉及薯蕷(山藥(Dioscorea batatas))的甘露糖特異性凝集素的基因的信號肽、編碼該信號肽的DNA、和利用它們控制昆蟲害蟲的方法。
背景技術(shù)：
凝集素是特異性地識別糖并與其可逆地結(jié)合的蛋白。它們見于寬范圍的生物物種，諸如動物、植物、真菌和細菌。還已經(jīng)研究了凝集素的生理活性。例如，已經(jīng)研究凝集素與血型、癌細胞、淋巴細胞有絲分裂發(fā)生、病毒和細胞毒性有關(guān)(非專利文獻I)。此外，已經(jīng)報道了通過向植物引入編碼具有針對昆蟲害蟲的殺昆蟲活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株的凝集素的基因來產(chǎn)生具有增強的抗昆蟲性的重組植物的技術(shù)(專利文獻I)。已知植物來源的凝集素有效地用于昆蟲害蟲控制。稱為甘露糖結(jié)合凝集素的GNA從觀葉植物諸如雪滴花(雪花蓮(Galanthus nivalis))的花球克隆，用于經(jīng)由引入基因到馬鈴薯、番茄、稻等等來產(chǎn)生重組植物。已知這些植物具有抗昆蟲性(非專利文獻2和3)。例如，在植物來源的凝集素的情形，已經(jīng)報道了編碼來自薯蕷的甘露糖特異性凝集素DBl蛋白的總氨基酸序列的DNA序列(專利文獻2)。已經(jīng)報道，這一 DNA序列編碼成熟蛋白的總氨基酸序列，且將此前報道的編碼DBl基因的DNA序列引入煙草(非專利文獻4)。此外，已經(jīng)報道，將此前報道的編碼DBl基因的DNA序列引入稻(非專利文獻5和6)。DBl蛋白是貯藏蛋白。因此，預(yù)測從mRNA翻譯的DBl蛋白前體包括易位信號。然而，這樣的易位信號的DNA序列仍未有報道。引用列表專利文獻專利文獻I JP 專利公布(Kohyo)No. 10-506532A (1998)專利文獻2 W02006/030638非專利文獻非專利文獻I :Lectin, Toshiaki Osawa 和 Ryoich Mori (編著)，KodanshaScientific Ltd.非專利文獻2 :Fitches 等，Effect of snowdrop lectin (GNA) delivered viaartificial diet and transgenic plants on the development tomato moth (Lacanobiaoleracea)larvae in laboratory and glasshouse trials, Journal of InsectPhysiology,43(8)，727-739(1997) ·非專利文獻3 :Rao 等，Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenicrice plants confers resistance to rice brown planthopper, The Plant Journal,15(4) ,469-477(1998).
非專利文獻4 :Tetsuya Kato 等，lBa-01 !Production of transformed tobaccocontaining accumulated yam tuber lectin DBl and evaluation of aphid resistance,日本植物細胞和分子生物學(xué)學(xué)會第26次年會(大阪研討會)的報告摘要，p. 64.非專利文獻5 :Tetsuya Kato 等，701 !Production of transformed crop withyam tuber lectin DBl and evaluation of insect pest resistance of the crop,日本育種學(xué)會第114次會議的報告摘要,第10卷，separate issue 2,2008年10月，ρ· 193.非專利文獻6 Tetsuya Kato 等，P144 Production of transgenic riceexpressing yam tuber lectin (DBl) to confer sap-sucking insect—resistance，稻功倉泛基因組學(xué)計劃的第6次國際研討會和摘要，p. 285。發(fā)明概述技術(shù)問題通過克隆編碼最初包含在來自薯蕷(山藥)(其已經(jīng)長期用作食物)塊莖的DBl基因中的易位信號的區(qū)并闡釋該區(qū)的DNA序列和氨基酸序列，本發(fā)明的一個目的是提供一種新型信號肽；和能夠利用所述信號肽有效地積累期望蛋白的技術(shù)。本發(fā)明的另一目的是提供通過利用以上信號肽引起DBl蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的高效積累而具有極佳的昆蟲害蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物。