專利名稱：耐除草劑大豆植物及鑒定其的方法
耐除草劑大豆植物及鑒定其的方法
交叉參考相關申請
本申請要求2010年7月23日提交的美國臨時專利申請No. 61/367，251 ;2009年 11月23目提交的美國臨時專利申請No. 61/263，707 ;和2009年11月23日提交的歐洲專利申請No. EP09014565. 7的優(yōu)先權，將所述每一個美國臨時專利申請和歐洲專利申請的公開內(nèi)容通過弓I用整體并入本文。發(fā)明領域
本發(fā)明涉及轉基因大豆植物、植物材料和種子，其特征在于包含至少兩個特定的轉化事件，具體地在于至少兩組編碼賦予除草劑抗性的蛋白質的基因的存在，所述基因的組各自位于大豆基因組的特定位置。本發(fā)明的大豆植物將耐除草劑表型與在除草劑不存在的情況下等同于非轉化大豆品系的不同遺傳背景中的農(nóng)藝性狀、遺傳穩(wěn)定性和功能性組合。本發(fā)明還提供了用于鑒定包含特定轉化事件EE-GM和EE-GM2或EE-GMl的植物材料在生物樣品中存在的方法和試劑盒。發(fā)明背景
植物中轉基因的表型表達可通過基因本身的結構和通 過其在植物基因組中的位置來確定。同時轉基因或“外源DNA”在基因組的不同位置上的存在可以以不同方式影響植物的總體表型。通過基因操作將具有商業(yè)吸引力的性狀在農(nóng)業(yè)或工業(yè)上成功能地引入植物視不同的因素而定可以是冗長的過程。遺傳轉化的植物的實際轉化和再生只是一系列選擇步驟的第一步，所述一系列選擇步驟包括廣泛的遺傳表征、繁育以及田間試驗的評估，最終導致原種事件(elite event)的選擇。
基于關于新型食品/飼料、GMO和非-GMO產(chǎn)物的分離以及專利材料(proprietary material)的鑒定的討論，原種事件的明確鑒定變得日益重要。理想地，這樣的鑒定方法快速且簡單，無需大量實驗室裝置。此外，所述方法應當提供使得能夠明確鑒定原種事件而無需專家解釋，但必要時經(jīng)歷得起專家的細查的結果。本文中描述了用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的特殊工具。
在本發(fā)明中，EE-GM3已在耐除草劑大豆(大豆(Glycine max))的開發(fā)中被鑒定為來自轉基因大豆植物群體的良種事件，所述耐除草劑大豆包含與賦予對4-羥基苯丙酮酸二氧合酶(HPPD)抑制劑的抗性的基因組合的編碼草甘膦抗性的基因，所述基因各自于植物可表達啟動子的控制之下。
EE-GMl和EE-GM2先前已被鑒定為在耐除草劑大豆(大豆)的開發(fā)中被鑒定為來自轉基因大豆植物群體的原種事件，所述轉基因大豆包含處于植物可表達啟動子的控制之下的編碼草胺膦抗性的基因，并且描述于W02006/108674和W02006/108675 (將兩個公布通過引用并入本文)中。
本領域已公開了包含耐除草劑基因的大豆植物。然而，現(xiàn)有技術公開內(nèi)容沒有一個教導或提出本發(fā)明。
在本領域中已知在大豆植物中獲得具有可接受的農(nóng)藝性狀、無產(chǎn)量抑制現(xiàn)象 (yield drag)以及提供足夠的除草劑抗性(當然針對3個不同種類的除草劑)的商業(yè)耐除草劑原種轉化事件絕不簡單容易。事實上，已報導市場上發(fā)布的具有耐除草劑的第一大豆植物(事件40-3-2)與(近_)等基因系(isogenic line)相比較具有顯著的產(chǎn)量抑制現(xiàn)象(Elmore等(2001)Agron. J. 93:408-412)。同樣地，Optimum GAT 大豆(事件356043)經(jīng)開發(fā)將對草甘膦的抗性與對ALS除草劑的抗性組合，但已報導此類大豆本身不滿足草甘膦抗性的標準(無與另一種草甘膦抗性大豆事件(例如事件40-3-2)的組合(參見例如，www. bloomberg. corri/apps/news p i d=newsarch i ve&s i d=ad4L0hH9MKWE))。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的概述本發(fā)明涉及轉基因大豆植物、其種子、細胞或組織，所述轉基因大豆植物、其種子、細胞或組織包含穩(wěn)定地整合入其基因組的表達盒(所述表達盒包含含有2mEPSPS基因的編碼序列的耐除草劑基因和含有HPH)-PF W336的編碼序列的另一種耐除草劑基因(如本文實施例1.1中描述和SEQ ID No I中所示的兩個基因))以及第二表達盒(所述第二表達盒包含含有草丁膦乙酰轉移酶的編碼序列的耐除草劑基因(如實施例1中描述的和SEQ IDNo 11中所示的))。所述轉基因大豆植物或其種子、細胞或組織耐受基于草甘膦、基于草銨膦的除草劑以及HPro抑制劑除草劑例如異噁唑草酮，并且在除草劑不存在的情況下，具有大體上與非轉基因等基因系相當?shù)霓r(nóng)藝性狀。在施用一種或多種提供了針對其的抗性的除草劑后，植物將具有與非轉基因植物相比較更優(yōu)的農(nóng)藝表型。根據(jù)本發(fā)明，大豆植物或其種子、細胞或組織包括原種事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3 和 EE-GM2。更具體地，本發(fā)明涉及轉基因大豆、其種子、細胞或組織，其基因組DNA的特征在于這樣的事實當在本文中描述的PCR鑒定方案中進行分析時，使用分別針對EE-GM3的和EE-GM-3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的兩個引物，產(chǎn)生對于EE-GM3有特異性的片段，以及此外當在本文中描述的PCR鑒定方案中分析時，使用分別針對EE-GMl或EE-GM2的和包含草胺膦抗性基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的兩個引物，產(chǎn)生對于EE-GMl或EE-GM2有特異性的片段。用于檢測EE-GM3的引物可分別針對SEQ IDNO 2內(nèi)的5’側翼區(qū)域和包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域。用于檢測EE-GM3的引物還可分別針對SEQ ID N0:3內(nèi)的3’側翼區(qū)域和包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域，例如分別包含SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :4或SEQ ID No. :7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物，并且產(chǎn)生100至800bp的DNA片段，例如約263bp或706bp的片段。用于檢測EE-GMl的引物可分別針對SEQ ID NO : 12和包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的5’側翼區(qū)域。用于檢測EE-GMl的引物還可分別針對SEQ IDNO 13和包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的3’側翼區(qū)域，例如分別包含SEQ ID N0:16和SEQ ID NO 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物，并且產(chǎn)生100至500bp的DNA片段，例如約183bp的片段。用于檢測EE-GM2的引物可分別針對SEQ ID NO :14和包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的5’側翼區(qū)域。用于EE-GM2的檢測的引物還可分別針對SEQ IDNO: 15和包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的3’側翼區(qū)域，例如，分別包含SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物，并且產(chǎn)生100至500bp的DNA片段，例如約151bp的片段。
包含本發(fā)明的原種事件的EE-GM3的參照種子已在登錄號NCMB 41659下保藏在NCMB。包含本發(fā)明的原種事件EE-GMl的參照種子已在登錄號NCMB 41658下保藏在NCMB。包含本發(fā)明的原種事件EE-GM2的參照種子已在登錄號NCMB 41660下保藏在NCIMB0包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的參照種子已在登錄號PTA-11041下保藏在ATCC。包含原種事件EE-GM3和EE-GM2的參照種子已在登錄號PTA-11042下保藏在ATCC。本發(fā)明的一個實施方案是包含原種事件EE-GM3(以NCMB登錄號NCMB 41659保藏的包含所述事件的參照種子)并且還包含原種事件EE-GMl (以NCMB登錄號NCMB41658保藏的包含所述事件的參照種子)的種子，或包含事件EE-GM3和EE-GMl的種子(在登錄號PTA-11041下保藏在ATCC的包含所述事件的參照種子)，所述種子將生長成耐受至少3種除草劑，特別地耐草甘膦和/或HPH)抑制劑例如異噁唑草酮和/或谷氨酰胺合成酶抑制劑例如草銨膦的大豆植物。本發(fā)明的另一個實施方案是包含原種事件EE-GM3(以NCMB登錄號NCMB 41659 保藏的包含所述事件的參照種子)并且還包含原種事件EE-GM2(以NCMB登錄號NCMB41660保藏的包含所述事件的參照種子)的種子或包含事件EE-GM3和EE-GM2 (在登錄號PTA-11042下保藏在ATCC的包含所述事件的參照種子)的種子，所述種子生長成耐受至少3種除草劑，特別地耐受草甘膦和/或HPH)抑制劑例如異噁唑草酮和/或谷氨酰胺合成酶抑制劑例如草銨膦的大豆植物。NCIMB保藏號NCMB 41659的種子是由至少約95%的包含原種事件EE-GM3的轉基因種子組成的種子批，所述轉基因種子將生長成耐除草劑植物，其中所述植物為耐受草甘膦和/或異噁唑草酮的植物。可播種可獲自保藏的種子或從所述種子獲得的種子或后代種子(例如，在與其它具有不同遺傳背景的大豆植物雜交后)，可用本文中描述的草甘膦或HPro抑制劑例如異噁唑草酮處理正在生長的植物以獲得耐受草甘膦或異噁唑草酮的植物，所述植物包含原種事件EE-GM3。NCMB保藏號NCMB 41658和NCMB 41660的種子是分別由至少約95%的包含原種事件EE-GMl或EE-GM2的轉基因種子組成的種子批，所述種子可生長成耐除草劑植物，其中所述植物是抗草銨膦植物?？刹シN種子，用本文中描述的草胺膦處理正在生長的植物以獲得耐草胺膦植物，所述植物包含原種事件EE-GMl或EE-GM2。ATCC保藏號PTA-11041的種子是由至少約95%的以純合子形式包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl的轉基因種子組成的種子批，所述種子可生長成耐除草劑植物，其中所述植物是耐草甘膦、草胺膦和/或異噁唑草酮(isoxaflutole)植物?？刹シN可從保藏的種子獲得或從所述種子獲得(例如，在與具有不同遺傳背景的其它大豆植物雜交后)的植物或后代種子，可用本文中描述的草甘膦、草胺膦和/或HPH)抑制劑例如異噁唑草酮處理正在生長的植物以獲得耐草甘膦、草胺膦和/或異噁唑草酮植物，所述植物包含原種事件EE-GM3和EE-GM1。ATCC保藏號PTA-11042的種子是由至少約95%的以純合子形式包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2的轉基因種子組成的種子批，所述種子將生長成耐除草劑植物，其中所述植物是耐草甘膦、草胺膦和/或異噁唑草酮植物。可播種可從保藏的種子獲得或從所述種子獲得(例如，在與具有不同遺傳背景的其它大豆植物雜交后)的種子或后代種子，可用本文中描述的草甘膦、草胺膦和/或HPH)抑制劑例如異噁唑草酮處理正在生長的植物以獲得耐草甘膦、草胺膦和/或異噁唑草酮植物，所述植物包含原種事件EE-GM3 和 EE-GM2。
本發(fā)明還涉及來自包含原種事件EE-GM3并且還包括原種事件EE-GMl的植物的細胞、組織、子代和后代，所述植物可通過生長為PTA-11041保藏在ATCC的包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的植物獲得，或通過生長來自保藏在NCMB的具有登錄號NCMB 41659的種子的包含原種事件EE-GM3的植物，然后將所述植物與從保藏在NCMB的具有登錄號NCIMB 41658的種子生長而來的包含良種事件EE-GMl的植物雜交來獲得。本發(fā)明還涉及來自包含原種事件EE-GM3并且還包含原種事件EE-GM2的植物的細胞、組織、后代和后代，所述植物可通過生長以PTA-11042保藏在ATCC的原種事件EE-GM3和EE-GM2的植物來獲得，或通過生長來自保藏在NCMB的具有登錄號NCMB 41659的種子的包含原種事件EE-GM3的植物，然后將所述植物與從保藏在NCMB的具有登錄號NCMB 41660的種子生長而來的包含原種事件EE-GM2的植物雜交來獲得。本發(fā)明還涉及可從上文中剛剛描述的大豆植物或種子獲得的植物(例如通過大豆植物或種子的繁殖和/或與其繁育)。本發(fā)明還涉及包含原種事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的大豆植物。 本發(fā)明還涉及用于鑒定包含原種事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的轉基因、其細胞或組織的方法，所述方法基于鑒定表征DNA序列或由這樣的DNA序列編碼的氨基酸序列在轉基因植物、細胞或組織中的存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這樣的表征DNA序列為包含事件的插入位點的至少15bp、15bp、至少20bp、20bp或30bp或更多堿基對的序列，即包含耐除草劑基因的插入的外源DNA的一部分和與其鄰接的大豆基因組的一部分(5’或3’側翼序區(qū)域)，從而允許特異性鑒定原種事件。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GMl或原種事件EE-GM3和EE-GM2的方法，所述方法基于特異性識別EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’和/或3’側翼序列的引物或探針。更具體地，本發(fā)明涉及這樣的方法，所述方法包括使用兩個各自利用至少兩個引物的聚合酶鏈式反應或一個利用至少4個引物的聚合酶鏈式反應擴增存在于生物樣品中的兩個核酸的序列，優(yōu)選以獲得兩個100至SOObp的DNA片段，所述第一引物識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域，所述第二引物識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列，所述第三引物識別EE-GMl或EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域，所述第四引物識別EE-GMl或EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列。用于鑒定EE-GM3的引物可分別識別EE-GM3的5’側翼區(qū)域內(nèi)的序列(SEQ ID No. 2，從位置I至位置1451)或EE-GM3的3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列(SEQ IDNo 3的位置241至位置1408的互補序列)和包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列(SEQIDNo 2的位置1452至1843或SEQ ID No 3的位置I至位置240的互補序列或SEQ ID No20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638或其互補序列)。識別3’側翼區(qū)域的引物可包含SEQ ID No. 5的核苷酸序列，識別包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的引物可包含本文中描述的SEQ ID No. 4或SEQ ID No. :7的核苷酸序列。用于鑒定EE-GMl的引物可分別識別EE-GMl的5’側翼區(qū)域(SEQ ID No. 12，從位置I至位置209)或EE-GMl的3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列(SEQ ID No 13的位置569至位置1000的互補序列)和EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列(SEQ ID No 12的位置210至720或SEQ ID No 13的位置I至位置568的互補序列)。識別EE-GMl的5’側翼區(qū)域的引物包含SEQ ID No. 16的核苷酸序列，識別EE-GMl的外源DNA內(nèi)的序列的引物可包含本文中公開的SEQ ID No. 17的核苷酸序列。用于鑒定EE-GM2的引物可分別識別EE-GM2的5’側翼區(qū)域內(nèi)的序列(SEQ IDNo. 14，從位置I至位置311)或EE-GM2的3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列(SEQ ID No 15的位置508至位置1880的互補序列)和EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列(SEQ ID No14的位置312至810的互補序列或SEQ ID No 15的位置I至位置507)。識別EE-GM2的3’側翼區(qū)域的引物可包含SEQ ID No. 18的核苷酸序列，識別EE-GM2的外源DNA內(nèi)的序列的引物可包含本文中描述的SEQID No. 19的核苷酸序列。可同時或相繼進行PCR擴增。本發(fā)明更具體地涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GMl的方法，所述方法包括使用聚合酶鏈式反應，利用至少兩個分別包含SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物(以獲得約263bp的DNA片段)或利用兩個分別包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物(以獲得約706bp的DNA片段)以及使用聚合酶鏈式反應，利用兩個分別包含SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成 的引物(以獲得約183bp的DNA片段)擴增存在于生物樣品中的核酸的至少兩個序列?？赏瑫r或相繼進行兩個聚合酶鏈式反應。本發(fā)明更具體地涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GM2的方法，所述方法包括使用聚合酶鏈式反應，利用兩個分別包含SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物(以獲得約263bp的DNA片段)，或利用兩個分別包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物(以獲得約706bp的DNA片段)，以及使用聚合酶鏈式反應，利用兩個分別包含SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19的核苷酸序列或(基本上)由核苷酸所述序列組成的引物(以獲得約151bp的DNA片段)擴增存在于生物樣品中的核酸的至少兩個序列?？赏瑫r或相繼進行兩個聚合酶鏈式反應。本發(fā)明還涉及與EE-GMl的特異性側翼序列組合的本文中描述的EE-GM3的特異性側翼序列，所述序列可用于開發(fā)鑒定EE-GM3和EE-GMl在生物樣品中的同時存在的特異性鑒定方法。此類組合的特異性側翼序列還可在鑒定測定中用作參照對照材料。更具體地，本發(fā)明涉及與EE-GMl的5’和/或3’側翼區(qū)域組合的EE-GM3的5’和/或3’側翼序列，所述序列可用于開發(fā)本文中進一步描述的特異性引物和探針。還適合用作參照材料的是與核酸分子(所述核酸分子包含可利用包含SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物擴增的序列)組合的優(yōu)選約150-850bp的核酸分子，所述核酸分子可利用包含SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物擴增的序列，特別地使用此類引物在包含EE-GM3和EE-GMl的材料中獲得此類核酸分子。本發(fā)明還涉及與EE-GM2的特異性側翼序列組合的本文中描述的EE-GM3的特異性側翼序列，所述序列可用于開發(fā)用于鑒定EE-GM3和EE-GM2在生物樣品中的同時存在的特異性鑒定方法。這樣的組合的特異性側翼序列還可在鑒定測定中用作參照對照材料。更具體地，本發(fā)明涉及與EE-GM2的5’和/或3’的側翼區(qū)域組合的EE-GM3的5’和/或3’偵^翼區(qū)域，所述側翼區(qū)域可用于開發(fā)本文中進一步描述的特異性引物和探針。還適合用作參照材料的是與核酸分子(所述核酸分子包含可利用包含EQ ID No. 18和SEQ ID No. 19的核苷酸或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物擴增的序列)組合的優(yōu)選約150-850bp的核酸分子，所述核酸分子包含可利用包含SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的引物擴增的序列，特別地使用此類引物在包含EE-GM3和EE-GM2的材料中獲得此類核酸分子。本發(fā)明還涉及基于此類特異性引物或探針的使用鑒定EE-GM3和EE-GMl在生物樣品中的同時存在的鑒定方法。