專利名稱：種子油含量相關(guān)的植物基因及其使用方法
種子油含量相關(guān)的植物基因及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2009年12月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列第61/287，572號(hào)和2010年4月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列第61/328，545號(hào)的權(quán)益，在此通過(guò)引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。背景I.發(fā)明領(lǐng)域本公開(kāi)涉及與油產(chǎn)生有關(guān)的某些植物基因及利用這些基因來(lái)提高或調(diào)節(jié)植物種子中的油含量。更具體地，本公開(kāi)涉及通過(guò)這些基因的受控表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物或其一部分中不同脂肪酸之間的比例。 2.相關(guān)技術(shù)描述植物油在多種應(yīng)用中使用。在其種子中合成并儲(chǔ)存大量油的植物是人和動(dòng)物所消耗的油的重要來(lái)源。植物油還在許多行業(yè)同樣被廣泛使用，例如油漆和涂料行業(yè)。根據(jù)預(yù)期的用途，需要植物油中的不同脂肪酸組成。植物和動(dòng)物油(或脂肪)幾乎完全由三酰甘油(TAG)組成。三酰甘油是由脂肪酸和丙三醇形成的酷，其中脂肪酸與丙三醇的三個(gè)羥基發(fā)生酯化。植物和魚(yú)類脂肪來(lái)源通常被認(rèn)為比大多數(shù)動(dòng)物的脂肪來(lái)源更健康，因?yàn)檫@些植物和魚(yú)類脂肪來(lái)源通常具有更高含量的不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸的攝入量和食物來(lái)源中這些脂肪酸之間的比例與人類心血管疾病和其他慢性疾病的發(fā)病率具有一定的因果關(guān)系。綜述見(jiàn)Simopoulos，AP, Exp BiolMed (Maywood)，233 (6) :674-88 (2008)。而且，飽和脂肪酸通常比不飽和脂肪酸具有更高的熔點(diǎn)，因而在許多應(yīng)用中需求較少。例如，當(dāng)用作燃料時(shí)，飽和脂肪酸在低溫下可以導(dǎo)致渾濁，并可能會(huì)賦予燃料很差的冷流特性。長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜中磷脂的必需組分，也是人體多種功能中很重要的各種代謝物的前體。在人類中，可以通過(guò)“ω-6途徑”從飲食的ω-6和ω-3脂肪酸合成某些長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，所述ω-6和ω-3脂肪酸分別例如亞油酸(也被稱為L(zhǎng)A或18:2)和α-亞麻酸(也被稱為ALA或18:3)。然而，由于人類不能合成LA或ALA，這些脂肪酸必須從飲食或其他來(lái)源中獲得。因?yàn)棣?6和ω-3脂肪酸的每ー種都在人體內(nèi)發(fā)揮了重要而不同的作用，所以維持這兩類不飽和脂肪酸之間的最佳平衡非常重要。雖然推薦在人類飲食中ω-6和ω-3脂肪酸的比列為5:1，但是在當(dāng)今西方飲食中這個(gè)比例已經(jīng)嚴(yán)重向ω-6脂肪酸偏移。Sargent, J. R. (1997)Br. J. Nutr. 78, Suppl. 1,5 - 13。實(shí)際上，據(jù)估計(jì)，ω-6脂肪酸的量高達(dá)推薦值的30倍。ω-6和ω-3脂肪酸之間的這種比例失衡至少部分歸咎于富含LA而ALA含量低的蔬菜油和其他食物的消耗量的增加。Simopoulos, A. P. (1999)Am. J. Clin. Nutr. 70,560S - 569S。因而，在常見(jiàn)食物來(lái)源(例如植物油)中增加ALA的量可以幫助糾正飲食中ω-6和ω-3脂肪酸之間的比例失衡。表I主要脂肪酸的特征碳^(鍵"!名稱ι飽和度
16:0棕櫚酸飽和的
18:0硬脂酸飽和的
18:1油酸單不飽和的
18:2亞油酸ω-6多不飽和的
18:3α -亞麻酸ω-3多不飽和的表I總結(jié)了植物中的主要脂肪酸。(18:1)、(18:2)、(18:3)等命名是指脂肪酸鏈中的碳原子數(shù)及其中的雙鍵數(shù)。正如本領(lǐng)域和本公開(kāi)中通常使用的，上述命名有時(shí)代替相應(yīng)的脂肪酸常用名。例如，油酸(18:1)包含18個(gè)碳原子和I個(gè)雙鍵，可以被稱為“18:1”。在高等真核生物中，細(xì)胞色素b5(Cb5)是ー種小的血紅素結(jié)合蛋白，其通常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和線粒體外膜相連。Cb5在?；o酶A脂肪酸(FA)的去飽和中提供電子[I]。在高等植物中，Cb5也被認(rèn)為是?；o酶A脂肪酸羥基化[2-4]、不同F(xiàn)AD2(例如結(jié)合酶、こ炔酶(acetylenase))介導(dǎo)的反應(yīng)[5_7]、鞘脂的去飽和和輕基化[8,9]、固醇的去飽和[10]和細(xì)胞色素P450反應(yīng)[11]中的電子供體。除了在脂質(zhì)代謝相關(guān)反應(yīng)中的作用，最近已報(bào)導(dǎo)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的Cb5與蔗糖和山梨醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的質(zhì)膜的相互作用導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與其底物糖的親和カ上調(diào)，這對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的糖水平至關(guān)重要[12]。諸如煙草[16,17]、擬南芥(Arabidopsis)[4,18]、油桐(Tung) [19]、Crepisalpina[7]和大豆的高等植物被獨(dú)特地賦予了多種Cb5基因，與此相反，在哺乳動(dòng)物[20]和酵母[21]中分別只有単一的ー種Cb5基因。除了典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體外膜相關(guān)的“獨(dú)立” Cb5，還報(bào)導(dǎo)了許多前端去飽和酶(例如哺乳動(dòng)物和線蟲(chóng)(C. elegans)中的Λ5或Λ6去飽和酶[8]和紫草科植物中的Λ6去飽和酶[22])中的Cb5樣結(jié)構(gòu)域。