專利名稱：與玉米熱帶銹病(玉米殼銹菌)抗性相關(guān)聯(lián)的基因座的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)涉及用于提高植株對(duì)熱帶銹病抗性的組合物和方法和用于鑒定與受關(guān)注的性狀相關(guān)聯(lián)的等位基因變異的方法。
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背景技術(shù)：
熱帶鎊病是由病原體玉米殼鎊菌(Physopellazeae (Mains) Cummins&Ramachar)(與Angiopsora zeae Mains同義)引起的真菌病害，其以前歸類為Angiopsora zeaeMains (Donald G.White,編輯，1999.Compendium of corn diseases.第三版.APS Press,ISBN 0-89054-234-1)。熱帶銹病能夠快速發(fā)展，在短時(shí)間內(nèi)殺死植株。病害管理策略包括作物輪作、通過(guò)耕作破壞以前的玉米殘留、以及施用殺真菌劑，全部這些方法旨在減少真菌種菌。然而，控制熱帶銹病的最有效并且最優(yōu)選的方法是種植抗病雜交種。通過(guò)減少真菌種菌控制熱帶`銹病的方法需要農(nóng)民方面附加的時(shí)間和資源，并且此外可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生破壞效應(yīng)。這使得種植抗病雜交種對(duì)農(nóng)民和一般公眾來(lái)說(shuō)甚至更有吸引力。因此，希望提供鑒定并選擇具有對(duì)熱帶銹病提高抗性的玉米植株的組合物和方法。發(fā)明概沭提供了鑒定并選擇具有對(duì)熱帶銹病提高抗性的玉米植株的組合物和方法。還提供了標(biāo)記輔助選擇具有對(duì)熱帶銹病提高抗性的植株的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株或種質(zhì)的方法，所述方法檢測(cè)與PHMTR(SEQ ID NO:155)位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)的第一標(biāo)記基因座的至少一種等位基因的存在，并且選擇包含連鎖并關(guān)聯(lián)PHMTR(SEQ ID NO: 155)的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型的第一標(biāo)記基因座的至少一種等位基因的玉米植株或種質(zhì)。在單一減數(shù)分裂圖譜上，所述第一標(biāo)記基因座的至少一個(gè)等位基因可與PHMTR(SEQ ID NO:155)位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)至多20cM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株或種質(zhì)的方法，所述方法檢測(cè)PHMTR(SEQ ID NO: 155)的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ IDNO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型；并且選擇包含PHMTR (SEQ ID NO:155)的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型的玉米植株或種質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法，所述方法使用標(biāo)記基因座序列、一部分標(biāo)記基因座序列、或標(biāo)記基因座序列的互補(bǔ)序列、或它們的一部分作為標(biāo)記探針檢測(cè)玉米植株基因組中的標(biāo)記基因座。所述標(biāo)記探針在嚴(yán)格條件下雜交到介于下述序列之間并包括它們的連續(xù)DNA上:SEQ ID NO:89或基于ClustalV比對(duì)方法與SEQ ID NO:89具有95%的同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO:96或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO:96具有95%的同一性的核苷酸序列，并且所述標(biāo)記基因座包含與對(duì)熱帶銹病的提高抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)等位基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法，所述方法檢測(cè)與所述玉米植株的種質(zhì)中提高的抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)標(biāo)記等位基因。標(biāo)記基因座可選自任一個(gè)以下標(biāo)記基因座:PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、 PHM15721-180-U、 C00441-801-U、 C00441-802-U、 PHM4370-19-U、PHM73卜107-U、 C00071-01-U, PHM8249-2卜U、 C00428-801-U, PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U 和 PHM4003-13-U ;PHM標(biāo)記 PHM15590、PHM13818、PHMl 192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731 和 PHM15721 ;Sub2e、Sub9d、Subl9c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4 ；以及與這些標(biāo)記連鎖的任何其它標(biāo)記。標(biāo)記基因座也存在于染色體10上的任何以下區(qū)間內(nèi)，其包含 并側(cè)接:1.PHM15590 和 PHM9535 ；i1.PHM15590 和 PHM15721 ；ii1.C00441 和 C00428 ;iv.PHM731 和 PHM15721 ;和V.C00071 和 PHM731。