問題的解決方案作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人重新檢查了此前報道的薯蕷塊莖凝集素(DBl)基因的序列，確定了其新的基因序列，從而發(fā)現(xiàn)了編碼DBl蛋白前體中包含的信號肽的核酸的存在并確定了其序列。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將已向其加入新確定的編碼信號肽的區(qū)的基因引入不同類型的植物，從而引起DBl蛋白在該植物中的高效積累，可產(chǎn)生被賦予抗昆蟲活性或具有增強的抗昆蟲活性的轉(zhuǎn)基因植物。這導(dǎo)致完成本發(fā)明。具體地，本發(fā)明涵蓋以下。(I) 一種核酸，所述核酸編碼包括SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列或相對于SEQID NO :2所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的肽。(2)根據(jù)⑴的核酸，其中所述肽是信號肽。(3)根據(jù)(2)的核酸，其中所述信號肽是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位信號肽。(4) 一種基因，所述基因包括根據(jù)(I)至(3)任一項的核酸和位于所述核酸下游、編碼蛋白成熟區(qū)的核酸。(5)根據(jù)(4)的基因，其中所述蛋白成熟區(qū)是薯蕷(山藥)的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)。(6) 一種表達載體,其中根據(jù)⑷或(5)的基因位于可在植物中表達的啟動子的下游。(7) 一種轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物包含根據(jù)⑷或(5)的基因作為外來基因。(8)根據(jù)(7)的轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物被賦予抗昆蟲活性或具有增強的抗昆蟲活性。(9)根據(jù)(7)的轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物是禾本科(Poaceae)的植物。(10)根據(jù)(7)的轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物是稻。
(11) 一種賦予或增強抗昆蟲活性的方法，所述方法包括向目標(biāo)植物引入根據(jù)(4)或(5)的基因作為外來基因的步驟。(12)根據(jù)(11)的方法，其中所述目標(biāo)植物是禾本科的植物。(13)根據(jù)(11)的方法，其中所述目標(biāo)植物是稻。本說明書包括日本專利申請?zhí)?009-237432的說明書和/或附圖
中公開的部分或所有內(nèi)容，其是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明，可提供一種新型信號肽和 編碼該信號肽的核酸。使用該信號肽或編碼本發(fā)明的信號肽的核酸使得能夠在植物中有效積累期望蛋白。此外，由于使用該信號肽或編碼本發(fā)明的信號肽的核酸使得能夠有效積累DBl蛋白，對植物賦予抗昆蟲活性或改進植物的抗昆蟲活性變得可能。附圖簡述圖I顯示實施例中使用的質(zhì)粒的產(chǎn)生過程的流程圖。圖2顯示實施例中使用的質(zhì)粒的產(chǎn)生過程的流程圖。圖3顯示實施例中使用的質(zhì)粒的產(chǎn)生過程的流程圖。實施方式的描述本發(fā)明在以下詳細描述。新型信號肽本發(fā)明的信號肽是包括薯蕷(山藥)塊莖衍生的DBl蛋白前體的23個氨基酸殘基的肽。編碼本發(fā)明的信號肽的核酸的核苷酸序列和信號肽的氨基酸序列分別顯示在SEQID NO 1 和 2。此外，本發(fā)明的信號肽不限于包括SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的肽。例如，其包括包含相對于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并作為信號肽起作用的肽。本文所用的短語“多個氨基酸殘基”是指例如2至5個氨基酸殘基、優(yōu)選地2至3個氨基酸殘基、最優(yōu)選地2個氨基酸殘基。任何常規(guī)已知的方法可用于證實相對于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列是否能夠作為信號肽起作用。例如，這樣的方法包括誘導(dǎo)其中目標(biāo)氨基酸序列位于上游區(qū)的蛋白表達，并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分中包含的蛋白。