還報(bào)導(dǎo)了高等植物鞘脂A8-LCB去飽和酶[8]和硝酸還原酶[23]中的Cb5基序。高等植物FAD2和FAD3的已有的大量的分子遺傳學(xué)和生物化學(xué)表征使我們對(duì)于18C PUFA合成的理解取得了重大進(jìn)展；然而，關(guān)于這些去飽和酶中各種Cb5同エ型之間聯(lián)系的并行信息還很有限。概述本文描述的方法克服了上文列出的問(wèn)題，并通過(guò)提供可以在調(diào)節(jié)種子油含量中起到重要作用的基因而改進(jìn)了技木。更具體地，已知Cb5基因產(chǎn)物在脂肪酸去飽和中發(fā)揮了作用。本公開(kāi)首次報(bào)導(dǎo)了非真菌的FAD3去飽和酶和某些Cb5基因在酵母中的共表達(dá)導(dǎo)致ω-3脂肪酸的產(chǎn)量增加。本公開(kāi)還報(bào)導(dǎo)了來(lái)自高等植物的不同Cb5基因的不同功能，并提供了調(diào)節(jié)植物中多不飽和脂肪酸水平的方法。根據(jù)本公開(kāi)，可以對(duì)植物進(jìn)行遺傳修飾，使其在種子中產(chǎn)生較高水平的油。一方面，可以對(duì)植物進(jìn)行遺傳修飾，使得可以根據(jù)不同的需要改變不同脂肪酸之間的比例。例如，可以使不飽和脂肪酸(如18:3)的水平高于未修飾的植物中的水平。由于飲食中的不飽和脂肪酸有多種好處，所以不飽和脂肪酸較高的這種植物具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而且，由于不飽和脂肪酸具有快速干燥的特性，不飽和脂肪酸較高的植物還可以在エ業(yè)上應(yīng)用于油漆和涂料ィ丁業(yè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用內(nèi)源Cb5基因缺陷的突變酵母菌株表征來(lái)自大豆(Glycine max var. Williams)或擬南芥的不同的Cb5基因。已經(jīng)證明酵母是用于植物脂質(zhì)生物合成基因(如去飽和酶[24-27]、結(jié)合酶[5]、環(huán)氧化酶[28]、羥化酶[3，29]、Cb5 [19]和NADH:細(xì)胞色素b5還原酶[4，30])的功能表征的很好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。擬南芥的不同Cb5同エ型在ω-6去飽和中并非同樣有效。這個(gè)觀察結(jié)果與大豆Cb5同エ型所表現(xiàn)出的相對(duì)類似的效率形成對(duì)比。對(duì)于ω-3去飽和，在可比較的生長(zhǎng)條件下，大豆和擬南芥中的某些Cb5同エ型能夠比其它同エ型積累明顯更多的18:3?？梢酝ㄟ^(guò)它們與非天然FAD3的共表達(dá)進(jìn)ー步證實(shí)在ω-3去飽和效率中的這些差異。 在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了來(lái)自植物(如大豆或擬南芥)的Cb5同エ型能夠調(diào)節(jié)酵母中的ω-3去飽和。在大多數(shù)被子植物中，F(xiàn)AD3是主要的去飽和酶，其負(fù)責(zé)產(chǎn)生ω-3脂肪酸，例如α-亞麻酸(18:3)。在酵母系統(tǒng)中研究了各種Cb5同エ型在ω-3去飽和中的作用及其與FAD3的相互作用。本研究所獲得的結(jié)果表明不是所有來(lái)自擬南芥和大豆的Cb5同エ型在ω-3去飽和中都同樣有效，如當(dāng)在酵母系統(tǒng)中表達(dá)不同的Cb5同エ型吋，α-亞麻酸(ALA，18:3)累積明顯不同所證實(shí)的。在可比較的生長(zhǎng)條件下，來(lái)自擬南芥或大豆的某些Cb5同エ型比其它同エ型在產(chǎn)生和積累18:3中具有更高的效率。通過(guò)其中用大豆Cb5基因取代擬南芥Cb5基因或相反的分析證實(shí)各種Cb5同エ型所發(fā)揮的重要作用。本文進(jìn)ー步公開(kāi)了 ω-3去飽和的效率不僅取決于Cb5的性質(zhì)，還取決于各自去飽和酶的效率及Cb5與FAD3之間的相互作用。尤其是，在大豆Cb5基因和天然FAD3共表達(dá)的突變cb5酵母中觀察到，18:3產(chǎn)量比僅表達(dá)FAD3的酵母高2倍多。還顯示不同Cb5同エ型之間在它們的18:3水平上的功能變異。表達(dá)Cb5-C2或Cb5-El時(shí)的18:3水平比表達(dá)Cb5-C3時(shí)高大約I. 5倍。當(dāng)表達(dá)Cb5-Al時(shí)，18:3水平比表達(dá)Cb5_C2和Cb5_El時(shí)低，但比表達(dá)Cb5-C3時(shí)的18:3水平高。大豆種子中18:3的水平占總種子脂肪酸的大約8%。已證實(shí)過(guò)表達(dá)FAD3基因能夠有助于將18:3的百分比提高至大約50%(Cahoon 2003)，或者在一種情況下，甚至高達(dá)總種子脂肪酸的大約70%(Damude et al，2006)。然而，提取這些脂肪酸在商業(yè)上是不可行的，因?yàn)橹舅岬乃饺匀缓艿汀Ｓ捎谄渌o助因子的可供性有限，通過(guò)過(guò)表達(dá)FAD3進(jìn)ー步提高去飽和可能是有限的。Cb5可能是這樣的輔助因子之一。在轉(zhuǎn)基因植物中，共同過(guò)表達(dá)某些FAD3和某些Cb5同エ型可以有助于將18:3的含量提高至總脂肪酸的70%(w/w)以上，甚至達(dá)至Ij 80%(w/w) ο如本文所公開(kāi)的，不同Cb5同エ型具有不同的功能。某種Cb5同エ型可以更有效地與某些FAD3蛋白作用，從而促進(jìn)脂肪酸的去飽和，但與其它去飽和酶作用效率較低。一方面，可以以種子特異的方式使某些Cb5基因與適合的FAD3基因過(guò)表達(dá)。Cb5-FAD3基因的這種共表達(dá)有可能顯著提高18:3的水平，使得從種子中提取18:3成為商業(yè)上可行的。另一方面，可以使較高的總油含量的性狀與特定脂肪酸較高水平的另ー個(gè)性狀相結(jié)合。例如，可以使高種子油性狀與高18:3性狀相結(jié)合，從而產(chǎn)生相對(duì)于通常未修飾的大豆植物具有更高價(jià)值的大豆作物。本文公開(kāi)了與種子油和脂肪酸調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，包括但不限于編碼酶、支架蛋白、電子供體、電子受體、電子載體的基因，這些基因在脂肪酸途徑中發(fā)揮了作用。這些基因，包括但不限于Cb5基因或去飽和酶基因，可以被導(dǎo)入宿主植物以產(chǎn)生遺傳修飾的植物，所述植物能產(chǎn)生更高的種子油含量或使種子中含有更加希望的脂肪酸比例?？蛇x地，可以修飾植物內(nèi)源的Cb5和/或去飽和酶基因，使得這些基因與未修飾的基因相比以升高的水平表達(dá)。待導(dǎo)入宿主植物的Cb5基因或去飽和酶基因可以從所述宿主植物或從不同植株或物種中分離或衍生。