標(biāo)記基因座包含與增強(qiáng)的熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)等位基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法，所述方法檢測(cè)與對(duì)熱帶銹病的提高抗性相關(guān)聯(lián)的玉米植株種質(zhì)中的單倍型。所述單倍型在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座上包含等位基因，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座存在于染色體10上的任何以下區(qū)間內(nèi)，其包含并側(cè)接: 1.PHM15590 和 PHM9535 ；i1.PHM15590 和 PHM15721 ；i i i.C00441 和 C00428 ;iv.PHM731 和 PHM15721 ;和V.C00071 和 PHM731。所述單倍型可包含PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO: 167的位點(diǎn) 337-339 處的 “GAG”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法。在該方法中，獲取第一玉米植株，其中所述玉米植株具有標(biāo)記基因座的至少一個(gè)等位基因，所述標(biāo)記基因座位于染色體10上的任何以下區(qū)間內(nèi)，其包含并側(cè)接:1.PHM15590 和 PHM9535 ；i1.PHM15590 和 PHM15721 ；i i i.C00441 和 C00428 ;iv.PHM731 和 PHM15721 ;和
v.C00071 和 PHM731 ；并且所述等位基因與對(duì)熱帶銹病的提高抗性相關(guān)聯(lián)。所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交，并且對(duì)所得子代植株進(jìn)行第一玉米植株的等位基因的評(píng)價(jià)。然后選擇具有所述第一玉米植株的等位基因的子代植株作為對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的植株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法。在該方法中，獲取第一玉米植株，其中所述玉米植株在其基因組中包含PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型。所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交，并且對(duì)所得子代植株進(jìn)行PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型的評(píng)價(jià)。然后選擇具有PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型的子代植株作為對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的植株。此外，通過(guò)上述方法鑒定或選擇的玉米植株是受關(guān)注的，其中所述植株不是CML339。此外，由上述方法鑒定或選擇的玉米植株的子代是受關(guān)注的。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，提供了鑒定與期望的性狀形式相關(guān)聯(lián)的等位基因變異的方法。在這些方法中，比對(duì)開(kāi)放:延伸代價(jià)比大于10的原始序列并通過(guò)修剪尾部除去背景噪音。然后修剪隨機(jī)的等位基因變異，并使用非加權(quán)配對(duì)組算數(shù)平均法(UPGMA)。重復(fù)進(jìn)行隨機(jī)等位基因變異的修剪和應(yīng)用UPGMA于比對(duì)直至鑒定出表型關(guān)系圖。然后可從表型關(guān)系圖中鑒定與受關(guān)注的表型相關(guān)聯(lián)的等位基因變異。附圖和序列表說(shuō)明根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表構(gòu)成本專利申請(qǐng)的一部分。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以三字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985)和 BiochemicalJournal 219 (N0.2):345-373(1984)所描述的 IUPAC-1UBMB 標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，2):345-373(1984)，所述文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)則。


圖1示出定位BAC的物理圖譜排列(獲取自Maize Genome Browser,它在因特網(wǎng)上公開(kāi)可用)，它裝配到染色體10區(qū)域上，該區(qū)域由C0497L12和b0191E02定位并包括它們。示出了本文所述的PHM標(biāo)記位點(diǎn)(由PHM15590和PHM15721定位并包括它們的區(qū)域)，它們是位于所述區(qū)間內(nèi)的公開(kāi)標(biāo)記位點(diǎn)。圖2A和2B分別示出了熱帶和南方銹病評(píng)分的PH468x PHS6Y F2種群的頻率分布。圖3示出了使用PH468x PHS6Y F2種群獲得的混合區(qū)間作圖結(jié)果。在染色體10的短臂上鑒定顯著性峰。在X軸上的標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于PHB基因圖譜。y軸代表LOD評(píng)分。圖4 (a)易感自交系和使用PHS6Y作為供體親本的對(duì)應(yīng)抗性轉(zhuǎn)化。(b)用易感型自交系制得的雜交體。(C)用相同自交系的抗性(“轉(zhuǎn)化的”)型制得的雜交體。這顯示熱帶銹病基因在雜交水平上具有顯性效應(yīng)。圖5示出對(duì)熱帶銹病(左側(cè))高度易感的雜交體和已經(jīng)從PHS6Y轉(zhuǎn)化成具有提高抗性的相同雜交體(右側(cè))。圖6示出用作引物設(shè)計(jì)參考的公開(kāi)BAC克隆，其用于對(duì)熱帶銹病抗性的和易感的基因型玉米品系。關(guān)于BAC重疊的內(nèi)部信息用于進(jìn)一步將2-2.5Mb區(qū)域的序列順序縮小至24個(gè)子區(qū)域。