用于EE-GM3檢測的引物可包含與引物(所述引物包含選自SEQ ID No I的核苷酸序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，例如選自SEQ ID No2的核苷酸1452至核苷酸1843的核苷酸序列的互補序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或由或基本上由所述核苷酸序列組成)組合的選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列或SEQ ID3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列的互補序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或由或基本由所述核苷酸序列組成。用于EE-GMl檢測的引物可包含與引物(所述引物包含選自SEQ ID No 11的核苷酸序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，例如選自SEQ ID No 12的核苷酸219至核苷酸720的核苷酸序列的互補序列或SEQ ID No13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或由 或基本上由所述核苷酸序列組成)組合的選自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列或SEQ ID 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列組成。引物還可包含位于在它們的最3’末端的這些核苷酸序列，并且還包含無關序列或來源于提及的核苷酸序列但包含錯配的序列。本發(fā)明還涉及基于此類特異性引物或探針的使用鑒定EE-GM3和EE-GM2在生物樣品中的同時存在的方法。用于EE-GM3檢測的引物可包含先前段落中描述的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列組成。用于EE-GM2檢測的引物可包含與引物(包含選自SEQ ID No 11的核苷酸序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，例如SEQ ID No 14的核苷酸312至核苷酸810的核苷酸序列的互補序列或SEQ IDNo 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列組成)組合的選自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列或SEQ ID 15的核苷酸508至核苷酸1880的核苷酸序列的互補序列的17至約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列組成。引物還可包含位于它們最3’末端的這些核苷酸序列，并且還包含無關序列或來源于提及的核苷酸序列但包含錯配的序列。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GMl的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的引物或探針和至少一種特異性識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的引物或探針。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GM2的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的引物或探針和至少一種特異性識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的引物或探針。本發(fā)明的試劑盒，除了特異性識別EE-GM3的5’或3’側翼區(qū)域或EE-GMl的5’或3’側翼區(qū)域的引物外，還可包括特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的其它引物和特異性識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的其它引物，以用于PCR鑒定方案。本發(fā)明的試劑盒，除了特異性識別EE-GM3的5’或3’側翼區(qū)域和EE-GM2的5’或3’側翼區(qū)域的引物外，還可包括特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的其它引物和特異性識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的其它引物，以用于PCR鑒定方案。識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的引物可包含SEQ ID No. 5的核苷酸序列并且識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的轉基因或外源DNA的引物可包含SEQ ID No. 4或7的核苷酸序列，或與可包含SEQ ID No. 16的核苷酸序列的識別EE-GMl的5’側翼區(qū)域的引物和識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的轉基因的引物組合的本文中描述的用于EE-GM3檢測的任何其它引物或引物組合可包含SEQ ID No 17的核苷酸序列。
識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的引物可包含SEQ ID No. 5的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的轉基因或外源DNA的引物可包含SEQ ID No. 4或7的核苷酸序列，或與可包含SEQID No. 18的核苷酸序列的識別EE-GM2的5’側翼區(qū)域的引物和識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的轉基因的引物組合的本文中描述的用于EE-GM3檢測的任何其它引物或引物組合可包含SEQ ID No 19的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GMl的試劑盒，所述試劑盒包括包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 4的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的PCR引物和包含SEQ ID 16和SEQ ID 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的PCR引物，以用于基于EE-GM3/EE-GM IPCR的鑒定。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GM2的試劑盒，所述試劑盒包括包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 4的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的PCR引物和包含SEQ ID 18和SEQ ID 19的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列組成的PCR引物，以用于基于EE-GM3/EE-GM2PCR的鑒定。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GMl的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異性探針，第一探針包含對應于與EE-GM3特異性區(qū)域具有80%至100%的序列同一性的序列(或與所述序列互補)的序列或(基本上)由所述序列組成，并且第二探針包含對應于與EE-GMl特異性區(qū)域具有80%至100%的序列同一性的序列(或與所述序列互補)的序列或(基本上)由所述序列組成。優(yōu)選地，第一探針的序列對應于包含EE-GM3的5’或3’側翼區(qū)域的部分的特異性區(qū)域并且所述第二探針對應于包含EE-GMl的5’或3’側翼區(qū)域的部分的特異性區(qū)域。最優(yōu)選地，EE-GM3特異性探針包含與SEQ ID No2的核苷酸1441至1462之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或與ID No. 3的核苷酸220至260之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列組成(或與所述序列互補)，并且EE-GMl特異性探針包含與SEQ ID No 12的核苷酸199至220之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或與SEQ ID No. 13的核苷酸558至579之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列組成(或與所述序列互補)。本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GM2的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異性探針，第一探針包含對應于與EE-GM3特異性區(qū)域具有80%至100%的序列同一性的序列(或與所述序列互補)的序列或(基本上)由所述序列組成，并且第二探針包含對應于與EE-GM2特異性區(qū)域具有80%至100%的序列同一性的序列(或與所述序列互補)的序列或(基本上)由所述序列組成。優(yōu)選地，第一探針的序列對應于包含EE-GM3的5’或3’側翼區(qū)域的部分的特異性區(qū)域并且所述第二探針對應于包含EE-GM2的5’或3’側翼區(qū)域的部分的特異性區(qū)域。最優(yōu)選地，EE-GM3特異性探針包含與SEQ ID No 2的核苷酸1441至1462之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或與SEQ ID No. 3的核苷酸220至260之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列組成(或與所述序列互補)，并且EE-GM2特異性探針包含與SEQ ID No 14的核苷酸301至322之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或與SEQ ID No. 15的核苷酸497至518之間的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列組成(或與所述序列互補)。 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，公開了 DNA序列，所述DNA序列包含事件的連接位點和足夠長度的大豆基因組DNA和每一個事件的包含耐除草劑基因(轉基因)的外源DNA的多 核苷酸以用作用于檢測EE-GM3和EE-GMl的引物或探針。此類序列可分別在連接位點的每一側包含大豆基因組DNA的至少9個核苷酸和EE-GM3或EE-GMl的包含耐除草劑基因(轉基因)的外源DNA的相似數(shù)目的核苷酸。最優(yōu)選地，此類DNA序列包含大豆基因組DNA的至少9個核苷酸和與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3中的連接位點鄰接的包含耐除草劑基因的外源DNA的相似數(shù)目的核苷酸以及大豆基因組DNA的至少9個核苷酸和與SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13中的連接位點鄰接的包含耐除草劑基因的外源DNA的相似數(shù)目的核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，公開了 DNA序列，所述DNA序列包含事件的連接位點和足夠長度的大豆基因組DNA和每一個事件的包含耐除草劑基因(轉基因)的外源DNA的多核苷酸以用作用于檢測EE-GM3和EE-GM2的引物或探針。此類序列可分別在插入位點的每一側包含大豆基因組DNA的至少9個核苷酸和EE-GM3或EE-GM2的包含耐除草劑基因(轉基因)的外源DNA的相似數(shù)目的核苷酸。最優(yōu)選地，此類DNA序列包含大豆基因組DNA的至少9個核苷酸和與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3中的連接位點鄰接的包含耐除草劑基因的外源DNA的相似數(shù)目的核苷酸以及大豆基因組DNA的至少9個核苷酸和與SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15中的連接位點鄰接的包含耐除草劑基因的外源DNA的相似數(shù)目的核苷酸。本發(fā)明包括的方法和試劑盒可用于不同目的例如但不限于下列目的鑒定EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2在植物、植物材料或產(chǎn)物例如但不限于包含植物材料或來源于植物材料的食品或飼料產(chǎn)品(新鮮的或加工的)中的存在或測定其(下限)閾值；此外或可選擇地，為了分離轉基因與非轉基因材料，可將本發(fā)明的方法和試劑盒用于鑒定轉基因植物材料；此外或可選擇地，可將本發(fā)明的方法和試劑盒用于測定包含EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GMl的植物材料的質量(即，純材料百分比)。本發(fā)明還涉及與從EE-GMl或EE-GM2的5’和/或3’側翼序列開發(fā)的特異性引物和探針組合的EE-GM3GM3的5’和/或3’側翼區(qū)域，以及涉及與從EE-GMl或EE-GM2的5’和/或3’側翼序列開發(fā)的特異性引物和探針組合的從EE-GM3的5’和/或3’側翼序列開發(fā)的特異性引物和探針。本發(fā)明還涉及從包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的植物或包含原種事件EE-GM3和EE-GM2的植物獲得的基因組DNA。此類基因組DNA可在本文中描述的鑒定測定中用作參照對照材料。本文中還提供了轉基因耐除草劑大豆植物或其細胞、部分、種子或后代，其各自包含至少兩個原種事件，所述第一原種事件包含外源DNA，所述外源DNA包含i)包含來自玉蜀黍的在植物可表達啟動子的控制下編碼耐草甘膦的EPSPS酶的修飾epsps基因的第一嵌合基因，和ii)包含來自突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescen)的編碼耐HPF1D抑制劑除草劑的酶的修飾hppd基因的第二嵌合基因，并且所述第二原種事件包含含有源自產(chǎn)綠色
鏈霉菌(Streptomyces viridochromogene)的在植物可表達的啟動子控制下編碼草胺膦(或草胺膦)乙酰轉移酶的修飾耐草胺膦基因的(第三)嵌合基因。在一個實施方案中，所述第一原種事件包含緊鄰所述外源DNA的上游和與其鄰接的SEQ ID No 2的核苷酸I至1451以及緊鄰所述外源DNA的下游和與其鄰接的SEQ ID No3的核苷酸241至1408，并且所述第二事件包含緊鄰所述外源DNA的上游和與其鄰接的SEQID No 12的核苷酸I至209以及緊鄰所述外源DNA的下游和與其鄰接的SEQ ID No 13的核苷酸569至1000，或所述第二事件包含緊鄰所述外源DNA的上游和與其鄰接的SEQ ID No14的核苷酸I至311以及緊鄰所述外源DNA的下游和與其鄰接的SEQ ID No 15的核苷酸508 至 1880。在其它實施方案中，所述原種事件可通過與從已在保藏號PTA-11041或PTA-11042下保藏在ATCC的包含所述事件的參照種子生長而來的大豆植物繁育獲得，或可從已在登錄號NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述第一事件的參照種子獲得，和可從已在登錄號NCMB 41658或NCMB登錄號NCMB 41660下保藏在NCMB的包含所述第二事件的參照種子獲得。在另一個實施方案中，所述大豆植物、其細胞、部分、種子或后代的基因組DNA，當使用原種事件鑒定方案，利用兩個分別包含SEQID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列分析其所述第一原種事件時，產(chǎn)生約263bp或263bp的DNA片段，當使用原種事件鑒定方案，利用兩個分別包含SEQ ID No 16和SEQ ID No 17的核苷酸序列分析其所述第二原種事件時，產(chǎn)生約183bp或183bp的DNA片段，或利用兩個分別包含SEQ ID No 18和SEQ ID No 19的核苷酸序列的引物分析時，產(chǎn)生約151bp或151bp的DNA片段。本文中還提供了用于鑒定生物樣品中的包含2個原種事件的轉基因大豆植物或其細胞、部分、種子或后代的方法，其中所述植物、細胞、種子或后代耐草甘膦、草胺膦和HPPD抑制劑除草劑(例如異噁唑草酮)，所述方法包括使用聚合酶鏈式反應，利用至少兩個引物從存在于生物樣品中的所述第一事件的核酸擴增100至500bp的DNA片段，所述引物之一識別上面指定的第一原種事件的5’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或識別所述第一原種事件的3’側翼區(qū)域，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別所述第一事件的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，以及包括使用聚合酶鏈式反應，利用至少兩個引物從存在于生物樣品中的所述第二事件的核酸擴增50至IOOObp或100至500bp的DNA片段，所述引物之一識別上面指定的第二原種事件的5’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列，或識別所述第二原種事件的3’側翼區(qū)域，所述3’側翼區(qū)域包含SEQID No 13的核苷酸569至1000的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別所述第二事件的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列。本文中還提供了用于鑒定生物樣品中的包含2個原種事件的轉基因大豆植物或其細胞、部分、種子或后代的方法，其中所述植物、細胞、種子或后代耐草甘膦、草胺膦和/或HPro抑制劑除草劑(例如異噁唑草酮)，所述方法包括使用聚合酶鏈式反應，利用至少兩個引物從存在于生物樣品中的所述第一事件的核酸擴增50至1000或100至500bp的DNA片段，所述引物之一識別上文中指定的第一原種事件的5’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或識別所述第一原種事件的3’側翼 區(qū)域，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別所述第一事件的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，以及包括使用聚合酶鏈式反應，利用至少兩個引物從存在于生物樣品中的所述第二事件的核酸擴增50至IOOObp或100至500bp的DNA片段，所述引物之一識別上文中指定的第二原種事件的5’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ IDNo 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，或識別所述第二原種事件的3’側翼區(qū)域，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別所述第二事件的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQID No 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列。本文中還提供了用于鑒定生物樣品中的包含2個原種事件并且耐草甘膦、草胺膦和HPro抑制劑除草劑(例如異噁唑草酮)的轉基因大豆植物或其細胞、部分、種子或后代的試劑盒，所述試劑盒包括一種識別上文中指定的第一原種事件的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一種識別所述第一原種事件的3’側翼區(qū)域的引物，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，一種識別所述第一事件的外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，并且所述試劑盒包括一種識別上文中指定的第二原種事件的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，或一種識別所述第二原種事件的3’側翼區(qū)域的引物，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別所述第二事件的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列。本文中還提供的用于鑒定生物樣品中的包含2個原種事件并且耐草甘膦、草胺膦和HPro抑制劑除草劑(例如異噁唑草酮)的轉基因大豆植物或其細胞、部分、種子或后代的試劑盒，所述試劑盒包括一種識別上文中指定的第一原種事件的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一種識別所述第一原種事件的3’側翼區(qū)域，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，一種識別所述第一事件的外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，并且所述試劑盒包括一種識別上文中指定的第二原種事件的5’側翼區(qū)域(所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列)或識別所述第二原種事件的3’側翼區(qū)域(所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列)的引物，所述引物的另一種引物識別所述第二事件的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列。 