例如，可以將真菌基因?qū)胫参?，反之亦然。另ー方面，本文的方法可以按照以下來(lái)實(shí)施步驟一，創(chuàng)造包含一種或多種轉(zhuǎn)基因的ー種或多種植物，所述轉(zhuǎn)基因能提高內(nèi)源FAD3基因的表達(dá)。步驟ニ，從步驟一創(chuàng)造的所述ー種或多種植物的每ー種中獲得至少ー個(gè)種子?？梢赃M(jìn)行步驟三，以使用從步驟ニ獲得的種子，測(cè)定總的種子油含量和亞麻酸在總脂肪酸中的重量百分比。然后可以進(jìn)行步驟四，以鑒定所產(chǎn)生種子中亞麻酸含量超過(guò)總的種子脂肪酸重量比的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或者更優(yōu)選80%的植物。另ー方面，本文的方法可以按照以下來(lái)實(shí)施步驟一，創(chuàng)造包含ー種或多種轉(zhuǎn)基因的ー種或多種植物，所述轉(zhuǎn)基因能提高脂肪酸的去飽和來(lái)生產(chǎn)亞麻酸。步驟ニ，從步驟ー創(chuàng)造的所述ー種或多種植物的每ー種中獲得至少ー個(gè)種子?？梢赃M(jìn)行步驟三，以使用從步驟 ニ獲得的種子，測(cè)定總的種子油含量和亞麻酸在總脂肪酸中的重量百分比?？梢赃M(jìn)行步驟四，以鑒定所產(chǎn)生種子中亞麻酸含量超過(guò)總的種子脂肪酸重量比的10%、20%、30%、40%、50%、60%, 70%或者更優(yōu)選80%的植物。步驟一中的轉(zhuǎn)基因可以從宿主植物中分離，或者它們可以從異種來(lái)源中分離，例如不同的植物、真菌等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包括兩種基因，一種編碼FAD3，另ー種編碼Cb5同エ型。另ー方面，ー種或多種轉(zhuǎn)基因置于組織特異性啟動(dòng)子的控制下，使得轉(zhuǎn)基因以種子特異的方式表達(dá)。根據(jù)本公開(kāi)的一方面，為了提高宿主生物產(chǎn)生的油的量和/或質(zhì)量，可以將轉(zhuǎn)基因?qū)胨拗魃镉糜诋a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。方法包括將第一轉(zhuǎn)基因?qū)胨拗魃锏牟襟E，其中第一轉(zhuǎn)基因具有與SEQ ID. No: 1-8的多核苷酸之一至少95%，優(yōu)選99%，更優(yōu)選100% —致的序列。優(yōu)選地，第一轉(zhuǎn)基因編碼的多肽具有與SEQ ID. No: 1-8的多核甘酸之一所編碼的多肽的序列至少95%，優(yōu)選99%，更優(yōu)選100%—致的氨基酸序列。另ー方面，轉(zhuǎn)基因可以是使檸檬酸發(fā)生分解代謝的檸檬酸裂解酶。例如，可以將ACLl基因、ACL2基因或者兩者導(dǎo)入宿主植物，這些基因在質(zhì)體中的過(guò)表達(dá)可以有助于提高こ酰輔酶A的合成。另ー方面，轉(zhuǎn)基因可以與SEQ ID. No:9-10的多核苷酸之一具有至少95%的同一性。方法還可以包括允許所述宿主生物表達(dá)由第一轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白的步驟。宿主生物優(yōu)選植物，轉(zhuǎn)基因生物優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物。除第一轉(zhuǎn)基因之外，方法可以包括將第二轉(zhuǎn)基因?qū)胨鏊拗髦参锏牟襟E，其中第二轉(zhuǎn)基因編碼脂肪酸去飽和酶，例如高等植物的FAD2或FAD3ο 一方面，第一和第二轉(zhuǎn)基因來(lái)自相同的植物物種。另ー方面，第一和第二轉(zhuǎn)基因來(lái)自不同的植物物種。一方面，轉(zhuǎn)基因植物比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生更高的油含量。另ー方面，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的油比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生的脂肪酸，具有更高百分比的不飽和脂肪酸。所公開(kāi)的方法可以應(yīng)用于任何植物，優(yōu)選含油植物，例如大豆、擬南芥、玉米、花生、加拿大油菜及其它。傳統(tǒng)培育也可以用來(lái)產(chǎn)生具有期望的油含量或不同脂肪酸之間期望的比例的植物品系。為了產(chǎn)生能表達(dá)相對(duì)高水平的Cb5和FAD的新品系，可以將自然條件下表達(dá)相對(duì)高水平的Cb5和/或FAD的品系用作培育的親代植株。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，可以將耶羅威亞酵母ATP檸檬酸裂解酶(ACL)基因(如ACLl (Genbank :XM 504787)和 ACL2 (Genbank :XM 503231))導(dǎo)入宿主植物以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物能比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生更高水平的種子油含量。為了指導(dǎo)ACL基因產(chǎn)物進(jìn)入質(zhì)體,可以將該基因進(jìn)行工程化改造使之包含質(zhì)體定位序列。由于ACL酶能夠使質(zhì)體內(nèi)可用的檸檬酸發(fā)生分解代謝，在質(zhì)體中過(guò)表達(dá)ACL酶可以有助于提高こ酰輔酶A的合成。依次地，増加的こ酰輔酶A可以導(dǎo)致脂肪酸的合成増加及種子中油的累積提高。可以使用本文公開(kāi)的基因的各種形式，它們與本文公開(kāi)的基因可以不100%—致。這些改變的基因可以編碼這樣的蛋白，該蛋白能進(jìn)行與本文所公開(kāi)的蛋白本質(zhì)上相同或相似的功能。舉例說(shuō)明，可以使用編碼FAD3蛋白的突變的FAD3基因，所述FAD3基因與本文所公開(kāi)的FAD3序列具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%的同一性。這些FAD3基因包括但不限于本文公開(kāi)的大豆和擬南芥FAD3基因。類似地，可以使用突變的Cb5同エ型或真菌的ACL基因。的確，通過(guò)點(diǎn)突變、斷裂或插入的某些突變可以賦予表達(dá)的蛋白某些期望的特性，例如定位信號(hào)、結(jié)合基序等。在另一方面，ACL基因、Cb5基因和編碼去飽和酶的各種基因可以在同一植物中共表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)較高的油含量和特定脂肪酸間期望的比例，例如，不飽和脂肪酸占總脂肪酸重量的較高百分比。