如果目標(biāo)氨基酸序列能夠作為信號肽起作用，則內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分中可明顯檢測到蛋白。另外，本發(fā)明的信號肽作為所謂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽起作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽是被信號識別顆粒(SRP)識別的肽。結(jié)合于被核糖體翻譯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽的SRP結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面上的SRP受體。SRP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽解離。之后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽被肽酶裂解，促進隨后的翻譯。從而合成成熟蛋白。此外，本發(fā)明的信號肽可以是作為信號肽起作用并包括與SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列具有例如75%或更大、優(yōu)選地85%或更大、更優(yōu)選地90%或更大、最優(yōu)選地95%或更大的相似性的氨基酸序列的肽。這里，相似性值是指利用實施BLAST(基本局部比對搜索工具)算法的計算機程序基于默認設(shè)定可計算的值。另外，本發(fā)明的信號肽不限于由包括SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的核酸編碼的肽。其可以是能夠作為信號肽起作用、由在嚴格條件下與包括SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的核酸的互補序列雜交的核酸編碼的肽。這里，術(shù)語"嚴格條件"是指形成特異性雜合體但決不形成非特異性雜合體的條件。例如，這樣的條件包括在45°C以6 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)雜交，隨后在50°C至65°C以O(shè). 2至IXSSC和O. 1% SDS洗滌?？蛇x地，這樣的條件包括在65°C至70°C以I X SSC雜交，隨后在65°C至70°C以O(shè). 3 X SSC洗滌。雜交可通過常規(guī)已知方法進行，諸如 J. Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Har`bor Laboratory (1989)中所述的方法。本發(fā)明的信號肽偶聯(lián)于期望蛋白的N-端側(cè)，允許在植物中高度積累該蛋白。此夕卜，當(dāng)?shù)鞍自谥参镏斜磉_時，表達蛋白與信號肽的融合蛋白前體，隨后信號肽區(qū)被信號肽酶從其裂解。從而，蛋白形成為成熟蛋白。通過常規(guī)已知的技術(shù)將編碼包括信號肽的蛋白前體的核酸摻入表達載體，將如此獲得的表達載體引入植物。這使得能夠在植物中積累蛋白前體。表達載體構(gòu)建為包括可在植物中表達的啟動子和編碼以上前體的核酸。作為用作表達載體的基礎(chǔ)的載體，可使用多種常規(guī)已知的載體。例如，可使用質(zhì)粒、噬菌體、粘?；蝾愃莆?，這樣的載體可根據(jù)將引入的植物細胞和引入方法適當(dāng)?shù)剡x擇。這樣的載體的具體實例包括 pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK 和 pBI 載體。尤其是當(dāng)向植物引入載體的方法使用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)時,優(yōu)選地使用pBI雙元載體。pBI雙元載體的具體實例包括pBIG、pBIN19、pBI101和pBI121。本文所用的啟動子不具體地限制，只要其能夠?qū)е戮幋a以上前體的核酸在植物中表達?？蛇m當(dāng)?shù)厥褂萌魏我阎獑幼印Ｗ鳛閱幼?，尤其?yōu)選地使用可在植物中導(dǎo)致下游基因組成型表達的組成型表達的啟動子。這樣的啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)、各種肌動蛋白基因啟動子、各種泛素基因啟動子、胭脂堿合酶基因啟動子、煙草PRla基因啟動子、番茄核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶 加氧酶小亞基基因啟動子、和油菜籽蛋白基因啟動子。