圖7示出通過(guò)對(duì)熱帶銹病抗性的和易感的玉米品系的基因分型獲得的部分參考序列(頂部)，所述基因分型使用設(shè)計(jì)用于克隆ID Ct9050c064Gllc的PCR引物(SEQ IDNO:133和134)(表9)。SEQ ID NO:137-142示出獲取自抗性品系的擴(kuò)增子，而SEQ IDNO:143-154示出獲取自易感品系的擴(kuò)增子。用灰色突出顯示的區(qū)域示出參考序列(稱為PHMTR;SEQ ID NO: 155)的21bp區(qū)域。在bpl6具有T-缺失的玉米品系(用箭頭示出)都顯示對(duì)熱帶銹病的提高抗性并具有序列SEQ ID N0:156。圖8示出使用引物SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136獲得的擴(kuò)增子序列的部分比對(duì)。發(fā)現(xiàn)“GAG”單倍型(框內(nèi))是全部具有提高熱帶銹病抗性的品系獨(dú)有的。本文所附的序列描述和序列表遵循在37C.F.R.§ 1.821-1.825中所列出的用于專利申請(qǐng)公開(kāi)中的核苷酸和/或氨基酸序列的規(guī)定。序列表包含遵循IUPAC-1UBMB標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸序列的單字母編碼和氨基酸序列的三字母編碼，IUPAC-1UBMB標(biāo)準(zhǔn)描述于NucleicAcids Res.13:3021-3030(1985)和 Biochemical J.219(2):345-373 (1984)，所述文獻(xiàn)以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合如37C.F.R.§1.822所示的規(guī)則。表I列出了本文所述與InvaderPlus產(chǎn)品標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的序列以及在所附序列表中的對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO:)。表 I: InvaderPlus 產(chǎn)品標(biāo)記
權(quán)利要求
1.選擇具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，包括: a.在所述玉米植株中檢測(cè)第一標(biāo)記等位基因，所述第一標(biāo)記等位基因與以下序列連鎖并關(guān)聯(lián):HMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失；或i1.參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型；以及 b.選擇具有所述第一標(biāo)記等位基因的所述玉米植株。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在單一減數(shù)分裂圖譜上，所述第一標(biāo)記等位基因與PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型連鎖20cM。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在單一減數(shù)分裂圖譜上，所述第一標(biāo)記等位基因與PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型連鎖2cM。
4.選擇具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，包括: a.在所述玉米植株中檢測(cè)HMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失；或 i1.參考序列SEQID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型；以及 b.選擇具有PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或參考序列SEQID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”單倍型的所述玉米植株。
5.鑒定顯示增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在玉米植株中檢測(cè)標(biāo)記基因座，其中: a.將包含全部或部分所述標(biāo)記基因座或其互補(bǔ)序列的標(biāo)記探針在嚴(yán)格條件下與所述連續(xù)DNA雜交，所述連續(xù)DNA介于以下序列之間并包括以下序列:SEQ ID NO:89或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO:89具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO:96、或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO:96具有95%同一性的核苷酸序列；并且 b.所述標(biāo)記基因座包含與所述增強(qiáng)的熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)等位基因。