圖I說(shuō)明了大豆(Glycine max)Cb5蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。圖2展示了大豆(Glycine max var. Williams)器官特異的Cb5基因的表達(dá)分析。圖3展示了共表達(dá)大豆Cb5和FAD2的酵母中16:2和18:2的含量。圖4展示了共表達(dá)擬南芥Cb5和FAD2的酵母中16:2和18 :2的含量。圖5展示了共表達(dá)大豆Cb5和FAD3的酵母中18:3的含量。圖6展示了共表達(dá)擬南芥Cb5和FAD3的酵母中18:3的含量。圖7展示了共表達(dá)擬南芥或大豆Cb5和非天然FAD3的酵母中18:3的含量。圖8展示了利用vector NTI軟件對(duì)推斷的大豆Cb5 (GmCb5)同エ型的氨基酸序列與油桐和擬南芥中已知的和推測(cè)的位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Cb5蛋白進(jìn)行的比對(duì)。圖9展示了過(guò)表達(dá)耶羅威亞酵母ACL基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥中種子脂肪酸的范圍。圖10展示了大豆(Glycine max)的細(xì)胞色素b5 (Cb5)基因，即Cb5Al (SEQID. No. I)、Cb5-C2 (SEQ ID. No. 2)、Cb5_C3 (SEQ ID. No. 3)、Cb5_El (SEQ ID. No. 4)的核酸序列。圖11展不了擬南芥(Arabidopsis thaliana)的細(xì)胞色素b5(Cb5)基因，即Cb5-A (SEQ ID. No. 5)、Cb5-B(SEQ ID. No. 6)、Cb5_C (SEQ ID. No. 7)、Cb5_E (SEQ ID. No. 8)的
核酸序列。圖12 展不了解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)ACLl (SEQ ID. No. 9)和ACL2 (SEQ ID. No. 10)基因的核酸序列。詳細(xì)說(shuō)明植物經(jīng)由被稱為脂肪酸合成酶(FAS)途徑的常見(jiàn)代謝途徑合成脂肪酸。β_酮脂酰-ACP (酰基載體蛋白部分)合酶是脂肪酸合成酶途徑中重要的限速酶。β-酮脂酰-ACP合酶在植物細(xì)胞中以數(shù)種形式存在。β -酮脂酰-ACP合酶I催化鏈延長(zhǎng)至棕櫚酰-ACP (C16:0)，而β -酮脂酰-ACP合酶II催化鏈延長(zhǎng)至硬脂酰-ACP (C18:0)。β -酮脂酰-ACP合酶IV是β -酮脂酰-ACP合酶II的變體，并且也能夠催化鏈延長(zhǎng)至18:0-ACP。在大豆中，F(xiàn)AS的主要產(chǎn)物是16:0-ACP和18:0-ACP。在大豆和許多其他植物中，位于質(zhì)體的可溶的Λ-9去飽和酶(也被稱為“硬脂酰-ACP去飽和酶”)催化18:0-ACP的去飽和，從而形成18:1-ACP。質(zhì)體FAS和Λ -9去飽和酶的產(chǎn)物(即16:0-ACP, 18:0-ACP和18:1-ACP)可以被特定的硫酯酶水解。根據(jù)序列同源性和底物偏好性，植物硫酯酶可以被分為兩個(gè)家族。第一家族(FATA)包括長(zhǎng)鏈?；?ACP硫酯酶，主要對(duì)18:1-ACP具有活性。第二家族的酶(FATB)通常利用 16:0-ACP (棕櫚酰-ACP)、18:0-ACP (硬脂酰-ACP)和 18:1-ACP (油酰-ACP)。植物中在脂肪酸從頭生物合成期間，這些硫酯酶在決定鏈的長(zhǎng)度中發(fā)揮了重要作用，因而對(duì)提供脂肪?；M分的不同修飾是有幫助的，特別是關(guān)于存在于儲(chǔ)存油的種子中的不同脂肪酰基的相對(duì)比例。 FATA和FATB反應(yīng)的產(chǎn)物(即游離脂肪酸)離開(kāi)質(zhì)體，并轉(zhuǎn)化成為他們各自的?；o酶A酷。酰基輔酶A是脂質(zhì)-生物合成途徑(Kennedy途徑)的底物，該途徑發(fā)生在植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。這條途徑負(fù)責(zé)膜脂質(zhì)的形成和三酰甘油的生物合成，三酰甘油是種子油的主要成分。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的其他膜結(jié)合的去飽和酶可以進(jìn)ー步將18:1去飽和形成多不飽和脂肪酸，例如18:2和18:3。大豆基因組具有兩種種子特異性Λ-12去飽和酶FAD2的同エ型，命名為FAD2-1A和FAD2-1B，它們之間只有24個(gè)氨基酸殘基的不同。在大豆基因組序列中，編碼FAD2-1A和FAD2-1B的基因分別被命名為連鎖群O中的Glymal0g42470和連鎖群I中的Glyma20g24530 (GlymaL O,大豆基因組計(jì)劃,DoE Joint Genome Institute)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)FAD2-1A和FAD2-1B，在那里它們能夠進(jìn)ー步將油酸去飽和形成多不飽和脂肪酸。Λ-12去飽和酶催化雙鍵插入油酸(18:1)，形成亞油酸，并導(dǎo)致油酸水平隨之降低。Λ-15去飽和酶(FAD3)催化雙鍵插入亞油酸(18:2)，形成亞麻酸(18:3)。大豆基因組具有四種FAD3基因的同エ型，例如 FAD3-lA(Anai et al. ,2005)和 FAD3B(Bilyeu et al. ,2003)等。在高等植物中，脂肪酸的從頭合成只發(fā)生在質(zhì)體中，但是它們后續(xù)的去飽和發(fā)生在兩個(gè)不同的間隔中，即質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。除了氧，需要某些輔助因子將雙鍵引入脂肪酸。這些輔助因子可以有助于為位于這兩處間隔中各自的去飽和酶提供電子。在質(zhì)體中，光反應(yīng)產(chǎn)生的還原型鐵氧還蛋白作為輔助因子。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，Cb5蛋白為FAD2和FAD3兩者提供電子[13]。盡管兩條途徑對(duì)去飽和的終產(chǎn)物的相對(duì)貢獻(xiàn)隨組織和物種而不同，但在大量的被子植物中，大多數(shù)PUFA的合成通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的FAD2(18:1至18:2的去飽和)和FAD3(18:2至18:3的去飽和)去飽和酶[14，15]。在高等植物中，幾乎全部脂肪酸都由こ酰輔酶A合成。