其中，可更優(yōu)選地使用花椰菜花葉病毒35S啟動子、肌動蛋白基因啟動子或泛素基因啟動子。使用選自以上啟動子的適當(dāng)啟動子使得能夠在向植物細胞引入基因后強表達期望基因。此外，可使用作用以導(dǎo)致在植物中位點特異性基因表達的啟動子。任何常規(guī)已知的啟動子可用作這樣的啟動子。使用這樣的啟動子允許位點特異性表達以上前體。此外，除了啟動子和編碼以上前體的核酸以外，表達載體還可包含其他DNA區(qū)段。這樣的其他DNA區(qū)段不受具體限制，其實例包括終止子、篩選標(biāo)記、增強子、和用于增強翻譯效率的核苷酸序列。而且，以上表達載體還可具有T-DNA區(qū)。T-DNA區(qū)可增強基因引入的效率，尤其是當(dāng)利用農(nóng)桿菌將以上重組表達載體引入植物時。轉(zhuǎn)錄終止子不受具體限制，只要其作為轉(zhuǎn)錄終止位點起作用，并可以是任何已知轉(zhuǎn)錄終止子。例如，具體地，可優(yōu)選地使用胭脂堿合酶基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(Nos終止子)、花椰菜花葉病毒35S的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(CaMV35S終止子)、或類似物。其中，可更優(yōu)選地使用Nos終止子。在以上表達載體的情形，通過在適當(dāng)位置布置轉(zhuǎn)錄終止子，可阻止使得在表達載體引入植物細胞后合成不必要地長的轉(zhuǎn)錄子的現(xiàn)象。作為轉(zhuǎn)化體篩選標(biāo)記，可使用藥物抗性基因或類似物。這樣的藥物抗性基因的具體實例包括針對潮霉素、博來霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素、等等的藥物抗性基因。通過選擇能夠在含有以上抗生素的培養(yǎng)基中生長的植物，可容易地篩選轉(zhuǎn)化的植物。此外，賦予對特定藥物的抗性的突變乙酰乳酸合酶基因可用作用于轉(zhuǎn)化體篩選的標(biāo)記。而且，用于構(gòu)建表達載體的方法不受具體限制。以上描述的啟動子、編碼前體的核酸、和如果必要的其他DNA區(qū)段可以預(yù)定順序引入用作基礎(chǔ)的適當(dāng)選擇的載體。例如，連接以上描述的編碼前體的核酸和啟動子(如，根據(jù)需要的轉(zhuǎn)錄終止子)以構(gòu)建表達盒，隨后可將該盒引入載體。例如，構(gòu)建表達盒時，準備DNA區(qū)段的裂解位點以具有彼此互補的凸出端，隨后以連接酶進行反應(yīng)，使得指定DNA區(qū)段的順序成為可能。此外，當(dāng)表達盒包含終止子時，可以從上游的以下順序布置DNA區(qū)段啟動子、編碼前體的核酸和終止子。而且，用于構(gòu)建表達載體的試劑的類型(即，限制性內(nèi)切酶、連接酶、等等)也不受具體限制。因此，可適當(dāng)?shù)剡x擇和使用可購買獲得的試劑。而且，用于以上表達載體的復(fù)制方法(產(chǎn)生方法)不受具體限制，在本文可使用常規(guī)已知的復(fù)制方法。一般，這樣的表達載體可在作為宿主的大腸桿菌 (Escherichia coli)中復(fù)制。此時，可根據(jù)載體類型選擇大腸桿菌的優(yōu)選類型。通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法將以上表達載體弓I入目標(biāo)植物。用于將表達載體弓I入植物細胞的方法(轉(zhuǎn)化方法)不受具體限制。根據(jù)植物細胞，可使用常規(guī)已知的適當(dāng)引入方法。具體地，例如，可使用利用農(nóng)桿菌的方法或包括直接引入植物細胞的方法。作為向植物細胞直接引入表達載體的方法，可采用微注射、電穿孔、聚乙二醇方法、基因槍方法(particle gunmethod)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣方法、或類似方法。而且，當(dāng)采用向植物細胞直接引入DNA的方法時，本文可用的DNA包含靶基因表達所需的轉(zhuǎn)錄元件，諸如啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子、以及靶基因。在這種情形中，載體功能不是關(guān)鍵。而且，本文可使用含有僅靶基因的蛋白編碼區(qū)、不具有轉(zhuǎn)錄單位的DNA，只要其被整合到宿主的轉(zhuǎn)錄單位中，隨后可表達靶基因。引入以上表達載體或不含表達載體但含靶基因的表達盒的植物細胞的實例包括植物器官的每種組織的細胞，諸如花、葉和根、愈傷組織、以及懸浮培養(yǎng)的細胞。此時，可根據(jù)待產(chǎn)生的植物類型構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_載體，或可預(yù)先構(gòu)建通用表達載體，然后引入植物細胞。