本文中還提供了在它們的基因組中包含核酸分子的大豆植物、植物細胞、組織或種子(所述核酸分子包含與SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列、SEQ ID No. 20的核苷酸位置2257至核苷酸位置16601的核苷酸序列或它們的互補序列具有至少97%、98%或至少99%或99. 5%的序列同一性的核苷酸序列或與SEQ ID No. 20或其互補序列具有至少97%、98%或至少99%或99. 5%的序列同一性的核苷酸序列)，以及在它們的基因組中包含核酸分子的大豆植物、植物細胞、組織或種子(所述核酸分子包含與EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互補序列具有至少97%、98%或至少99%或99. 5%的序列同一性的核苷酸序列)，已在保藏號NCMB 41658下保藏的包含EE-GMl的參照種子和已在保藏號NCMB 41660下保藏的包含EE-GM2的參照種子。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述植物、植物細胞、組織或種子中的EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列是SEQ ID No 12或13中的DNA序列(例如外源DNA序列)，或SEQ ID No 14或15中的DNA序列(例如外源DNA序列)，或包含SEQID No 12的序列的第一核苷酸與SEQ ID No 13的序列的最后一個核苷酸之間的SEQ ID No 12和13的植物基因組(例如在包含本發(fā)明的EE-GMl或EE-GM2的保藏的種子中)的DNA序列，或包含SEQ ID No 14的序列的第一核苷酸與SEQ ID No 15的序列的最后一個核苷酸之間的SEQ ID No 14和15的植物基因組的DNA序列。本發(fā)明的一個實施方案提供在它們的基因組中包含核酸分子的大豆植物、植物細胞、組織或種子(所述核酸分子與SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列雜交，或與SEQID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列雜交，或SEQID No. 20的核苷酸序列或其互補序列雜交)，以及在它們的基因組中包含核酸分子的大豆植物、植物細胞、組織或種子(所述核酸分子與EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互補序列雜交)，已在保藏號NCMB 41658下保藏的包含EE-GMl的參照種子和已在保藏號NCMB41660下保藏的包含EE-GM2的參照種子。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述植物、植物細胞、組織或種子中的EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列是SEQ ID No 12或13中的外源DNA，或SEQID No 14或15中的外源DNA，或包含SEQ ID No 12的序列的第一核苷酸與SEQ IDNo 13的序列的最后一個核苷酸之間的SEQ ID Nol2和13的植物基因組(例如在包含本發(fā)明的EE-GMl或EE-GM2的保藏的種子中)的外源DNA序列，或包含SEQ ID No 14的序列的第一核苷酸與SEQ ID No 15的序列的最后一個核苷酸之間的SEQ ID No 14和15的植物基因組的外源DNA序列。附圖簡述可結合附圖(通過引用并入本文)理解無意將本發(fā)明限定于描述的特定實施方案的下列實施例，其中


圖1 :引用的核苷酸序列與原種事件EE-GM3的引物之間的關系的示意圖。黑色條外源DNA ;陰影條植物來源的DNA ;格紋箭頭(a):嵌合HPTO PF W366編碼基因(關于嵌合基因的組成參見表I);陰影箭頭(b):嵌合2mEPSPS編碼基因(關于嵌合基因的組成參見表I);黑色箭頭寡核苷酸引物，條下的數(shù)字表示核苷酸位置；(c)是指顯示的核苷酸序列的互補序列；注意示意圖未按規(guī)定比例繪制。圖2 :通過針對EE-GM3開發(fā)的PCR鑒定方案獲得的結果。凝膠的上樣序列泳道1:分子量標準(IOObp梯帶);泳道2和3 :來自包含轉基因事件EE-GM3的大豆植物的DNA 樣品；泳道4-7 :來自未包含原種事件EE-GM3但包含相同的耐除草劑基因(其它轉化事件)的轉基因大豆植物的DNA樣品；泳道8 :來自wt大豆的DNA樣品；泳道9 :無模板DNA對照；泳道10 :分子量標準。圖3 :引用的核苷酸序列與原種事件EE-GMl的引物之間的關系的示意圖。黑色條外源DNA ;陰影條植物來源的DNA ;水平條紋箭頭(d):嵌合草胺膦乙酰轉移酶編碼基因(關于嵌合基因的組成參見SEQ ID No. 11);黑色箭頭寡核苷酸引物，條下的數(shù)字表示核苷酸位置；(c)是指顯示的核苷酸序列的互補序列。注意示意圖未按規(guī)定比例繪制。圖4 :引用的核苷酸序列與原種事件EE-GM2的引物之間的關系的示意圖。黑色條外源DNA ;陰影條植物來源的DNA ;水平條紋箭頭(d):嵌合草胺膦乙酰轉移酶編碼基因(關于嵌合基因的組成參見SEQ ID No. 11);黑色箭頭寡核苷酸引物，條下的數(shù)字表示核苷酸位置；(c)是指顯示的核苷酸序列的互補序列。NA :不適用的；注意示意圖未按規(guī)定比例繪制。圖5 :針對EE-GMl開發(fā)的PCR鑒定方案。凝膠的上樣序列泳道1:來自包含轉基因事件EE-GMl的大豆植物的DNA樣品；泳道2 :來自未包含原種事件EE-GMl的轉基因大豆植物的DNA樣品；泳道3 :來自野生型大豆植物的對照DNA樣品；泳道4 :無模板DNA對照；泳道5 :分子量標準。圖6 :針對EE-GM2開發(fā)的PCR鑒定方案。凝膠的上樣序列泳道1:來自包含轉基因事件EE-GM2的大豆植物的DNA樣品；泳道2 :來自未包含原種事件EE-GM2的轉基因大豆植物的DNA樣品；泳道3 :來自野生型大豆植物的對照DNA樣品；泳道4 :無模板DNA對照；泳道5 :分子量標準。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的詳細描述重組DNA分子在植物基因組中的組合通常由細胞或組織的轉化產(chǎn)生。整合的具體位點通常歸因于隨機整合。作為用重組DNA或“轉化DNA”轉化植物細胞或組織的結果而被引入植物基因組的和源自這樣的轉化DNA的DNA在下文中稱為包含一個或多個“轉基因”的“外源DNA”。EE-GM3的轉基因是草甘膦和HPH)抑制劑耐除草劑基因。在本發(fā)明的說明書中“植物DNA”將指源自已被轉化的植物的DNA。植物DNA通常見于對應的野生型植物的相同基因座中。外源DNA的特征可在于重組DNA分子在植物基因組中整合的位點上的定位和構型。其中已插入了重組DNA的植物基因組中的位置也稱為“插入位點”或“靶位點”。可將重組DNA至稱為“插入前植物DNA”的植物基因組的區(qū)域中的插入與植物DNA的缺失(稱為“靶位點缺失”)結合。如本文中所用，“側翼區(qū)域”或“側翼序列”是指與引入的DNA不同的至少20bp，優(yōu)選至少50bp和達到5000bp的DNA的序列，優(yōu)選來自植物基因組的恰好位于外源DNA的上游并且與其鄰接或恰好位于外源DNA的下游并且與其鄰接的DNA。導致外源DNA的隨機整合的轉化方法將導致具有不同側翼區(qū)域的轉化體，所述側翼區(qū)域對于每一個轉化體是特征性的和獨特的。當通過常規(guī)雜交將重組DNA引入植物時，其在植物基因組中的插入位點或其側翼區(qū)域將通常不被改變。如本文中所用，“分離的核酸(序列)”或“分離的DNA (序列)”是指不再存在于其所分離自的天然環(huán)境中的核酸或DNA(序列)，例如，在另一種細菌宿主或植物基因組中的核酸序列，或融合至來自另一種來源的DNA或核酸的核酸或DNA，例如當包含在處于植物可表達啟動子的控制之下的嵌合基因中時。
事件定義為(人工)基因座，所述基因座，作為基因工程的結果，攜帶包含至少一個拷貝的目標基因的外源DNA或轉基因。事件的常見等位基因狀態(tài)為外源DNA的存在或不存在。事件的表型特征在于轉基因的表達。在基因水平上，事件是植物的基因組成的部分。在分子水平上，事件的特征在于限制性圖譜(例如，通過Southern印跡確定的)，在于轉基因的上游和/或下游側翼序列、分子標志的定位和/轉基因的分子構型。通常地，用包含至少一個目標基因的DNA轉化植物產(chǎn)生包含許多分離事件的轉化體群體，所述每一個轉化體是獨特的。事件的特征在于外源DNA和側翼序列的至少一個序列。如本文中所用，原種事件是基于轉基因的表達和穩(wěn)定性以及其與包含其的植物的最佳農(nóng)藝特征的相容性，從通過利用相同轉化DNA的轉化獲得的一組事件選擇的事件。因此用于原種事件選擇的標準是如下的一項或多項，優(yōu)選兩項或更多項，有利地所有項a)外源DNA的存在不削弱植物的其它期望的特征，例如與農(nóng)藝性狀或商業(yè)價值相關的特征；b)事件的特征在于明確確定的分子構型，所述分子構型可穩(wěn)定地遺傳并且可針對其開發(fā)用于身份控制(identity control)的適當工具；c)目標基因在攜有所述事件的植物可能在正常農(nóng)藝應用中所暴露的許多環(huán)境條件下，以商業(yè)可接受的水平在事件的雜合子(或半合子)和純合子條件中都顯示正確的、適當?shù)暮头€(wěn)定的空間和時間表型表達。優(yōu)選地，將外源DNA與植物基因組中的位置連接，所述位置使得能夠容易地進行至期望的商業(yè)遺傳背景中的基因滲入。通過在不同的相關遺傳背景中進行原種事件的基因滲入，然后觀察對1、2個或所有標準例如上述a)、b)和c)的順應性來將事件的狀態(tài)確認作為原種事件。因此“原種事件”是指滿足上述標準的包含外源DNA的基因座。植物、植物材料或后代例如種子可在其基因組中包含一個或多個原種事件。開發(fā)用于鑒定原種事件或包含原種事件的植物或植物材料或包含含有原種事件的植物材料的產(chǎn)物的工具基于原種事件的特定基因組特征，例如包含外源DNA的基因組區(qū)域的特定限制性圖譜、分子標志或外源DNA的側翼區(qū)域的序列。
一旦已對外源DNA的一個或兩個側翼區(qū)域進行了測序，則可利用分子生物學技術開發(fā)特異性識別樣品的核酸(DNA或RNA)中的該(這些)序列的引物和探針。例如，可開發(fā)PCR法來鑒定生物樣品(例如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)物的樣品)中的原種事件。這樣的PCR基于至少兩個特異性“引物”，一個識別原種事件的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列并且另一個識別外源DNA內(nèi)的序列。引物優(yōu)選具有15至35個核苷酸的序列，所述序列在最優(yōu)化的PCR條件下分別“特異性識別”原種事件的5’或3’側翼區(qū)域和原種事件的外源DNA內(nèi)的序列，以便從包含原種事件的核酸樣品擴增特異性片段(“整合片段”或鑒別擴增子(discriminating amp I icon)) 0這意味著在最優(yōu)化的PCR條件下只有祀向整合片段而無植物基因組或外源DNA中的其它序列被擴增。適用于EE-GM3的鑒定的PCR引物可以是下列序列-長度范圍為17nt至約200nt的寡核苷酸，其在它們的3’末端上包含選自5’側翼序列(SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451)中的植物DNA的至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列(識別5’側翼序列的引物)；或-長度范圍為17nt至約200nt的寡核苷酸，其在它們的3’末端上包含選自3’側翼序列(SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列)中的植物DNA的至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列(識別3’側翼序列的引物)；或-長度范圍為17nt至約200nt的寡核苷酸，其在它們的3’末端上包含選自插入的DNA序列(SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列)的至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列(識別外源DNA的引物)；或-長度范圍為17nt至約200nt的寡核苷酸，其包含選自插入的DNA序列(SEQIDNo 3的核苷酸I至核苷酸240)的至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；或-長度范圍為17nt至約200nt的寡核苷酸，其包含選自插入的DNA片段或其互補序列(SEQ ID No I或SEQ ID No 20的核苷酸位置1452至16638)的核苷酸序列的至少17 個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。所述引物當然可以比提及的17個連續(xù)核苷酸長，可以例如為20、21、30、35、50、75、100、150、200nt長或甚至更長。引物可完全由選自提及的側翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列的核苷酸序列組成。然而，引物在它們的5’末端(即定位在3’的17個連續(xù)核苷酸之外的)上的核苷酸序列不太重要。因此，引物的5’序列可視情況而定包含選自側翼序列或外源DNA的核苷酸序列或由所述序列組成，但可包含幾個(例如，1、2、5或10)錯配。引物的5’序列甚至可完全為與側翼序列或外源DNA無關的核苷酸序列，例如代表一個或多個限制性內(nèi)切酶識別位點的核苷酸序列。此類無關序列或具有錯配的側翼DNA序列應當優(yōu)選不長于100，更優(yōu)選不長于50或甚至25個核苷酸。此外，適當?shù)囊锟稍谒鼈兊?’末端包含橫跨植物DNA源性序列與外源DNA序列之間的連接區(qū)(位于EE-GM3的SEQ ID No 2的核苷酸1451-1452和SEQ ID No 3的核苷酸240-241上)的核苷酸序列或由或基本上由所述核苷酸序列組成，只要提及的定位在3’的17個連續(xù)核苷酸不僅僅來源于SEQ ID No 2或3中的外源DNA或植物源性序列。對于本領域技術人員也立即明白的是恰當選擇的PCR引物不應當包含彼此互補的序列。
為了本發(fā)明的目的，“SEQ ID No X中所示的核苷酸序列的互補序列”是可通過按照沙加夫法則(AeT; GeQ)用它們的互補核苷酸替代核苷酸并且以5’至3’方向，即以
所示的核苷酸序列的相反方向讀取序列從所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。適用于EE-GM3的引物的實例是SEQ ID No 5(3’側翼序列識別引物)、SEQ ID No4(與3’側翼序列識別引物一起使用的外源DNA識別引物)或SEQ ID No 7(與3’側翼序列識別引物一起使用的外源DNA識別引物)的寡核苷酸序列。適用于EE-GM3的寡核苷酸引物的其它實例在它們的3’末端包含下列序列或(基本上)由此類序列組成a. 5’側翼序列識別引物-SEQ ID No 2的核苷酸264至核苷酸283的核苷酸序列 -SEQ ID No 2的核苷酸266至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1240至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸265至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸265至核苷酸283的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1239至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1241至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1244至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1248至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1250至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸262至核苷酸279的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸263至核苷酸279的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸264至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸266至核苷酸283的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1238至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1242至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1243至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1245至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1247至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1249至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1249至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸263至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸267至核苷酸283的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1242至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1243至核苷酸1259的核苷酸序列--SEQ ID No 2的核苷酸1246至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1246至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1248至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1250至核苷酸1271的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1250至核苷酸1267的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的核苷酸1241至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1245至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1247至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1247至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1249至核苷酸1271的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1242至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1241至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1243至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1240至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1244至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1239至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1245至核苷酸1261的核苷酸序列b.與5’側翼序列識別引物一起使用的外源DNA序列識別引物-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1751的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1735至核苷酸1754的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1750的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1750的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1752的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1749的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1749的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1751的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1753的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1748的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1748的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1735至核苷酸1751的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1752的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1754的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1747的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1753的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1746的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1745的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1747的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1744的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1748的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1749的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1745的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1744的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1746的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1747的核苷酸序列的互補序列
SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1748的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1724至核苷酸1744的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1724至核苷酸1745的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1724至核苷酸1746的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1461至核苷酸1478的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1670至核苷酸1686的核苷酸序列的互補序列SEQ ID No 2的核苷酸1469至核苷酸1486的核苷酸序列的互補序列 -SEQ ID No 2的核苷酸1508至核苷酸1527的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1667至核苷酸1686的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1670至核苷酸1687的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1673至核苷酸1689的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1704的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1705的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1692至核苷酸1709的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1467至核苷酸1486的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1497的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1498的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1491至核苷酸1507的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1491至核苷酸1508的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1672至核苷酸1688的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1673至核苷酸1690的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1673至核苷酸1691的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1706的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1691至核苷酸1707的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1691至核苷酸1708的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1469至核苷酸1487的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1499的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1505的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1506的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1507的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1508的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1666至核苷酸1686的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1667至核苷酸1687的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1670至核苷酸1688的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1672至核苷酸1689的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1707的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1691至核苷酸1709的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1692至核苷酸1710的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1500的核苷酸序列的互補序列
-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1509的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1689的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1672至核苷酸1690的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1672至核苷酸1691的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1705的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1706的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1710的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1488的核苷酸序列的互補序列
-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1507的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1510的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1512的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1513的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1514的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1673至核苷酸1692的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1694的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1695的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1696的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1703的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1704的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1711的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1488的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1506的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1511的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1690的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1697的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1688至核苷酸1709的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1467至核苷酸1487的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1508的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1511的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1512的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1666至核苷酸1687的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1667至核苷酸1688的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1672至核苷酸1692的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1673至核苷酸1693的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1707的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1490的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1491的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1481至核苷酸1501的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1489至核苷酸1509的核苷酸序列的互補序列
-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1515的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1691的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1673至核苷酸1694的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1698的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1489的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1667至核苷酸1689的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1708的核苷酸序列的互補序列·-SEQ ID No2的核苷酸1688至核苷酸1710的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1711的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1492的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1489至核苷酸1510的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1666至核苷酸1688的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1709的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1712的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1467至核苷酸1488的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1490的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1509的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1489至核苷酸1511的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1699的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1493的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1494的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1481至核苷酸1502的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1692的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1491的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1510的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1712的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1713的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1714的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1467至核苷酸1489的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1700的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1481至核苷酸1503的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1713的核苷酸序列的互補序列c.3’側翼序列識別引物-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸847的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸849的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸846的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸848的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸848的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸850的核苷酸序列的互補序列
-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸845的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸847的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸849的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸851的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸844的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸846的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸850的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸852的核苷酸序列的互補序列
-SEQ ID No3的核苷酸992至核苷酸1009的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸731至核苷酸752的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸795的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸731至核苷酸753的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸794的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸796的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸793的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸797的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸792的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸798的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸752的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸753的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸754的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸755的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸838至核苷酸854的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸246至核苷酸263的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸838至核苷酸855的核苷酸序列的互補序列-SEQ ID No3的核苷酸245至核苷酸264的核苷酸序列的互補序列d.與3’側翼序列識別引物一起使用的外源DNA序列識別引物-SEQ ID No3的核苷酸173至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸22至核苷酸41的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸172至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸174至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸191至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸171至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸175至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸190至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸192至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸176至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸189至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸193至核苷酸210的核苷酸序列