已經(jīng)證實(shí)，擬南芥中通過(guò)大鼠ATP檸檬酸裂解酶(ACL)的組成型表達(dá)而導(dǎo)致的質(zhì)體中こ酸量的升高，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥葉子中脂肪酸的產(chǎn)生。參見(jiàn)Rangasamy and Ratledge (2000)。根據(jù)本公開(kāi)，不同高等植物中不同的Cb5同エ型可能不具有相同的去飽和效率。擬南芥的Cb5-C和Cb5-B同エ型顯示出較高的ω-6去飽和以及Cb5_B和Cb5_E同エ型顯示出較高的ω-3去飽和，這表明它們可以以不同的效率分別與FAD2和FAD3相互作用。與擬南芥相反，大豆Cb5同エ型沒(méi)有表現(xiàn)出不同的ω-6去飽和。然而，不同大豆Cb5同エ型表現(xiàn)出不同的ω-3去飽和效率。而且，本研究獲得的結(jié)果進(jìn)一歩表明，ω-3或ω-6去飽和的終產(chǎn)物的產(chǎn)量不僅由Cb5的屬性決定，而且由脂肪酸去飽和酶的性質(zhì)決定。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在兩種電子傳遞鏈ー個(gè)是NADPH:細(xì)胞色素P450還原酶和P450，另ー個(gè)是NADH:細(xì)胞色素b5還原酶和Cb5[18]。后者被認(rèn)為是提供基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的FAD2(18:1至18:2的去飽和)和FAD3(18:2至18:3的去飽和)去飽和酶的還原等同物的主要途徑[14，15]。生物化學(xué)證據(jù)也表明，高等植物的FAD2和FAD3都利用Cb5作為電子供體[41]。盡管大量數(shù)據(jù)顯示高等植物的FAD2和FAD3調(diào)節(jié)18C PUFA的合成，但是關(guān)于這些去飽和酶介導(dǎo)的反應(yīng)中各種Cb5同エ型作用的并行信息還很有限。本文利用內(nèi)源Cb5基因 缺陷的突變酵母菌株證明了來(lái)自擬南芥或大豆的各種Cb5同エ型在FAD2和FAD3介導(dǎo)的反應(yīng)中的貢獻(xiàn)。如通過(guò)圖I的系統(tǒng)樹(shù)所顯示的，同擬南芥一祥，大豆Cb5同エ型有類似的分岐。研究了這些大豆Cb5基因的表達(dá)模式。顯然，盡管所有GmCb5基因顯示組成型表達(dá)模式，但在所有器官(包括是油儲(chǔ)存和TAG合成位置的種子)中，GmCb5-Al和GmCb5_El的表達(dá)高于其他同エ型(圖2)。有趣的是，這些不同的大豆Cb5蛋白顯示類似的ω-6去飽和效率。雖然這些結(jié)果與用油桐Cb5同エ型所觀察到的結(jié)果一致，但是即使前體的可供性類似，在突變cb5酵母中大豆FAD2通常導(dǎo)致雙不飽和脂肪酸的累積比擬南芥FAD2高大約10倍。這些結(jié)果表明大豆FAD2與硬脂酰輔酶A去飽和酶的功能性Cb5結(jié)構(gòu)域有較高的相互作用效率[35]。這種主張還通過(guò)以下來(lái)支持特別是在較低溫度條件下證明在只表達(dá)FAD2或共表達(dá)Cb5和FAD2的突變cb5酵母中，總雙不飽和脂肪酸具有相對(duì)相似的水平(圖3A)。綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明大豆Cb5同エ型在ω-6去飽和中明顯沒(méi)有差別，這可能是由于硬脂酰輔酶A去飽和酶的功能性Cb5結(jié)構(gòu)域的其他貢獻(xiàn)。本文公開(kāi)了利用酵母olel cb5雙突變體(分別缺陷硬脂酰輔酶A去飽和酶和微粒體Cb5)，探究大豆Cb5同エ型在ω -6去飽和中的作用的試驗(yàn)。酵母是研究脂肪酸去飽和的合適系統(tǒng)，因?yàn)榻湍柑峁┝苏婧松锏膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)、Cb5和NADH:細(xì)胞色素b5還原酶。已證實(shí)酵母代謝相關(guān)的幾個(gè)因素(如脂肪酸合成速率、脂肪酸分解速率和外源脂肪酸并入速率)決定了終產(chǎn)物的累積水平。然而，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)至多只是半定量的[25]。本文公開(kāi)的結(jié)果證明擬南芥不同的Cb5同エ型在ω-6去飽和中并非同樣有效，如通過(guò)分別在較高(圖4Α)或較低溫度(圖4Β)下，Cb5-B和Cb5-C同エ型二者表現(xiàn)出的雙不飽和脂肪酸(18:2和16:2)高于其他同エ型約I. 5至2倍所證實(shí)的。與之相反，在大豆Cb5同エ型的實(shí)例中，在較高(圖3A)或較低(圖3B)溫度下，它們總雙不飽和脂肪酸水平的差異不顯著，這表明不同的同エ型具有類似的ω-6去飽和效率。有趣地注意到，大豆和擬南芥實(shí)驗(yàn)是在可比較的生長(zhǎng)條件下獨(dú)立進(jìn)行的。更具體地，在大豆和擬南芥實(shí)驗(yàn)中FAD2前體(18:1和16:1)的可供性是類似的，這排除了可能會(huì)對(duì)大豆和擬南芥的不同結(jié)果造成任何偏差的可能性。盡管轉(zhuǎn)錄本水平還沒(méi)有被測(cè)量，但在可比較的生長(zhǎng)條件下，不同的轉(zhuǎn)錄本累積不可能成為因素，因?yàn)榇蠖购蛿M南芥的FAD2和Cb5分別被同樣的GALlO和GALl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。除了 Cb5同エ型在ω-6去飽和中的行為不同，在可比較的生長(zhǎng)條件下，還證明了大豆和擬南芥的Cb5同エ型在ω-3去飽和中的顯著變化。大豆Cb5-C2、Cb5-El和Cb5-Al (圖5A)以及擬南芥Cb5-B和Cb5_E(圖6A)始終顯示出高于它們的其他同エ型的18:3累積。大豆(圖5)和擬南芥(圖6)實(shí)驗(yàn)是在可比較的生長(zhǎng)條件下獨(dú)立進(jìn)行的，因?yàn)镕AD3前體(18:2)的可供性是類似的，這排除了 18:2參與所觀察到的不同的18:3累積。更重要的是，在可比較的生長(zhǎng)條件下，通過(guò)大豆Cb5-El(GmCb5-El)和Cb5_Al (GmCb5_Al)以及擬南芥Cb5-B (AtCb5-B)和Cb5-E (AtCb5-E)甚至與非天然FAD3(圖7A)導(dǎo)致的較高的18:3積累，證明它們保留了較高的ω-3去飽和效率。在較低溫度條件下，用除AtCb5-C以外的大多數(shù)Cb5同エ型均觀察到類似的趨勢(shì)，它們顯示18:3的水平與AtCb5-B類似(圖7B)。盡管觀察到大豆和擬南芥中大多數(shù)Cb5同エ型保留了不同的ω-3去飽和特性，但是吸引人的是，尤其在用非天然AtFAD3的條件下(圖7)，用GmCb5-C2和GmCb5_C3 二者的18:3水平比用其天然FAD3所獲得的水平(圖5)顯著降低了大約3倍。