_5] 賦予的或增強的抗昆蟲活性在本發(fā)明中，利用本發(fā)明的前述信號肽在植物中表達編碼薯蕷(山藥)的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)的基因。如此，可對植物賦予抗昆蟲活性或改進植物的抗昆蟲活性。編碼薯蕷(山藥)的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)的核酸的核苷酸序列和成熟區(qū)的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO :3和4。此外，本發(fā)明的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)不限于包括SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的區(qū)。例如，其包括具有特異性結(jié)合甘露糖的活性并包含相對于SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列的區(qū)。這里，短語“多個氨基酸殘基”是指例如2至30個氨基酸殘基、優(yōu)選地2至15個氨基酸殘基、最優(yōu)選地2至10個氣基酸殘基。任何常規(guī)已知的方法可用于證實相對于SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列是否能夠作為甘露糖特異性凝集素起作用。例如，甘露糖特異性結(jié)合活性可通過研究包含目標(biāo)氨基酸序列的蛋白結(jié)合甘露糖的活性來評價。此外，本發(fā)明的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)可以是具有特異性結(jié)合甘露糖的活性并包括與SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列具有例如75%或更大、優(yōu)選地85%或更大、更優(yōu)選地90%或更大、最優(yōu)選地95%或更大的相似性的氨基酸序列的區(qū)。這里，相似性值是指利用實施BLAST(基本局部比對搜索工具)算法的計算機程序基于默認設(shè)定可計算的值。另外，本發(fā)明的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)不限于由包括SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列的核酸編碼的區(qū)。其可以是具有特異性結(jié)合甘露糖的活性、由在嚴格條件下與包括SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的核酸的互補序列雜交的核酸編碼的區(qū)。這里，術(shù)語"嚴格條件"是指形成特異性雜合體但決不形成非特異性雜合體的條件。例如，這樣的條件包括在45°C以6 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)雜交，隨后在50°C至65°C以O(shè). 2至I X SSC和0.1% SDS洗滌?？蛇x地，這樣的條件包括在65°C至70°C以1父35(雜 交，隨后在651至70°C以O(shè). 3X SSC洗漆。雜交可通過常規(guī)已知方法進行,諸如J. Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory (1989)中所述的方法。 對其賦予抗昆蟲活性或改進其抗昆蟲活性的目標(biāo)植物；即，利用以上信號肽在其中引起甘露糖特異性凝集素積累的植物，不受具體限制。具體地，通過利用信號肽導(dǎo)致甘露糖特異性凝集素表達，可對任何植物賦予抗昆蟲活性或改進其抗昆蟲活性。這樣的植物的實例包括但不限于，雙子葉植物和單子葉植物，諸如屬于禾本科(穎花科(Gramineae))或十字花科(Brassicaceae)的植物。屬于禾本科的植物的實例包括玉蜀黍(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥(Triticum aestivum)、竹(剛竹屬(Phyllostachys))、甘鹿(Saccharum officinarum)、象草(Pennisetum pupureum)、鹿茅屬(erianthus)(沙生鹿茅(Erianthus ravenae))、芒屬(miscanthus)(日本銀草)(Miscanthus virgatum)、高粱、和柳枝稷(黍?qū)?Panicum))。