-SEQ ID No 3的核苷酸188至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸194至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸199至核苷酸218的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸200至核苷酸218的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸197至核苷酸218的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸201至核苷酸218的核苷酸序列
-SEQ ID No 3的核苷酸201至核苷酸220的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸200至核苷酸220的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸199至核苷酸220的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸200至核苷酸221的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸199至核苷酸221的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸150至核苷酸172的核苷酸序列適用于鑒定EE-GMl的PCR引物已描述于W02006/108674中，特別是在第8頁第4行至第26頁第7行(通過引用并入本文)。適用于鑒定EE-GM2的PCR引物已描述于W02006/108675中，特別是在第8頁第4行至第33頁第4行(通過引用并入本文)。如本文中所用，“SEQ ID No. Z的位置X至位置Y的核苷酸序列”表示包含兩個核苷酸終點的核苷酸序列。優(yōu)選地，擴增片段具有50至500個核苷酸的長度，例如，100至350個核苷酸的長度。特異性引物可具有分別與原種事件以及原種事件的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列具有80至100%的同一性的序列，只要錯配仍然允許在最優(yōu)化的PCR條件下利用這些引物特異性鑒定所述原種事件。然而可允許的錯配的范圍可由本領域技術人員憑經(jīng)驗容易地確定或對于本領域技術人員來說是已知的。整合片段的檢測可以以各種方式進行，例如通過凝膠分析后進行大小評估。還可對整合片段進行直接測序。用于檢測擴增的DNA片段的其它序列特異性方法在本領域也是已知的。由于引物的序列及其在基因組中的相對位置對于原種事件是獨特的，因此整合片段的擴增將只在包含原種事件(的核酸)的生物樣品中發(fā)生。優(yōu)選地，當進行PCR以鑒定原種事件EE-GM3和EE-GMl或原種事件EE-GM3和EE-GM2在未知樣品中的存在時，將對照包括在一組引物中，可利用所述引物擴增所述事件的植物物種的“管家基因”內(nèi)的片段。管家基因是在大多數(shù)細胞類型中表達并且與對于所有細胞是共同的基礎代謝活性有關的基因。優(yōu)選地，從管家基因擴增的片段大于擴增的整合片段。取決于待分析的樣品，可包括其它對照。標準PCR方案描述于本領域中，例如描述于’ PCR擴增手冊〃 (Roche MolecularBiochemicals,第2版，1999)和其它參考資料中。在針對每一個原種事件的“PCR(或聚合酶鏈式反應)鑒定方案”中指定了用于PCR的最佳條件，包括特異性引物的序列。然而應理解，針對具體的實驗條件可能需要調(diào)整PCR鑒定方案的許多參數(shù)，或略微改變所述參數(shù)以獲得相似的結果。例如，使用不同的方法制備DNA可能需要調(diào)整例如所使用的引物、聚合酶的量和退火條件。類似地，其它引物的選擇可確定用于PCR鑒定方案的其它最佳條件。然而這些調(diào)整對于本領域技術人員來說是顯然的，并且在現(xiàn)有PCR應用手冊例如上文中引用的手冊中進行進一步詳細說明?；蛘撸禺愋砸锟捎糜跀U增可用作用于鑒定生物樣品中的EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的“特異性探針”的整合片段。在允許探針與樣品核酸中的它們的對應片段雜交的條件下將生物樣品的核酸與探針接觸，導致核酸/探針雜交體的形成。可檢測(例如通過核酸或探針的標記)這類雜交體的形成，其中這類雜交體的形成表示存在EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2。基于與特異性探針(在固相載體上或在溶液中)雜交的此類鑒定方法已在本領域中進行了描述。特異性探針優(yōu)選是在最優(yōu)化條件下與原種事件的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的區(qū)域(優(yōu)選還包含與其鄰接的外源DNA的部分(在下文中稱為“特異性區(qū)域”))特異性雜交的序列。優(yōu)選， 特異性探針包含與特異性區(qū)域的核苷酸序列具有至少80%、優(yōu)選80至85%、更優(yōu)選85至90%、特別優(yōu)選90至95%、最優(yōu)選95%至100%的同一性(或互補)的50至500bp，優(yōu)選100至350bp的序列。優(yōu)選地，所述特異性探針將包含與原種事件特異性區(qū)域具有同一性(或互補)的約15至約100個連續(xù)核苷酸的序列。此外，還可使用本文中提供的原種事件特異性序列信息來開發(fā)對于原種事件EE-GM3和EE-GMl或對于原種事件EE-GM3和EE-GM2是特異的檢測方法，所述方法與基于PCR的擴增法不同。此類替代檢測方法包括基于特定核酸結構的侵入切割(invasive cleavage)的線性信號放大檢測法,也稱為InvaderTM技術(如例如美國專利5，985，557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”，6，001，567 “Detection of NucleicAcid sequences by Invader Directed Cleavage”中所描述的，通過引用并入本文)。為了利用該方法進行EE-GM3檢測，靶序列可與包含SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互補序列的標記的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，并且還可與包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互補序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第一寡核苷酸與第二寡核苷酸重疊至少一個寡核苷酸。通過該雜交產(chǎn)生的雙鏈體或三鏈體結構允許利用酶<Cleavase )進行選擇性探針切割，從而使靶序列保持完整。隨后可能地通過導致進一步信號放大的中間步驟檢測切割的標記探針。為了利用該方法進行EE-GMl檢測，靶序列可與包含SEQ ID No 12的核苷酸210至核苷酸227的核苷酸序列或其互補序列的標記的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸561至核苷酸568的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，并且還可與包含SEQ IDNo 12的核苷酸192至核苷酸209的核苷酸序列或其互補序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸586的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第一寡核苷酸與第二寡核苷酸重疊至少一個寡核苷酸。通過該雜交產(chǎn)生的雙鏈體或三鏈體結構允許利用酶(Clt'avase )進行選擇性探針切割，從而使靶序列保持完整。隨后可能地通過導致進一步信號放大的中間步驟檢測切割的標記探針。為了利用該方法進行EE-GM2檢測，靶序列可與包含SEQ ID No 14的核苷酸312至核苷酸329的核苷酸序列或其互補序列的標記的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 15的核苷酸490至核苷酸507的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，并且還可與包含SEQ IDNo 14的核苷酸294至核苷酸311的核苷酸序列或其互補序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸525的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第一寡核苷酸與第二寡核苷酸重疊至少一個寡核苷酸。通過該雜交產(chǎn)生的雙鏈體或三鏈體結構允許利用酶(Cleavase )進行選擇性探針切割，從而使靶序列保持完整。隨后可能地通過導致進一步信號放大的中間步驟檢測切割的標記探針。如本文中所用，“試劑盒”是指為了進行本發(fā)明的方法，更具體地，鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3或確定包含EE-GM3的植物材料的接合性狀態(tài)而使用的一組試劑。更具體地，本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)選實施方案包括至少一個或兩個如上所述用于鑒定原種事件的特異性引物，或用于確定接合性狀態(tài)的三個特異性引物。任選地，試劑盒還可包括本文中描述的用于PCR鑒定方案的任何其它試劑?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，試劑盒可包括上述特異性探針，其與生物樣品的核酸特異性雜交以鑒定EE-GM3存在于其中。任選地，試劑盒還可包括用于使用特異性探針鑒定生物樣品中的EE-GM3的任何其它試劑(例如但不限于雜交緩沖液、標記物)。為了進行質量控制(例如，種子批的純度)、檢測原種事件在植物材料或包含或來源于植物材料的材料(例如但不限于食品或飼料產(chǎn)品)中的存在或不存在，可使用本發(fā)明 的試劑盒，并且特別地可調(diào)整其組分。如本文中所用，關于核苷酸序列(DNA或RNA)的“序列同一性”是指具有相同核苷酸的位置的數(shù)目除以兩個序列的較短者中的核苷酸序列的數(shù)目。利用Wilbur和Lipmann算法(Wilbur 和 Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sc1. USA 80:726)，使用 20 個核苷酸的窗口大小、4個核苷酸的字長以及為4的空位罰分進行兩個核苷酸序列的比對?？梢岳缡褂?Genetics Computer Group 的序列分析軟件包(GCG, University of WisconsinBiotechnology Center)方便地進行序列數(shù)據(jù)的計算機輔助分析和解釋,包括上文中描述的序列比對。當此類序列具有至少約75%、特別地至少約80%、更特別地至少約85%、更特別地至少約90%、特別地至少約95%、更特別地至少約98%或至少約99%的序列同一性時,序列被標示為“基本上相似”。很清楚，當RNA序列被認為與DNA基本上相似或與DNA序列具有一定程度的序列同一性時，DNA序列中的胸苷(T)被認為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。同樣地，很清楚小的差異或突變可隨著時間過去在DNA序列中出現(xiàn)并且對于本發(fā)明的事件特異性引物或探針可允許一些錯配，這樣在本文中在本發(fā)明的任何實施方案中對于本發(fā)明的任何3’或5’側翼DNA或任何插入物或外源DNA或任何引物或探針指定的任何DNA序列，也包括基本上與本文中提供的序列相似的序列，例如與本發(fā)明的任何3’或5’側翼DNA、任何引物或探針或任何插入物或外源DNA的給定的序列雜交或與所述序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或至少99%的序列同一性的序列。如本文中所用，術語“引物”包括能夠以模板依賴性方法例如PCR引發(fā)新生核酸的合成的任何核酸。通常地，引物是10至30個核苷酸的寡核苷酸，但可使用更長的序列?？梢砸噪p鏈形式提供引物，盡管單鏈形式是優(yōu)選的。探針可用作引物，但被設計用以結合靶DNA或RNA并且無需用于擴增過程中。如本文中所用，當指特異性引物時，術語“識別”是指特異性引物在方法中所示的條件(例如PCR鑒定方案的條件)下與原始事件的核酸序列特異性雜交的事實，其中通過陽性對照和陰性對照的存在確定特異性。如本文中所用，術語“雜交”當指特異性探針時，是指探針在標準嚴格條件下結合原種事件的核酸序列特異性區(qū)域的事實。如本文中所用，標準嚴格條件是指本文中描述的用于雜交的條件或指如由 Sambrook 等，1989 (Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)描述的常規(guī)雜交條件,所述雜交條件例如可包括下列步驟1)將植物基因組DNA片段固定在濾膜上，2)將濾膜在42°C下于50%甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt's試劑和0. 1%SDS中預雜交I或2小時，或在68°C下于6XSSC、2XDenhardt’ s試劑和0. 1%SDS中預雜交I至2小時，3)添加已被標記的雜交探針，4)溫育16至24小時，5)在室溫下于IX SSC、0. 1%SDS中洗滌濾膜20分鐘，6)在68°C下于0. 2X SSC, 0. 1%SDS中洗滌濾膜3次，每次20分鐘，和7)使用增感屏，將濾膜在_70°C下暴露于X-射線膠片24至48小時。如本文中所用，生物樣品是植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)物的樣品。術語“植物”意欲包括處于任何成熟階段的大豆(大豆)植物組織以及獲自或來源于任何這樣的植物的任何細胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細胞、配子、細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質體。如本文中所用，“植物材料”是指獲自或來源于植物的材料。包含植物材料的產(chǎn)物涉及食品、飼料或使用植物材料產(chǎn)生的或可被植物材料污染的其它產(chǎn)
物。應理解，在本發(fā)明的說明書中，測試此類生物樣品的對于EE-GM3、EE-GMl和EE-GM2有特異性的核酸的存在，所述核酸的存在暗示著核酸在樣品中的存在。因此本文中提及的用于鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3和EE-GM2或EE-GM3和EE-GMl的方法涉及鑒定生物樣品中的包含原種事件的核酸。如本文中所用，“包含”將解釋為指定提及的所述特征、整數(shù)、步驟、試劑或組分的存在，但不排除一個或多個特征、整數(shù)、步驟或組合分或其組群的存在或添加。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白質可包含比實際上引述的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即包括在更大的核酸或蛋白質中。包含功能或結構上確定的DNA序列的嵌合基因可包含額外的DNA序列，例如啟動子和轉錄終止序列。本發(fā)明還涉及在大豆中進行的一堆原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl或一堆原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2的開發(fā)，包含一堆此類事件的植物，從這些植物獲得的后代以及來源于包含這些堆的植物的植物細胞或植物材料?？扇鐚嵤├?中所述獲得包含原種事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的植物?？墒褂贸Ｒ?guī)繁育法將包含單個事件的植物雜交，然后鑒定其包含兩個不同事件的后代來獲得堆?？砂凑諏嵤├?中針對EE-GM3和EE-GMl所描述的PCR鑒定方案鑒定包含EE-GM3和EE-GMl的大豆植物或植物材料。簡而言之，使用特異性識別EE-GM3的5’或3’側翼序列內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO :5的序列的引物和識別外源DNA內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO 4的序列的引物，以及還使用特異性識別EE-GMl的5’或3’側翼序列內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO 16的序列的引物和識別外源DNA內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO :17的序列的引物通過PCR擴增存在于生物樣品中的大豆基因組DNA?？砂凑諏嵤├?中針對EE-GM3和EE-GM2所描述的PCR鑒定方案鑒定包含EE-GM3和EE-GM2的大豆植物或植物材料。簡而言之，使用特異性識別EE-GM3的5’或3’側翼序列內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO :5的序列的引物和識別外源DNA內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO 4的序列的引物，以及還使用特異性識別EE-GM2的5’或3’側翼序列內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ ID NO 18的序列的引物和識別外源DNA內(nèi)的序列的引物例如具有SEQ IDNO 19的序列的引物通過PCR擴增存在于生物樣品中的大豆基因組DNA。擴增內(nèi)源大豆序列的部分的DNA引物用作PCR擴增的陽性對照。當進行PCR擴增時，材料產(chǎn)生預期大小的片段，材料包含來自具有原種事件EE-GM3和EE-GMl的大豆植物或來自具有原種事件EE-GM3和EE-GM2的大豆植物的植物材料。具有EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的植物的特征在于它們的草甘膦抗性，以及在于它們對HPro抑制劑例如異噁唑草酮的抗性以及還在于它們對草銨膦的抗性。具有事件堆的植物的特征也在于在除草劑應用不存在的情況下具有可與商購獲得的大豆品種相比較的農(nóng)藝特征。已觀察到，外源DNA在本文中描述的大豆植物基因組的插入?yún)^(qū)域中的存在賦予了包含該事件的植物特別令人感興趣的表型和分子特征。本發(fā)明的一個實施方案在大豆植物中提供了可通過在大豆基因組的特定位置插入轉基因獲得的原種事件EE-GM3和EE-GMl和/或EE-GM2的組合，所述原種事件賦予此類大豆植物對草甘膦、草胺膦和HPH)抑制劑除草劑例如異噁唑草酮的抗性，其中與等基因系相比較(如本文中所用，“等基因系”或“近等基因系”是具有相同遺傳背景但不存在轉基因的大豆品系，例如具有與用于轉化的植物相同的遺傳背景的植物，或已失去轉基因的分離姊妹系)，此類原種事件對此類大豆的農(nóng)藝性狀不產(chǎn)生負面影響此類大豆植物的產(chǎn)量的任何影響。具體地，本發(fā)明在大豆植物中提供了原種事件EE-GM3和EE-GMl和/或EE-GM2的組合，其中與等基因系相比較，所述原種事件在此類大豆植物的基因組中的插入或存在在此類大豆植物中不引起增加對疾病的易感性，不引起產(chǎn)量抑制現(xiàn)象，或不引起增強的倒伏。因此，本發(fā)明在大豆植物中提供了稱為EE-GM3和EE-GMl和/或EE-GM2的原種事件的組合，所述組合產(chǎn)生可耐受草甘膦、草胺膦和HPH)抑制劑除草劑(同時或單獨地)的施用而與等基因系相比較不負面影響所述大豆植物的產(chǎn)量的大豆植物，所述大豆植物在它們的疾病易感性或倒伏方面與等基因大豆植物相比較不具有統(tǒng)計上顯著的差異。這些特征使得原種事件的現(xiàn)有組合對控制大豆田中的耐草甘膦的雜草極具吸引力，并且還可用于在大豆田中防止或延遲其它耐草甘膦的發(fā)展(例如，通過施用草甘膦和異噁唑草酮和/或草銨膦，或通過施用異噁唑草酮和草甘膦和/或草銨膦，或通過施用草胺膦和草甘膦和/或異噁唑草酮，確保至少2個或甚至3個不同作用模式的除草劑施用于大豆田)。本文中還提供了包含事件EE-GM3和原種事件EE-GMl或EE-GM2的大豆植物或其部分，其中包含事件EE-GM3的代表性大豆種子已于NCMB登錄號41659下保藏，包含原種事件EE-GMl的代表性大豆種子已于登錄號NCI MB 41658下保藏在NCMB，包含原種事件EE-GM2的代表性種子已于登錄號NCMB 41660下保藏在NCMB，包含事件EE-GM3和EE-GMl的代表性大豆種子已于登錄號PTA-11041下保藏在ATCC，包含事件EE-GM3和EE-GM2的代表性大豆種子已于登錄號PTA-11042下保藏在ATCC?？赏ㄟ^本領域可獲得的任何方法，包括通過將來自保藏的種子的植物雜交，收集其后代，然后鑒定包含原種事件的適當組合的后代植物將各個原種事件(如可見于各自保藏的種子中的)組合來獲得包含EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的大豆植物或其部分。