需要注意的是，在與其天然FAD3共表達(dá)的條件下，擬南芥Cb5-C積累的18:3比與其他同エ型少2_4倍(圖6)。 然而，在較高或較低的溫度條件下(圖7A和B)，擬南芥Cb5-C(AtCb5-C)與非天然GmFAD3的共表達(dá)導(dǎo)致18:3的水平比與天然FAD3共表達(dá)所獲得的水平(圖6A和B)顯著增加2至4倍。有趣的是，在僅用大豆FAD3而不用擬南芥FAD3的情況下，觀察到不論是用來(lái)自大豆還是擬南芥的‘C’類Cb5蛋白都具有較高的18:3累積。在系統(tǒng)發(fā)育分析中(圖l)，Cb5蛋白的四個(gè)任意類別(即A、B、C和E)中，來(lái)自大豆的‘C’類形成了単獨(dú)的組，其與擬南芥Cb5-C(AtCb5-C)成簇接近。來(lái)自大豆、油桐和擬南芥的不同的Cb5蛋白的氨基酸比對(duì)表明，盡管‘C’類蛋白與其他種類具有顯著較高水平的總體同一性，但是在它們的C末端(盒中)有大量的差異，尤其是在位于跨膜結(jié)構(gòu)域之前的區(qū)域(圖8)。還不清楚氨基酸的這種不同對(duì)于‘C’類Cb5蛋白與大豆FAD3而不是擬南芥FAD3的更大的相互作用效率是否有任何意義，但本文提供的結(jié)果表明，Cb5同エ型的進(jìn)化趨異可能有助于它們與去飽和酶不同的相互作用效率，如通過(guò)它們的去飽和產(chǎn)物產(chǎn)量的差異所證實(shí)的。已證明與擬南芥相比，利用大豆去飽和酶(FAD2/FAD3)具有顯著更高的產(chǎn)物積累，這表明它們可能具有不同的酶促效率。幾項(xiàng)以前的研究也報(bào)導(dǎo)了高等植物去飽和酶的不同效率。例如，大豆FAD2-1A和FAD2-1B蛋白共享大約93%的氨基酸同一性，較高或較低溫度下在野生型酵母中已證實(shí)后者多積累2至4倍的雙不飽和脂肪酸(18:2和16:2) [34]。對(duì)于本文公開(kāi)的大豆研究，使用了與擬南芥FAD2蛋白序列共享66%同一性的FAD2-1B (數(shù)據(jù)未顯示)。這種分岐可以解釋利用大豆FAD2(FAD2-1B)具有顯著更高水平的18:1和16:1去飽和。在另ー項(xiàng)研究中，已證實(shí)野生型酵母中大豆的兩種不同的FAD3基因(即FAD3-1A和FAD3-1B)的表達(dá)，分別積累了 10. 7%和3. 7%的18:3[39]，盡管它們預(yù)測(cè)的蛋白序列的同一性高于93%。本公開(kāi)使用的大豆FAD3(FAD3-1A)與擬南芥FAD3蛋白共享66. 6%的同一性(數(shù)據(jù)未顯示)。與擬南芥FAD3(圖6)相比，利用大豆FAD3 (圖5)分別在突變體cb5和野生型酵母中觀察到18:3的累積增加了 30至40倍，這可能是由于來(lái)源于兩種分歧物種的這些蛋白的內(nèi)在變異。同樣的理由還可以解釋與大豆FAD3相比，擬南芥FAD3缺少Λ-12去飽和活性。有趣地注意到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白中，脂肪酸去飽和酶(FAD)與其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白相比具有較短的半衰期。例如，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的Cb5蛋白的2-6天的半衰期相比，哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的硬脂酰輔酶A去飽和酶具有4小時(shí)的半衰期，所述硬脂酰輔酶A去飽和酶在結(jié)構(gòu)上與植物FAD2/FAD3酶家族有關(guān)[42及其參考文獻(xiàn)]。已經(jīng)有文獻(xiàn)表明，環(huán)境因素能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的FAD蛋白的半衰期。例如，低溫下在異源酵母系統(tǒng)中由高等植物FAD2[34]和FAD3[26]導(dǎo)致的不飽和度的提高，與其轉(zhuǎn)錄本的任何増加都沒(méi)有關(guān)系，但與各自去飽和酶的穩(wěn)態(tài)水平的増加有關(guān)。通過(guò)上面的例子類推，似乎有可能的是，尤其在較低溫度條件下所觀察到的，大豆FAD3蛋白豐度的増加及其與酵母Cb5更高的相互作用效率，可能會(huì)導(dǎo)致大豆Cb5同エ型中18:3的水平?jīng)]有差別(圖5B)。而且，尤其在較低溫度條件下(圖6B)與其天然EAD3共表達(dá)時(shí)，擬南芥Cb5-A與Cb5_E和Cb5_B 二者中能夠達(dá)到相對(duì)類似的18:3水平，這也表明FAD3豐度的可能增加有可能促成18:3水平較小的差異。在用擬南芥FAD3(AtFAD3)而不是用大豆FAD3 (GmFAD3)的情況下，觀察到不論是來(lái)自大豆(GmCb5_C2和GmCb5-C3)還是來(lái)自擬南芥(AtCb5-C)的‘C’類Cb5蛋白都具有較低的ω-3去飽和效率。這些不同可以解釋，在較低溫度條件下所觀察到的擬南芥Cb5-C與天然FAD3作用為什么沒(méi)有實(shí)質(zhì)上増加18:3的水平(圖6B)，并且還可以解釋在較低溫度下在用非天然大豆 FAD3 (GmFAD3)的條件下，擬南芥Cb5_C(AtCb5_C)與AtCb5_B中展示了相對(duì)類似的18:3水平(圖7B)。本文描述的方法和材料涉及與植物中控制種子油含量有關(guān)的基因和蛋白。根據(jù)本公開(kāi)，植物可以被遺傳修飾，從而改變它們的種子油含量。術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”被用于提及通過(guò)傳統(tǒng)育種或通過(guò)轉(zhuǎn)基因或定向破壞某些基因來(lái)改變植物性狀的行為。這些基因和蛋白可以被導(dǎo)入宿主植物，從而獲得在種子中產(chǎn)生和儲(chǔ)存更多或更少油的植物。本文使用的“基因”是指編碼蛋白或多肽的核酸序列?；虻膹V泛定義可以包括啟動(dòng)子區(qū)、內(nèi)含子和外顯子區(qū)以及位干與基因產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)的編碼序列的3’或5’端的非翻譯區(qū)。本文使用的“基因型”是指細(xì)胞或生物的遺傳構(gòu)成。本文使用的“表型”是指可檢測(cè)的細(xì)胞或生物特性，這些特性是所述細(xì)胞或生物中基因表達(dá)的表現(xiàn)。為了本公開(kāi)的目的，非遺傳修飾的(非-GM0)表示能夠適度地在自然界中發(fā)生。如果沒(méi)有通過(guò)遺傳工程改造而改變生物的遺傳構(gòu)成，則生物被認(rèn)為是非遺傳修飾的。遺傳エ程可以通過(guò)以重組核酸的形式添加基因或其片段，例如轉(zhuǎn)基因，通過(guò)缺失生物中的某些多聚核酸，或通過(guò)改變生物內(nèi)源基因的序列或表達(dá)水平。