屬于十字花科的植物的實例包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蕓苔屬植物(蔓菁(Brassica rapa)、歐洲油菜(Brassica napus)、和油菜(Brassica campestris))、甘藍(Brassica oleracea var. capitata) > 中國大白菜(Brassica rapa var. pekinensis)、青梗菜(Brassica rapa var. chinensis)、完善(Brassica rapa var. rapa)、葉用完善(Brassica rapa var. hakabura)、雪里蓮(Brassicarapa var. lancinifolia)、蕓笞(Brassica rapa var. peruviridis)、青菜(Brassica rapavar. chinensis)、蘿卜(Raphanus sativus)、和山葵(ffasabia japonica)。本文所用的術(shù)語“抗昆蟲活性”是指尤其是針對刺吸昆蟲害蟲的殺昆蟲活性或驅(qū)昆蟲活性。刺吸昆蟲害蟲的實例包括但不具體限于屬于半翅目(Hemiptera)的以下昆蟲害蟲蝶科(Cicadidae)的Mogannia minuta ;尖胸沫蝶科(Aphrophoridae)的柳沫蟲單(Aphrophora intermedia);角蝶科(Membracidae)的西伯利亞脊角蝶(Machaerotypussibiricus);大葉蝶科(Cicadellidae)的葡萄阿小葉蝶(Arboridia apicalis)、大貫小綠葉蝶(Empoasca onukii)、黑尾葉蟲單(Nephotettix cincticeps)、和電光葉蟲單(Reciliadorsalis);菱臘蝶科(Cixiidae)的端斑五胸脊菱臘蝶(Pentastiridius apicalis);飛風(fēng)科(Delphacidae)的灰飛風(fēng)(Laodelphax striatellus)、褐飛風(fēng)(Nilaparvata Iugens)、和白背飛風(fēng)(Sogatella furcifera);粒脈臘 單科(Meenoplidae)的 Nisia nervosa ；袖錯蜂科(Derbidae)的 Kamendaka saccharivora ;穎錯蜂科(Achilidae)的 Achilusflammeus ;廣翅錯蜂科(Ricaniidae)的 Orosanga japonicus ;蛾錯蜂科(Flatidae)的蛾錯蜂(Mimophantia maritima);木風(fēng)科(Psyllidae)的梨木風(fēng)(Cacopsyllapyrisuga) 木風(fēng)科(Calophyidae)的芒果_木風(fēng)(Calophya mangiferae);根瘤蟲牙科(Phylloxerdae)的葡萄根瘤蟲牙(Daktulosphaira vitifoliae);球蟲牙科(Adelgidae)的落葉松球蟲牙(Adelges Iaricis)和鐵杉球蟲牙(Adelges tsugae);蟲牙科(Aphididae)的豌豆蟲牙(Acyrthosiphon pisum)、棉姆(Aphis gossypii)、繡線菊姆(Aphis spiraecola)、蘿卜蟲牙(Lipaphis erysimi)、相匕蟲牙(Myzus persicae)、麥二叉蟲牙(Schizaphis graminum)、矛口禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi);粉風(fēng)科(Aleyrodidae)的黑剌粉風(fēng)(Aleurocanthusspiniferus)、煙粉風(fēng)(Bemisia tabaci)、銀葉粉風(fēng)(Bemisia argentifolii)、和溫室白粉風(fēng)(Trialeurodes vaporariorum);綿階科(Margarodidae)的草履階(Drosichacorpulenta)和吹綿階(Icerya purchasi);粉階科(Pseudococcidae)的菠蘿粉階(Dysmicoccus brevipes)、柑桔粉階(Planococcus citri)、和康氏粉階(Pseudococcuscomstocki);階科(Coccidae)的角錯階(Ceroplastes ceriferus);仁階科(Aclerdidae)`的高橋仁階(Aclerda takahashii);盾階科(Diaspididae)的紅圓階(Aonidiellaaurantii)、梨枝圓盾階(Diaspidiotus perniciosus)、和矢尖階(Unaspis yanonensis)；盲鋳科(Miridae)的顯莢草盲鋳(Lygus