本文中還提供了包含此類事件的此類植物的種子以及從此類種子產(chǎn)生的大豆產(chǎn)物，其中所述大豆產(chǎn)物包含事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2。此類大豆產(chǎn)物可以是膳食、磨碎的種子、粉末、薄片等或可包括所述形式。特別地，這樣的大豆產(chǎn)物包含產(chǎn)生診斷事件EE-GM3和原種事件EE-GMl或EE-GM2的擴增 子，例如包含SEQ IDNo. 2或3、SEQ ID No. 14或15和/或SEQ ID No. 12或13的擴增子的核酸。本文中還提供了用于產(chǎn)生大豆產(chǎn)物的方法，包括獲得包含事件EE-GM3和原種事件EE-GMl或EE-GM2的大豆種子，和從其產(chǎn)生這樣的大豆產(chǎn)物。本文中還提供了大豆植物，其為任何上述大豆植物的后代，并且包含事件EE-GM3和 EE-GMl 或 EE-GM2。本文中還提供了用于產(chǎn)生耐草甘膦和/或草胺膦和/或異噁唑草酮除草劑的大豆植物的方法，其包括具體地通過將包含事件EE-GM3的第一大豆植物與包含EE-GMl和/或EE-GM2的大豆植物雜交，然后選擇耐草甘膦和/或草胺膦和/或異噁唑草酮的后代植物來將事件EE-GM3和事件EE-GMl或EE-GM2引入這樣的植物的基因組。本文中還提供了耐草甘膦和草胺膦和/或異噁唑草酮植物，所述植物明確地不具 有產(chǎn)量抑制現(xiàn)象，具有可接受的農(nóng)藝特征，包含2mEPSPS、HPro和PAT蛋白，并且能夠產(chǎn)生診斷事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的擴增子。本文中還提供了用于控制包含事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的大豆植物的田中或待種植此類大豆植物的田中的雜草的方法，包括用有效量的基于異噁唑草酮、基于草甘膦和/或草銨膦的除草劑處理田，其中此類植物抗此類除草劑。本文中還提供了包含EE-GM3和EE-GMl的大豆植物、細胞、組織或種子，其特征在于在其細胞的基因組中包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ ID No. 3的核苷酸220至261具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互補序列，以及還包含與SEQ ID No. 12的核苷酸199至220具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ IDNo. 13的核苷酸558至579具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互補序列。本文中還提供了包含EE-GM3和EE-GM2的大豆植物、細胞、組織或種子，其特征在于在其細胞的基因組中包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ ID No. 3的核苷酸220至261具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互補序列，以及還有與SEQ ID No. 14的核苷酸301至322具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ IDNo. 15的核苷酸497至518具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互補序列。如本文中所用，術語“異噁唑草酮”是指除草劑異噁唑草酮[即(5-環(huán)丙基-4-異噁唑基)[2-(甲磺?；?-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]，其活性代謝物二酮腈以及包含所述化合物的任何混合物或溶液。對于對包含本發(fā)明的事件的植物的應用是有用的HPro抑制性除草劑為二酮腈，例如2-氰基-3-環(huán)丙基-1- (2-甲磺酰-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1，3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮；其它異噁唑類；和吡唑啉鹽類，例如苯吡唑草酮[即[3-(4，5-二氫-3-異噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺?；?苯基](5-羥基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮]，和磺酰草卩比唑(pyrasulfotole) [ (5-輕基-1，3-二甲基卩比唑-4-基(2-甲磺酰_4_三氟甲基苯基)甲酮];或鹽酸苯偶氮吡胺[2-[4-(2，4_ 二氯苯甲?；?-1，3_ 二甲基吡唑-5-基氧基]乙酰苯]。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在種植大豆植物或播種之前，可用HPH)抑制劑除草劑例如異噁唑草酮(’ IFT’)處理待種植包含EE-GM3事件的大豆植物的田，所述除草劑可清除田中可被HPH)抑制劑殺死的雜草，從而使得能夠實施免耕，然后，隨后在該相同的預處理的田上種植或播種大豆(使用HPH)抑制劑除草劑的燒毀應用)。IFT的殘余活性還將保護正在出芽和生長的大豆植物在早期生長階段免受雜草的競爭。一旦大豆植物具有一定的大小，并且雜草有趨勢重現(xiàn)，則可將草甘膦或HPH)抑制劑-草甘膦混合物作為芽后除草劑在植物的頂部上方施用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可在大豆植物出芽前但在種子播種后(可在播種前使用其它方法，通常地常規(guī)耕地實踐例如耕犁、鑿式耕犁(chissel ploughing)或苗床準備使田間無雜草)，用HPH)抑制劑除草劑例如IFT處理其中播種了包含EE-GM3事件的種子的田，其中殘余活性將使田間保持無被除草劑殺死的雜草，以便正在出芽和生長的大豆植物沒有雜草競爭(HPPD抑制劑除草劑的芽后施用)。一旦大豆植物具有一定的大小，并且雜草有趨勢重現(xiàn)，則可將草甘膦一或HPH)抑制劑-草甘膦混合物一作為芽后除草劑在植物的頂部上方施用。 在本發(fā)明的另一個實施方案中，可在大豆植物(已從播種的種子出芽)的頂部上方用HPH)抑制劑除草劑例如IFT處理包含EE-GM3事件的植物，這可清除田中可被HPTO抑制劑殺死的雜草，可將該應用與利用作為芽后除草劑的草甘膦的處理一起(例如，在噴霧罐混合物中)，在其之前或之后于植物的頂部上方施用(HPH)抑制劑除草劑(具有或不具有草甘膦)的芽后施用)。同樣地，根據(jù)本發(fā)明，可用下列殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑處理具有EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的大豆植物，或可用包含下列殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑的種子包衣包被具有EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的大豆種子大豆除草劑甲草胺(Alachlor)、苯達松(Bentazone)、氟樂靈(Trifluralin)、氯卩密磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯橫草胺(Cloransulam-Methyl)、卩惡唑禾草靈(Fenoxaprop)、氟磺胺草醚(Fomesafen)、批氟禾草靈(Fluazifop)、草甘膦、甲氧咪草煙(Imazamox)、滅草喹(Imazaquin)、咪草煙(Imazethapyr) > (S-)丙草胺(Metolachlor)、嗪草酮(Metribuzin)、二甲戍靈(Pendimethalin)、得殺草(Tepraloxydim)、異卩惡唑草酮、草銨膦。大豆殺蟲劑入-三氟氯氰菊酯(cyhalothrin)、滅多威(Methomyl)、對硫磷(Parathion)、硫雙威(Thiocarb)、卩比蟲啉(Imidacloprid)、氯蟲酰肼(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、卩定蟲脈(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran,)、氟蟲酰胺(Flubendiamide)、Rynaxypyr> Cyazypyr> 多殺菌素(Spinosad)、乙基多殺菌素(Spinotoram)、?，斁?Emamectin-Benzoate)、氟蟲臆(Fipronil)、乙蟲月青(Ethiprole)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、3 -氟氯氰菊酉旨(-Cyfluthrin)、Y 和入三氟氯氰菊酯、4- [ [ (6-氯卩比卩定-3-基)甲基](2，2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5H)-酮、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、螺螨酯(Spinodiclofen)、殺鈴脲(Trif Iumuron)、氟唳蟲酰胺(Flonicamid)、硫雙威(Thiodicarb)、P _ 氟氯氰菊酯。大豆殺真菌劑
臆卩密菌酯(Azoxystrobin)、環(huán)丙唑醇(Cyproconazole)、氟環(huán)唑(Epoxiconazole)、粉唑醇(Flutriafol)、卩比唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、戍唑醇(Tebuconazole)、布洛芬、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)。下列實施例描述了原種事件EE-GM3、EE-GMl和EE-GM2以及包含事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的堆的植物的鑒定以及用于特異性鑒定生物樣品中的原種事件EE-GM3、EE-GMl或EE-GM2及其堆的工具的開發(fā)。除非在實施例中另外指出，否則按照“Sambrook J和Russell DW(編著)(2001)Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York”和“Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, SmithJA 和 Struhl K(編著)(2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley &Sons, New York”中描述的標準方案進行所有重組技術。標準材料和參考資料描述于“CroyRDD(編)(1993)Plant Molecular BiologyLabFax,BIOS Scientific Publishers Ltd. , Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford”和“Brown TA, (1998)Molecular Biology LabFax,第2版，AcademicPress, San Diego”中。用于聚合酶鏈式反應(PCR)的標準材料和方法可見于“McPhersonMJ and MO Iler SG(2000)PCR(The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd.，Oxford”和“PCR Applications Manual,第 3版(2006)，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim或www.roche-applied-science. com，，中。應當理解，下列實施例中的任何實驗室方案例如PCR方案中的許多參數(shù)可能需要針對具體實驗室條件進行調(diào)整，并且可略作改進以獲得相似結果。例如，使用不同方法制備DNA或在PCR法中選擇其它引物可決定用于PCR方案的其它最佳條件。然而這些調(diào)整對于本領域技術人員來說是顯然的，并且在現(xiàn)有PCR應用手冊中進行進一步說明。在說明書和實施例中，參考下列序列SEQ ID No.1 :載體pSFlO的SalI片段核苷酸序列。SEQ ID No. 2 :包含側翼連接EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5'區(qū)域的核苷酸序列。SEQ ID No. 3 :包含側翼連接EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的3'區(qū)域的核苷酸序列。SEQ ID No. 4 :引物 S0Y028SEQ ID No. 5 :引物 S0Y029SEQ ID No. 6 :引物 SMP187SEQ ID No. 7 :引物 STVO19SEQ ID No. 8 :擴增子的核苷酸序列SEQ ID No. 9 :用于擴增對照片段的引物I (SOYOl)SEQ ID No. 10 :用于擴增對照片段的引物的2 (S0Y02)SEQ ID No. 11 pB2/P35SAcK 的核苷酸序列SEQ ID No. 12 :包含側翼連接EE-GMl中的外源DNA的5'區(qū)域的核苷酸序列SEQ ID No. 13 :包含側翼連接EE-GMl中的外源DNA的3'區(qū)域的核苷酸序列SEQ ID No. 14 :包含側翼連接EE-GM2中的外源DNA的5'區(qū)域的核苷酸序列
SEQID No. 15 :包含側翼連接EE-GM2中的外源DNA的3'區(qū)域的核苷酸序列SEQID No. 16 :引物 S0Y06SEQID No. 17 :引物 S0Y07SEQID No. 18 :引物 S0Y09SEQID No. 19 :引物 S0Y010SEQID No. 20 :EE_G M3中的外源DNA和植物側翼序列的核苷酸序列SEQID No. 21 :引物 SHA 130SEQID No. 22 :引物 SHA 178
實施例1.利用耐除草劑基因轉化大豆1.1.包含2mEPSPS和HPPD_Pf_W336嵌合基因的外源DNA的描述質粒pSFlO為pUC 19衍生的克隆載體，其包含位于約7. 3kb的SalI片段上的嵌
合2m印sps基因和嵌合hppd-Pf-W336。兩個SalI限制性位點之間包含的DNA的完全說明
不于下表I中。核苷酸序列不于SEQ ID No.1中。表1. pSFlO的SalI限制性位點之間包含的DNA的核苷酸位置(SEQ ID No I)
核苷酸位置取向說明和參考資料
188-479互補3ios:色括來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium
tumefacien)的pTiT37的T-DNA的胭脂堿合酶基 因的3’非翻譯區(qū)的序列(Depicker等，1982，Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573)
480-1556互補hppdPf W336;通過用色氨酸替代氨基酸甘氨酸
336修飾的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)株A32的4-樂基苯丙酮酸二氧合酶的編碼序列，如由Boudec等(2001)美國專利6245968B1
互補
1557-1928TPotp Y:最優(yōu)化的轉運肽衍生物的編碼序列(位
置55被改變成酪氨酸)，包含玉蜀黍(玉米)和葵 花(Helianlhus amiuus)(向日葵)的 RiiBisCO 小亞
權利要求
1.一種用于鑒定原種事件EE-GM3和EE-GMl在生物樣品中的同時存在的方法，所述方法包括利用特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM3特異性區(qū)域，和利用特異性識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GMl特異性區(qū)域。
2.權利要求1所述的方法，所述方法包括使用利用至少兩個引物的第一聚合酶鏈式反應，和使用利用至少兩個引物的第二聚合酶鏈式反應，從存在于所述生物樣品中的核酸擴增兩個50至IOOObp的DNA片段，在所述第一聚合酶鏈式反應中，所述引物之一識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域或EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ IDNo. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，或所述引物的另一個引物識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互補序列，或包含SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列，并且在所述第二聚合酶鏈式反應中，所述引物之一識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域或EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別EE-GMl的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列，或所述引物的另一個引物識別EE-GMl的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互補序列，其中所述第一聚合酶和第二聚合酶反應可以是相繼的或同時的。
3.權利要求2所述的方法，其中識別EE-GM3的5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸，并且其中識別EE-GMl的5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ IDNo 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GMl的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸。
4.權利要求2所述的方法，其中識別EE-GM3的5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸，并且其中識別EE-GMl的5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GMl的3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GMl的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸。
5.權利要求4所述的方法，其中所述EE-GM3特異性引物分別包含SEQID No. 5和SEQID No. 4的序列，或分別包含SEQ ID No 5和SEQ ID No. 7的序列，以及所述EE-GMl特異性引物分別包含SEQID No. 16和SEQ ID No. 17的序列。
6.權利要求5所述的方法，所述方法包括使用EE-GM3PCR鑒定方案擴增約263或約706bp的EE-GM3特異性片段和擴增約183bp的EE-GMl特異性片段。
7.一種用于鑒定原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl在生物樣品中的同時存在的試劑盒，所述試劑盒包括一種識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一種識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域的引物，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，和一種識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列，并且其中所述試劑盒還包括一種識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，或一種識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域的引物，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列，和一種識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互補序列。
8.權利要求7所述的試劑盒，其中識別EE-GM3的所述5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID Nol的核苷酸序列或其互補序列或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸，并且其中識別EE-GMl的所述5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GMl的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GMl的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸。
9.權利要求7所述的試劑盒，其中識別EE-GM3的所述5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GM3的所述3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的所述外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸，并且其中，識別EE-GMl的所述5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GMl的所述3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ IDNo 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GMl的所述外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸。