6.鑒定顯示增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的種質(zhì)中檢測(cè)標(biāo)記基因座的等位基因，其中: a.所述標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接PHM15590和PHM9535 ;并且 b.所述等位基因與增強(qiáng)的熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接 PHM15590 和 PHM15721。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接C0041和C00428。
9.鑒定顯示增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的種質(zhì)中檢測(cè)在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座處包含等位基因的單倍型，其中: a.所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接PHM15590 和 PHM9535 ;并且 b.所述單倍型與增強(qiáng)的熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接PHM15590和PHM15721。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接C0041和C00428。
12.權(quán)利要求9、10、或11的方法，其中所述單倍型包括PHMTR的位點(diǎn)I處的“T”缺失或參考序列SEQ ID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”。
13.選擇顯示增強(qiáng)的玉米熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括: a.獲取具有標(biāo)記基因座的至少一個(gè)等位基因的第一玉米植株，其中所述標(biāo)記基因座位于包含并側(cè)接PHM15590和PHM9535的染色體區(qū)間內(nèi)，并且所述等位基因與增強(qiáng)的熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)； b.將所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交； c.對(duì)子代植株進(jìn)行所述第一玉米植株的等位基因的評(píng)價(jià)；以及 d.選擇具有所述第一玉米植株的等位基因的子代植株。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接 PHM15590 和 PHM15721。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并側(cè)接C0041和C00428。
16.選擇顯示增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括: a.獲取第一玉米植株，所述第一玉米植株的基因組內(nèi)包含:HMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失；或 i1.包含參考序列SEQID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”的單倍型； b.將所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交； c.對(duì)子代植株進(jìn)行PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或包含參考序列SEQID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”的單倍型的評(píng)價(jià)；以及 d.選擇具有PHMTR的位點(diǎn)16處的“T”缺失或包含參考序列SEQID NO:167的位點(diǎn)337-339處的“GAG”的單倍型的子代植株。
17.由權(quán)利要求5和6-12中任一項(xiàng)的方法鑒定的玉米植株，其中所述植株不是CML339。
18.由權(quán)利要求1-4和13-16中任一項(xiàng)的方法選擇的玉米植株，其中所述植株不是CML339。
19.鑒定與期望形式的性狀相關(guān)聯(lián)的一種或多種等位基因變異的方法，包括: a.比對(duì)原始序列，其中開(kāi)放:延伸代價(jià)比大于10； b.修剪序列尾部(噪音)； c.修剪隨機(jī)等位基因變異； d.將UPGMA(非加權(quán)配對(duì)組算數(shù)平均法)應(yīng)用于所得比對(duì)； e.重復(fù)步驟c_d，直至表型圖鑒定出具有所述期望形式的性狀的獨(dú)特品系簇；以及 f.鑒定與所述期望形式的性狀相關(guān)聯(lián)的一種或多種等位基因變異。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定具有提高的或降低的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法和組合物。所述方法使用分子標(biāo)記以鑒定并選擇具有提高的熱帶銹病抗性的植株或鑒定并反選具有降低的熱帶銹病抗性的植株。通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的玉米植株也是本發(fā)明的一個(gè)特征。用于關(guān)聯(lián)等位基因變異與受關(guān)注性狀的方法也是受關(guān)注的。
文檔編號(hào)A01H5/10GK103108541SQ201080060463
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2010年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者S·C·K·米拉赫, V·拉卡, M·G·布特勒伊勒, E·林伯格, E·D·O·阿爾貝斯 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司, 先鋒國(guó)際良種公司