hesperus)和赤須盲鋳(Trigonotyluscaelestialium);網(wǎng)鋳科(Tingidae)的杜鹽冠網(wǎng)鋳(Stephanitis pyrioides)和梨冠網(wǎng)蟲舂(Stephanitis nashi);鋳科(Pentatomidae)的北二星鋳(Eysarcoris aeneus)、稻褐蟲舂(Lagynotomus elongatus)、稻綠鋳(Nezara viridula)、和朱綠鋳(Plautia crossota)；圓鋳科(Plataspidae)的篩顯龜鋳(Megacopta cribraria);長鋳總科(Lygaeoidea)的甘鹿異背長鋳(Cavelerius saccharivorus) ；Maicidae 的日本束長鋳(Malcusjaponicus);紅鋳科(Pyrrhocoridae)的棉紅椿(Dysdercus cingulatus);蛛緣鋳科(Alydidae)的大稻緣鋳(Leptocorisa acuta)和華稻緣鋳(Leptocorisa chinensis)；緣鋳科(Coreidae)的 Anacanthocoris striicornis ;姬緣鋳科(Rhopalidae)的黃伊緣蟲舂(Rhopalus maculatus);以及臭蟲科(Cimicidae)的溫帶臭蟲(Cimex Iectularis)。此外，剌吸昆蟲害蟲的實例包括但不具體限于屬于纓翅目(Thysanoptera)的以下昆蟲害蟲薊馬科(Thripidae)的花薊馬(Frankliniella intonsa)、西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)、正荼黃薊馬(Scirtothrips dorsalis)、掠櫚薊馬(Thrips palmi)、和煙薊馬(Thrips tabaci)；以及管薊馬科(Phlaeothripidae)的 Ponticulothripsdiospyrosi和稻簡管薊馬(Haplothrips aculeatus)。另外，剌吸昆蟲害蟲的實例包括但不具體限于以下植物寄生螨類真足螨科(Eupodidae)的麥圓葉爪螨(Penthaleusmajor);跑線螨科(Tarsonemidae)的樓草植食螨(Phytonemus pallidus)和側(cè)多食跑■線螨(Polyphagotarsonemus Iatus);蒲螨科(Pyemotidae)的蒲螨(正穗螨屬(Siteroptessp.));細須螨科(Tenuipalpidae)的劉氏短須螨(Brevipalpus Iewisi);杜克螨科(Tuckerellidae)的 Tuckerella pavoniformis ；葉螨科(Tetranychidae)的北始葉螨(Eotetranychus boreus)、桔全爪螨(Panonychus citri)、蘋果全爪螨(Panonychusulmi)、二斑葉螨(Tetranychus urticae)、和神澤葉螨(Tetranychus kanzawai)；Phytopidae的松三毛瘦螨(Trisetacus pini);瘦螨科(Eriophyidae)的皮氏剌皮瘦螨(Aculops pelekassi)、梨上瘦螨(Epitrimerus pyri)、和柑桔鎊螨(Phyllocoptrutaoleivora);羽爪瘦螨科(Diptilomiopidae)的凍綠雙羽爪瘦螨(Diptacus crenatae)；以及螨科(Acaridae)的橢圓食粉螨(Aleuroglyphus ovatus)、腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)、和羅賓根螨(Rhizoglyphus robini)。此外,抗昆蟲活性可通過允許植物與雌性成蟲接觸某一時間段并檢查生長的下一代幼蟲的數(shù)目來評價。此外，其可通過允許幼蟲與植物接觸并確定生長為成蟲的比例來評價。這里，術(shù)語“賦予的抗昆蟲活性”是指由于使用以上信號肽積累甘露糖特異性凝集素而對野生型植物(不具有抗昆蟲活性)賦予的抗昆蟲活性。術(shù)語“增強的抗昆蟲活性”是指已經(jīng)利用以上信號肽誘導(dǎo)甘露糖特異性凝集素積累的重組植物的抗昆蟲活性，其顯著大于原始野生型植物的抗昆蟲活性。具體地，在本發(fā)明中，使用本發(fā)明的信號肽在作為有用作物的稻中表達編碼薯蕷(山藥)的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)的基因，誘導(dǎo)該基因在稻中積累。從而，可對稻賦予抗昆蟲活性。