10.權利要求7所述的試劑盒，其包括包含SEQID No. 4的序列的引物和包含SEQ IDNo. 5的序列的引物或包括包含SEQ ID No. 5的序列的引物和包含SEQ ID No. 7的序列的引物以及還包括包含SEQ ID No. 16的序列的引物和包含SEQ ID No. 17的序列的引物。
11.一對引物，所述第一引物包含在最優(yōu)化的檢測條件下特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列的序列，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ IDNo 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，并且所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸的1408的互補序列的核苷酸序列，并且所述第二引物包含在最優(yōu)化的檢測條件下特異性識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列的序列，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，并且所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列。
12.權利要求11所述的引物對，其中所述第一引物包含選自SEQIDNo 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物包含選自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
13.權利要求11所述的引物對，其中所述第一引物在其最3’末端包含選自SEQID No2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物在其最3’末端包含選自SEQ ID Nol2的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
14.一對引物，其中所述第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列并且其中所述第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 16的序列。
15.一種包含4種引物的裝置， 第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列； 第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 4的序列； 第三引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 16的序列；和 第四引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 17的序列。
16.權利要求1所述的方法，所述方法包括將生物樣品的核酸與針對EE-GM3的第一特異性探針和與針對EE-GMl的第二特異性探針雜交。
17.權利要求16所述的方法，其中所述第一特異性探針的序列與包含EE-GM3的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特異性探針的序列與包含EE-GMl的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
18.權利要求17所述的方法，其中所述第一特異性探針的序列與SEQID No. 2的核苷酸1431至1472或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特異性探針的序列與SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性。
19.一種用于鑒定原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl在生物樣品中的同時存在的試劑盒，所述試劑盒包括能夠與EE-GM3的特異性區(qū)域特異性雜交的第一特異性探針和能夠與EE-GMl的特異性區(qū)域特異性雜交的第二特異性探針。
20.權利要求19所述的試劑盒，其中所述第一特異性探針的序列與包含EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特異性探針的序列與包含EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
21.權利要求20所述的試劑盒，其中所述第一特異性探針的序列包含與SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性的序列，并且其中所述第二特異性探針的序列與SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性。
22.—對用于鑒定原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl在生物樣品中的同時存在的特異性探針。
23.權利要求22所述的探針對，其包括第一探針和第二探針，所述第一探針包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與包含EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列或其互補序列具有至少80%的序列同一性，所述第二探針包含核苷酸序列，所述核苷酸與包含EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列或其互補序列具有至少80%的序列同一性。
24.權利要求23所述的引物對，其中所述第一探針與SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二探針與SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性。
25.一組用于鑒定原種事件EE-GM3和EE-GMl在生物樣品中的同時存在的特異性探針，包括第一探針和第二探針，所述第一探針具有包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列的序列，所述第二探針具有與SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列。
26.一種用于確認種子樣品中的種子純度的方法，所述方法包括用特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM3特異性區(qū)域，和用特異性識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GMl特異性區(qū)域。
27.一種用于在種子批的樣品中篩選種子的原種事件EE-GM3和EE-GMl的存在的方法，所述方法包括用特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM3特異性區(qū)域，和用特異性識別EE-GMl的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GMl特異性區(qū)域。
28.—種通過與大體上互補的標記核酸探針雜交來檢測原種事件EE-GM3和EE-GMl在生物樣品中的存在的方法，其中通過再循環(huán)靶核酸序列來放大探針靶核酸比率，所述方法包括 a)將所述祀核酸序列與包含SEQID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互補序列的第一核酸寡核苷酸或包含SEQID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互補序列的所述第一核酸核苷酸雜交； b)將所述靶核酸序列與包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互補序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸重疊至少一個核苷酸，并且其中將所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸標記為所述標記核酸探針； c)用產(chǎn)生選擇性探針切割從而導致雙鏈體離解的酶僅切割探針靶核酸序列雙鏈體內(nèi)的標記探針，從而使所述靶序列保持完整；d)通過重復步驟(a)至(c)再循環(huán)所述靶核酸序列；和 e)檢測切割的標記探針，從而確定所述靶核酸序列的存在；和 f)將所述靶核酸序列與包含SEQID No 12的核苷酸210至核苷酸227的核苷酸序列或其互補序列的第三核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸561至核苷酸568的核苷酸序列或其互補序列的所述第三核酸寡核苷酸雜交； g)將所述靶核酸序列與包含SEQID No 12的核苷酸192至核苷酸209的核苷酸序列或其互補序列的第四核酸寡核苷酸或包含SEQID No 13的核苷酸569至核苷酸586的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第三寡核苷酸和第四寡核苷酸重疊至少一個核苷酸，并且其中將所述第三寡核苷酸或所述第四寡核苷酸標記為所述標記核酸探針； h)用產(chǎn)生選擇性探針切割從而導致雙鏈體離解的酶僅切割探針靶核酸序列雙鏈體內(nèi)的標記探針，從而使所述靶序列保持完整； i)通過重復步驟(f)至(h)再循環(huán)所述靶核酸序列；和 j)檢測切割的標記探針，從而確定所述靶核酸序列的存在。
29.—種各自在其基因組中包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl的轉基因大豆植物或其細胞、部分、組織、種子或后代，已于保藏號NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM3的參照種子和已于保藏號NCMB 41658下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GMl的參照種子，或已于保藏號PTA-11041下保藏在ATCC的在其基因組中包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl的參照種子。
30.權利要求29所述的轉基因大豆植物、種子、細胞、組織、部分或后代，其基因組DNA，當使用針對EE-GM3的原種事件鑒定方案，利用兩個分別包含SEQ ID 4和SEQ ID 5的核苷酸序列的引物進行分析時，產(chǎn)生約263bp的DNA片段，并且其基因組DNA，當使用針對EE-GMl的原種事件鑒定方案，利用兩個分別包含SEQ ID16和SEQ ID 17的核苷酸序列進行分析時，產(chǎn)生約183bp的DNA片段。
31.一種各自在其基因組中包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GMl的大豆植物、其植物部分或種子、細胞或組織，所述大豆植物可通過將包含原種事件EE-GM3的大豆植物與在其基因組中包含原種事件EE-GMl的大豆植物雜交來獲得，所述包含原種事件EE-GM3的大豆植物可通過從已于保藏號NCMB 41659下保藏在NCMB的種子生長而來的大豆植物的繁殖和/或與其繁育來獲得，所述包含原種事件EE-GMl的大豆植物可通過從于保藏號NCIMB41658下保藏在NCMB的種子生長而來的大豆植物的繁殖和/或與其繁育來獲得，或所述大豆植物可通過從已于登錄號PTA-11041下保藏在ATCC的種子生長而來的大豆植物的繁殖和/或與其繁育來獲得。
32.一種包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的大豆種子、已于保藏號NCMB 41659下保藏在NCMB的包含事件EE-GM3的參照種子、已于保藏號NCMB 41658下保藏在NCMB的包含事件EE-GMl的參照種子和已于保藏號PTA-11041下保藏在ATCC的包含事件EE-GM3和EE-GMl的參照種子。
33.一種可從權利要求32所述的種子獲得的包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的轉基因大豆植物、植物部分、細胞或組織。
34.—種用于產(chǎn)生包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的大丑植物或種子的方法,包括將根據(jù)權利要求29至33中任一項所述的植物與另一種大豆植物雜交，和種植獲自所述雜交的種子。
35.一種包含原種事件EE-GM3和EE-GMl的大豆基因組DNA。
36.一對分離的核酸分子,所述第一核酸分子包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1441至核苷酸1452或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含與SEQ ID No. 12的核苷酸199至核苷酸220或SEQ IDNo. 13的核苷酸558至579或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列。
37.權利要求36所述的分尚的核酸分子對,所述第一核酸分子包含與SEQID No. 2的核苷酸1431至核苷酸1462或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含與SEQ ID No. 12的核苷酸189至核苷酸230或SEQ ID No. 13的核苷酸548至589或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列。
38.一種大豆植物，其在其基因組中按順序包含下列核苷酸序列 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列；和 g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列并且還按順序包含下列序列 h)SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸340至核苷酸3461的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸I至核苷酸336的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； k) SEQ ID 11的核苷酸3462至核苷酸4076的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； 1)SEQ ID 11的核苷酸337至核苷酸3043的核苷酸序列； m) SEQ ID 13的核苷酸559至核苷酸568的核苷酸序列；和 n) SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。
39.一種按順序包含下列核苷酸序列的DNA分子 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列； g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列；以及還按順序包含下列序列 h)SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸340至核苷酸3461的核苷酸序列；j) SEQ ID 11的核苷酸I至核苷酸336的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； k) SEQ ID 11的核苷酸3462至核苷酸4076的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； 1)SEQ ID 11的核苷酸337至核苷酸3043的核苷酸序列； m) SEQ ID 13的核苷酸559至核苷酸568的核苷酸序列；和 n) SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。
40.一種用于鑒定原種事件EE-GM3和EE-GM2在生物樣品中的同時存在的方法，所述方法包括用特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM3特異性區(qū)域，和用特異性識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM2特異性區(qū)域。
41.權利要求40所述的方法，所述方法包括使用利用至少兩個引物的第一聚合酶鏈式反應，和使用利用至少兩個引物的第二聚合酶鏈式反應，從存在于所述生物樣品中的核酸擴增兩個50至IOOObp的DNA片段，在所述第一聚合酶鏈式反應中，所述引物之一識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域或EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，或所述引物的另一個引物識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互補序列，或包含SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列，并且在所述第二聚合酶鏈式反應中，所述引物之一識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域或EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列，所述引物的另一個引物識別EE-GM2的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列，或所述引物的另一個引物識別EE-GM2的外源DNA內(nèi)的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互補序列，其中所述第一聚合酶和第二聚合酶反應可以是相繼的或同時的。
42.權利要求41所述的方法，其中識別EE-GM3的5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸，并且其中識別EE-GM2的5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM2的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸。
43.權利要求41所述的方法，其中識別EE-GM3的5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸，并且其中識別EE-GM2的5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GM2的3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM2的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸。
44.權利要求43所述的方法，其中所述EE-GM3特異性引物分別包含SEQID No. 5和SEQ ID No. 4的序列，或分別包含SEQ ID No5和SEQ ID No. 7的序列，并且所述EE-GM2特異性引物分別包含SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19的序列。
45.權利要求44所述的方法，所述方法包括使用EE-GM3PCR鑒定方案擴增約263或約706bp的EE-GM3特異性片段和擴增約151bp的EE-GM2特異性片段。
46.一種用于鑒定原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2在生物樣品中的同時存在的試劑盒，所述試劑盒包括一種識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一種識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域的引物，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列，和一種識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列，并且其中所述試劑盒還包括一種識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼區(qū)域的引物，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，或一種識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的3’側翼區(qū)域的引物，所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列，和一種識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No·11的核苷酸序列或其互補序列。
47.權利要求46所述的試劑盒，其中識別EE-GM3的所述5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM3的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸，并且其中識別EE-GM2的所述5’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM2的3’側翼區(qū)域的所述引物包含選自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM2的外源DNA內(nèi)的序列的所述引物包含選自SEQID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互補序列的17至200個連續(xù)核苷酸。