本文使用的“雜交”是指兩個(gè)親代植株的交配?！爸舅帷?或“FA”)是羧酸，通常含有長(zhǎng)的無(wú)支鏈的脂肪族烴鏈。(18:2)、(18:1)、(18:3)等命名分別指脂肪酸鏈中的碳原子數(shù)及其中的雙鍵數(shù)。例如，油酸(18:1)包含18個(gè)碳原子和I個(gè)雙鍵。示例性脂肪酸包含ω -3 脂肪酸如α -亞麻酸(CH3 (CH2CH=CH) 3 (CH2) 7C00H) ω -6 脂肪酸如亞油酸(CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2) 7C00H)ω -9 脂肪酸如油酸(CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 7C00H)及飽和脂肪酸如棕櫚酸(CH3 (CH2) 14C00H)硬脂酸(CH3(CH2) 8C00H)。本文使用的分離的核酸是指不含與自然環(huán)境中存在的核酸相關(guān)的至少ー些污染物的核酸。分離的核酸可以包括去除內(nèi)含子的DNA。對(duì)于多核苷酸，術(shù)語(yǔ)“突變”或“突變的”是指ー個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失或插入，ー個(gè)或多個(gè)核苷酸被不同核苷酸取代。對(duì)于編碼序列，突變可以弓I起編碼多肽的任何變化或可以不引起編碼多肽的任何變化。同樣地，對(duì)于多肽，突變可以是ー個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或插入，一個(gè)或多個(gè)氨基酸被不同氨基酸取代?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)，例如但不限于定點(diǎn)誘變，在分離的多聚核酸中產(chǎn)生突變。突變也可以通過(guò)X射線、伽馬射線或快中子照射和化學(xué)誘變劑處理(如烷化劑こ基甲磺酸(EMS)或N-亞硝基-N-甲基脲(NMU))誘導(dǎo)。此外，由在植物基因組DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的隨機(jī)的DNA聚合酶錯(cuò)誤所產(chǎn)生的突變能夠?qū)е伦匀坏倪z傳變異。暴露于自然來(lái)源的電離或非電離輻射后DNA修復(fù)機(jī)制的活化也可以在植物中導(dǎo)致自然的遺傳變異。
可以使用整株植物或植物的一部分。優(yōu)選的植物部分包含生殖部分或儲(chǔ)存部分。本文使用的術(shù)語(yǔ)“植物部分”包括但不限于種子、胚乳、胚珠、花粉、根、塊莖、莖、樹(shù)葉、葉柄、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、樹(shù)皮、豆莢、種子和花。在本公開(kāi)的實(shí)施方案中，植物部分是種子。通常通過(guò)被稱為啟動(dòng)子的基因非編碼區(qū)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。當(dāng)啟動(dòng)子控制基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，也可以表述成啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因(或編碼的蛋白)的表達(dá)。當(dāng)啟動(dòng)子被置于編碼序列附近，使得所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄受啟動(dòng)子的控制時(shí)，可以表述成編碼序列可操作地連接于啟動(dòng)子。與基因不是正常相關(guān)的啟動(dòng)子被稱為異源啟動(dòng)子。當(dāng)啟動(dòng)子只在特定組織中啟動(dòng)某些基因的表達(dá)時(shí)，這樣的啟動(dòng)子被稱為組織特異性啟動(dòng)子。在本公開(kāi)中，術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”和“肽”可以相互交換使用，它們都是指氨基酸聚合物。除了本文明確公開(kāi)的肽，可以在這些肽中進(jìn)行某些“保守性”突變而不會(huì)顯著改變肽的功能。如同本領(lǐng)域內(nèi)所通常理解的，直系同源蛋白中的保守氨基酸殘基是進(jìn)化壓カ的結(jié)果，從而維持生物學(xué)功能和/或蛋白折疊。直系同源的ー組基因中，保守的氨基酸位置能夠參與結(jié)構(gòu)和功能的許多方面。不變的位置或表現(xiàn)出保守的某些殘基特性(如電荷、疏水性等)的位置不可能比蛋白家族允許突變成各種氨基酸的位置耐受突變。例如，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的序列，位置上的氨基酸序列保守在決定可能對(duì)蛋白折疊和/或生物學(xué)功能產(chǎn)生不利影響的氨基酸取代中是有用的。根據(jù)序列同源性和氨基酸的物理性質(zhì)，可以使用計(jì)算機(jī)算法序列比對(duì)程序預(yù)測(cè)氨基酸取代是否會(huì)影響蛋白的功能?？梢允褂美?，但不限于SIFT、PolyPhen, SNPs3D、PANTHER PSEC、PMUT和TopoSNP的氨基酸取代預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)氨基酸取代對(duì)蛋白功能的影響。保守性氨基酸取代通常定義為用不同的保留蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。用另ー個(gè)氨基酸對(duì)ー個(gè)氨基酸的“非保守性”取代是指具有不同結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的氨基酸取代，并且通?；谒婕暗臍埢臉O性、電荷、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)的不同。取代的氨基酸可以包括天然存在的氨基酸以及在自然界存在的蛋白中不是正常存在的那些氨基酸。
實(shí)施例
以下非限制性的實(shí)施例報(bào)道了一般程序、試劑及通過(guò)實(shí)例教導(dǎo)的表征方法，并且不應(yīng)該以將公開(kāi)限制為具體公開(kāi)內(nèi)容的狹義的方式解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以做出多種修改，而結(jié)果仍然落入本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實(shí)施例I大豆Cb5基因的鑒定、克隆和表達(dá)模式公開(kāi)發(fā)表的幾乎全部的大豆基因組序列(Glycine max var. Williams ;也可以從WWW. phytozome. org網(wǎng)站獲得)使得我們可以在基因組范圍內(nèi)研究Cb5基因。當(dāng)使用推斷的擬南芥Cb5(At5g53560)蛋白查詢TBLASTN全大豆基因組時(shí)，鑒定了 11個(gè)有前景的Cb5候選基因(表2)。表2 大 (Glycine max var Williams)細(xì)胞色素 b5(Cb5)基因