實施例本發(fā)明參考以下實施例更詳細地在以下描述，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些實施例。(I)薯蕷凝集素DBl基因的核苷酸測序利用Concert植物RNA試劑(Invitrogen)按照制造商的實驗方案從薯菌塊莖提取總RNA。隨后,利用Micro-FAST Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen)按照制造商的實驗方案純化聚(A)+RNA。利用Marathon cDNA 擴增試劑盒(BD Biosciences Clontech)合成已在 5’ 端加入Marathon cDNA接頭的cDNA。使用該cDNA作為模板和與此前報道的DBl (DDBJ登錄號AB178475)序列互補的一組以下引物，在表I和表2所列的條件下進行PCR XB/DB1F(5/ -TCTAGAGGATCCATGGCCGATTTCATACTT~3/ (SEQ ID NO :5) (Xba I 和 Bam HI 識別位點加下劃線))JPS/DBIRC -GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3' (SEQ ID NO :6) (Sac I 識別位點加下劃線))。如此，確定PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。所獲得的DNA序列顯示在SEQ ID NO :3。進一步，將PCR產(chǎn)物TA克隆到pGEM-T載體(Invitrogen)中。利用QIAprep Spin微量制備試劑盒(QIAGEN)從包括摻入有此前報道的DB1(DDBJ登錄號AB178475)基因的質(zhì)粒的大腸桿菌菌落分離質(zhì)粒I。圖I顯示以上方案的概述。[表 I]PCR反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種核酸，所述核酸編碼由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或相對于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列組成的肽
2.如權(quán)利要求I所述的核酸，其中所述肽是信號肽。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述信號肽是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位信號肽。
4.一種基因，所述基因包括根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項的核酸和位于所述核酸下游、編碼蛋白成熟區(qū)的核酸。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其中所述蛋白成熟區(qū)是薯蕷(山藥(Dioscoreabatatas))的甘露糖特異性凝集素的成熟區(qū)。
6.—種表達載體,其中根據(jù)權(quán)利要求4或5的基因位于可在植物中表達的啟動子的下游。
7.一種轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物包含根據(jù)權(quán)利要求4或5的基因作為外來基因。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物被賦予抗昆蟲活性或具有增強的抗昆蟲活性。
9.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化的植物,所述轉(zhuǎn)化的植物是禾本科(Poaceae)的植物。
10.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化的植物，所述轉(zhuǎn)化的植物是稻。
11.一種賦予或增強抗昆蟲活性的方法，所述方法包括向目標(biāo)植物引入根據(jù)權(quán)利要求4或5的基因作為外來基因的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述目標(biāo)植物是禾本科的植物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述目標(biāo)植物是稻。
全文摘要
本發(fā)明的一個目的是提供新型信號肽以及利用所述信號肽有效地積累期望蛋白的技術(shù)。還提供編碼包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的肽的核酸。
文檔編號A01H1/00GK102959079SQ20108005610
公開日2013年3月6日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月14日
發(fā)明者小松正明, 角康一郎, 鳥山欽哉, 小川智久, 村本光二, 堀雅敏, 加藤哲也 申請人:組合化學(xué)工業(yè)株式會社, 國立大學(xué)法人東北大學(xué)