48.權利要求46所述的試劑盒，其中識別EE-GM3的所述5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或識別EE-GM3的所述3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM3的所述外源DNA的內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互補序列的核苷酸序列或SEQ IDNo 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸，并且其中，識別EE-GM2的所述5’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或識別EE-GM2的所述3’側翼區(qū)域的所述引物在其最3’末端包含選自SEQ IDNo 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且識別EE-GM2的所述外源DNA內(nèi)的序列的所述引物在其3’末端包含選自SEQID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互補序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互補序列的至少17個連續(xù)核苷酸。
49.權利要求46所述的試劑盒，其包括包含SEQID No. 4的序列的引物和包含SEQ IDNo. 5的序列的引物或包括包含SEQ ID No. 5的序列的引物和包含SEQ ID No. 7的序列的引物以及還包括包含SEQ ID No. 18的序列的引物和包含SEQ ID No. 19的序列的引物。
50.一對適用于EE-GM3和EE-GM2的特異性檢測的引物，所述第一引物包含在最優(yōu)化的檢測條件下特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列的序列，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，并且所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸的1408的互補序列的核苷酸序列，并且所述第二引物包含在最優(yōu)化的檢測條件下特異性識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域內(nèi)的序列的序列，所述5’側翼區(qū)域包含SEQ ID No14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，并且所述3’側翼區(qū)域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列。
51.權利要求50所述的引物對，其中所述第一引物包含選自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物包含選自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列的17至200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
52.權利要求50所述的引物對，其中所述第一引物在其最3’末端包含選自SEQID No2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物在其最3’末端包含選自SEQ ID Nol4的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或選自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互補序列的核苷酸序列的至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
53.一對引物，其中所述第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列并且其中所述第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 18的序列。
54.一種包含4種引物的裝置， 第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列； 第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 4的序列； 第三引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 18的序列；和 第四引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 19的序列。
55.權利要求40所述的方法，所述方法包括將生物樣品的核酸與針對EE-GM3的第一特異性探針和與針對EE-GM2的第二特異性探針雜交。
56.權利要求55所述的方法，其中所述第一特異性探針的序列與包含EE-GM3的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特異性探針的序列與包含EE-GM2的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
57.權利要求56所述的方法，其中所述第一特異性探針的序列與SEQID No. 2的核苷酸1431至1472或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特異性探針的序列與SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性。
58.一種用于鑒定原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2在生物樣品中的同時存在的試劑盒，所述試劑盒包括能夠與EE-GM3的特異性區(qū)域特異性雜交的第一特異性探針和能夠與EE-GM2的特異性區(qū)域特異性雜交的第二特異性探針。
59.權利要求58所述的試劑盒，其中所述第一特異性探針的序列與包含EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特異性探針的序列與包含EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
60.權利要求59所述的試劑盒，其中所述第一特異性探針的序列包含與SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性的序列，并且其中所述第二特異性探針的序列與SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性。
61.一對用于鑒定原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2在生物樣品中的同時存在的特異性探針。
62.權利要求61所述的探針對，其包括第一探針和第二探針，所述第一探針包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與包含EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列或其互補序列具有至少80%的序列同一性，并且所述第二探針包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與包含EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’側翼序列或3’側翼序列的部分和與其鄰接的外源DNA的序列的序列或其互補序列具有至少80%的序列同一性。
63.權利要求62所述的引物對，其中所述第一探針與SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二探針與SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互補序列具有至少80%的序列同一性。
64.一組用于鑒定原種事件EE-GM3和EE-GM2在生物樣品中的同時存在的特異性探針，包括第一探針和第二探針，所述第一探針具有包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列的序列，所述第二探針具有與SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列。
65.一種用于確認種子樣品中的種子純度的方法，所述方法包括用特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM3特異性區(qū)域，和用特異性識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM2特異性區(qū)域。
66.一種用于在種子批的樣品中篩選種子的原種事件EE-GM3的存在的方法，所述方法包括用特異性識別EE-GM3的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM3特異性區(qū)域，和用特異性識別EE-GM2的包含耐除草劑基因的外源DNA的5’或3’側翼區(qū)域的特異性引物或探針檢測EE-GM2特異性區(qū)域。
67.一種通過與大體上互補的標記核酸探針雜交來檢測原種事件EE-GM3和EE-GM2在生物樣品中的存在的方法，其中通過再循環(huán)靶核酸序列來放大探針靶核酸比率，所述方法包括 a)將所述祀核酸序列與包含SEQID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互補序列的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互補序列的所述第一核酸核苷酸雜交； b)將所述靶核酸序列與包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互補序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸重疊至少一個核苷酸，并且其中將所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸標記為所述標記核酸探針； C)用產(chǎn)生選擇性探針切割從而導致雙鏈體離解的酶僅切割探針靶核酸序列雙鏈體內(nèi)的標記探針，從而使所述靶序列保持完整； d)通過重復步驟(a)至(c)再循環(huán)所述靶核酸序列；和 e)檢測切割的標記探針，從而確定所述靶核酸序列的存在；和 f)將所述靶核酸序列與包含SEQID No 14的核苷酸312至核苷酸329的核苷酸序列或其互補序列的第三核酸寡核苷酸或包含SEQ IDNo 15的核苷酸490至核苷酸507的核苷酸序列或其互補序列的所述第三核酸寡核苷酸雜交； g)將所述靶核酸序列與包含SEQID No 14的核苷酸294至核苷酸311的核苷酸序列或其互補序列的第四核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸525的核苷酸序列或其互補序列的所述標記核酸探針雜交，其中所述第三寡核苷酸和第四寡核苷酸重疊至少一個核苷酸，并且其中將所述第三寡核苷酸或所述第四寡核苷酸標記為所述標記核酸探針； h)用產(chǎn)生選擇性探針切割從而導致雙鏈體離解的酶僅切割探針靶核酸序列雙鏈體內(nèi)的標記探針，從而使所述靶序列保持完整； i)通過重復步驟(f)至(h)再循環(huán)所述靶核酸序列；和 j)檢測切割的標記探針，從而確定所述靶核酸序列的存在。
68.一種各自在其基因組中包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2的轉基因大豆植物或其細胞、部分、組織、種子或后代，已于保藏號NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM3的參照種子和已于保藏號NCMB 41660下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM2的參照種子，或已于保藏號PTA-11042下保藏在ATCC的在其基因組中包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2的參照種子。
69.權利要求68所述的轉基因大豆植物、種子、細胞、組織、部分或后代，其基因組DNA，當使用針對EE-GM3的原種事件鑒定方案，利用兩個分別包含SEQ ID 4和SEQ ID 5的核苷酸序列的引物進行分析時，產(chǎn)生約263bp的DNA片段，并且其基因組DNA，當使用針對EE-GM2的原種事件鑒定方案，利用兩個分別包含SEQ ID18和SEQ ID 19的核苷酸序列進行分析時，產(chǎn)生約151bp的DNA片段。
70.一種各自在其基因組中包含原種事件EE-GM3和原種事件EE-GM2的大豆植物、其植物部分或種子、細胞或組織，所述大豆植物可通過將在其基因組中包含原種事件EE-GM3的大豆植物與在其基因組中包含原種事件EE-GM2的大豆植物雜交來獲得，所述包含原種事件EE-GM3的大豆植物可通過從已于保藏號NCMB 41659下保藏在NCMB的種子生長而來的大豆植物的繁殖和/或與其繁育來獲得，所述包含原種事件EE-GM2的大豆植物可通過從于保藏號NCMB 41660下保藏在NCMB的種子生長而來的大豆植物的繁殖和/或與其繁育來獲得，或所述大豆植物可通過從已于登錄號PTA-11042下保藏在ATCC的種子生長而來的大豆植物的繁殖和/或與其繁育來獲得。
71.一種包含原種事件EE-GM3和EE-GM2的大豆種子、已于保藏號NCMB 41659下保藏在NCMB的包含事件EE-GM3的參照種子、已于保藏號NCMB 41660下保藏在NCMB的包含事件EE-GM2的參照種子和已于保藏號PTA-11042下保藏在ATCC的包含事件EE-GM3和EE-GM2的參照種子。
72.一種可從權利要求71所述的種子產(chǎn)生的包含原種事件EE-GM3和EE-GM2的轉基因大豆植物、細胞或組織。
73.一種用于產(chǎn)生包含原種事件EE-GM3和EE-GM2的大豆植物或種子的方法，包括將根據(jù)權利要求68至72中任一項所述的植物與另一種大豆植物雜交，和種植獲自所述雜交的種子。
74.一種包含原種事件EE-GM3和EE-GM2的大豆基因組DNA。
75.—對分離的核酸分子,所述第一核酸分子包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1441至核苷酸1452或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含與SEQ ID No. 14的核苷酸301至核苷酸322或SEQ IDNo. 15的核苷酸497至518或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列。
76.權利要求75所述的分尚的核酸分子對,所述第一核酸分子包含與SEQID No. 2的核苷酸1431至核苷酸1462或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含與SEQ ID No. 14的核苷酸301至核苷酸322或SEQ ID No. 15的核苷酸487至518或所述序列的互補序列基本上相似的核苷酸序列。
77.—種大豆植物，其在其基因組中按順序包含下列核苷酸序列 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列；和 g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列并且還按順序包含下列序列 h)SEQ ID No 14的核苷酸I至311的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸3458至核苷酸3848的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸413至核苷酸3457的核苷酸序列； k) SEQ ID 15的核苷酸508至核苷酸1880的核苷酸序列。
78.—種按順序包含下列核苷酸序列的DNA分子 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列； g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列；并且還按順序包含下列序列h)SEQ ID No 14的核苷酸I至311的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸3458至核苷酸3848的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸413至核苷酸3457的核苷酸序列； k) SEQ ID 15的核苷酸508至核苷酸1880的核苷酸序列；.
79.一種包含EE-GM3和EE-GMl的大豆植物、細胞、組織或種子，其在其細胞的基因組中包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互補序列具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列，以及還有與SEQ ID No. 12的核苷酸199至220具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互補序列具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列。
80.一種包含EE-GM3和EE-GM2的大豆植物、細胞、組織或種子，其在其細胞的基因組中包含與SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互補序列具有至少80%、90%,95%或100%的序列同一性的核酸序列，以及還有與SEQ ID No. 14的核苷酸301至322具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和與SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互補序列具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列。
81.—種大豆植物、植物細胞、組織或種子，在它們的基因組中包含核酸分子，所述核酸分子包含與SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列具有至少97%、98%或至少99%的序列同一性的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 20或其互補序列具有至少97%、98%或至少99%的序列同一性的核苷酸序列，以及在它們的基因組中包含核酸分子，所述核酸分子包含與EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互補序列具有至少97%、98%或至少99%的序列同一性的核苷酸序列，已于保藏號NCIMB 41658下保藏在NCIMB的包含所述事件EE-GMl的參照種子，和已于保藏號NCMB 41660下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM2的參照種子，例如其中所述EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列分別包含或為SEQ ID No 12或13中的外源DNA序列或SEQ ID No 14或15中的外源DNA序列，分別包含或為植物基因組中的SEQ ID No 12的序列與SEQ ID No 13的序列之間的外源DNA序列或植物基因組中的SEQ ID No 14的序列與SEQ ID No 15的序列之間的外源DNA序列。
82.—種大豆植物、植物細胞、組織或種子，在它們的基因組中包含核酸分子，所述核酸分子與SEQ ID No I的核苷酸序列或其互補序列雜交，或與SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互補序列雜交，或與SEQ ID No. 20的核苷酸序列或其互補序列雜交，以及在它們的基因組中包含與EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互補序列雜交的核酸分子，已于保藏號NCMB 41658下保藏的包含EE-GMl的參照種子，和已于保藏號NCMB 41660下保藏的包含EE-GM2的參照種子，例如其中所述EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列包含或為SEQ ID No 12或13中的外源DNA序列，或SEQ ID No 14或15中的外源DNA序列，或植物基因組中的SEQ ID No 12的序列與SEQ ID No 13的序列之間的外源DNA序列，或植物基因組中的SEQ ID No 14的序列與SEQ ID Nol5的序列之間的外源DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了特定的轉基因大豆植物、植物材料和種子，其特征在于此類產(chǎn)物在大豆基因組的特定位置上具有一堆特定的轉化事件。還提供了使得能夠在生物樣品中快速且明確地鑒定此類事件的工具。
文檔編號A01H1/02GK103003443SQ201080061916
公開日2013年3月27日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權日2009年11月23日
發(fā)明者J·T·梅森, L·J·萊托, M·A·艾比, W·H·艾比, G·威爾茲, S·維爾哈格, M·德伯克利爾, V·哈貝克斯, J-M·菲盧洛 申請人:拜爾作物科學股份有限公司, Ms技術有限責任公司