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物來(lái)提高所述生物產(chǎn)生的油的量和/或質(zhì)量的方法，所述方法包括如下步驟 a)將第一轉(zhuǎn)基因?qū)胨拗魃镏?，所述第一轉(zhuǎn)基因具有與選自SEQIDNO: 1-8的多核苷酸的序列至少95%—致的序列； b)允許所述宿主生物表達(dá)由所述第一轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主生物是植物，并且所述轉(zhuǎn)基因生物是轉(zhuǎn)基因植物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生更高的油含量。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的脂肪酸比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生的脂肪酸具有更高百分比的不飽和脂肪酸。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述植物選自大豆、擬南芥、玉米、花生和加拿大油菜。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中將編碼脂肪酸去飽和酶的第二轉(zhuǎn)基因?qū)胨鏊拗髦参铩?br> 7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二轉(zhuǎn)基因選自高等植物FAD2和FAD3。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)基因來(lái)自相同的植物物種。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)基因來(lái)自不同的植物物種。
10.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物來(lái)提高所述生物產(chǎn)生的油的量和/或質(zhì)量的方法，所述方法包括如下步驟 a)將編碼多肽的第一轉(zhuǎn)基因?qū)胨拗魃镏?，所述多肽具有與選自SEQID ΝΟ:1-8的多核苷酸所編碼的多肽序列至少95% —致的氨基酸序列； b)允許由所述第一轉(zhuǎn)基因編碼的所述多肽在所述宿主生物中表達(dá)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述宿主生物是植物，并且所述轉(zhuǎn)基因生物是轉(zhuǎn)基因植物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生更高的油含量。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的脂肪酸比非轉(zhuǎn)基因宿主植物產(chǎn)生的脂肪酸具有更高百分比的不飽和脂肪酸。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中將編碼脂肪酸去飽和酶的第二轉(zhuǎn)基因?qū)胨鏊拗魃铩?br> 15.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物來(lái)提高所述生物產(chǎn)生的油的量和/或質(zhì)量的方法，所述方法包括如下步驟 a)將轉(zhuǎn)基因?qū)胨拗魃镏?，所述轉(zhuǎn)基因具有與選自SEQID N0:9-10的多核苷酸的序列至少95%—致的序列； b)允許所述宿主生物表達(dá)由所述第一轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述宿主生物是植物，并且所述轉(zhuǎn)基因生物是轉(zhuǎn)基因植物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述植物選自大豆、擬南芥、玉米、花生和加拿大油菜。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中將兩種轉(zhuǎn)基因?qū)胨鏊拗魃镏?，第一轉(zhuǎn)基因具有與SEQ ID N0:9的多核苷酸至少95%—致的序列，并且第二轉(zhuǎn)基因具有與SEQ ID NO: 10的多核苷酸至少95% —致的序列。
19.轉(zhuǎn)基因植物，其根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法從宿主植物產(chǎn)生。
20.轉(zhuǎn)基因植物，其根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法從宿主植物產(chǎn)生。
21.轉(zhuǎn)基因植物，其根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法從宿主植物產(chǎn)生。
全文摘要
細(xì)胞色素b5(Cb5)是一種位于高等真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和線粒體外膜中的血紅素結(jié)合蛋白。在高等植物、動(dòng)物和真菌中，已證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的細(xì)胞色素b5在?；o酶A脂肪酸去飽和中發(fā)揮了作用。來(lái)自諸如大豆或擬南芥的植物的高等植物Cb5同工型能夠調(diào)節(jié)ω-3去飽和。在宿主植物中共表達(dá)某些Cb5同工型和FAD3能導(dǎo)致產(chǎn)生的種子油含量增加，以及不同脂肪酸之間的比例改變。本發(fā)明還公開(kāi)了在宿主植物的質(zhì)體中過(guò)表達(dá)耶羅威亞酵母ACL酶有助于提高乙酰輔酶A的合成，從而可以導(dǎo)致脂肪酸合成的增加以及種子中油累積的提高。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102822344SQ201080062940
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者拉杰什·庫(kù)馬爾, 亨利·T·恩圭耶 申請(qǐng)人:密蘇里大學(xué)管委會(huì)