專利名稱：CRY1Da和CRY1Fa蛋白用于昆蟲(chóng)抗性管理的組合用途的制作方法
CRYIDa和CRYIFa蛋白用于昆蟲(chóng)抗性管理的組合用途
背景技術(shù)：
人類種植玉米(corn)以供食物和能量應(yīng)用。人類還種植許多其它作物，包括大豆和棉花。昆蟲(chóng)食用并損害植物，并且由此削弱這些人類努力。每年花費(fèi)數(shù)十億美元來(lái)控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)(pest),并且它們?cè)斐傻膿p害損失額外的數(shù)十億。合成的有機(jī)化學(xué)殺蟲(chóng)劑已經(jīng)是用于控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的主要工具，但是生物學(xué)殺蟲(chóng)劑，諸如自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)衍生的殺蟲(chóng)蛋白(insecticidal protein)已經(jīng)在一些領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。經(jīng)由用Bt殺蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)化生成昆蟲(chóng)抗性植物的能力已經(jīng)使現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)生革命，而且提高殺蟲(chóng)蛋白及其基因的重要性和價(jià)值。已經(jīng)使用幾種Bt蛋白來(lái)創(chuàng)建至今已經(jīng)成功登記并商業(yè)化的昆蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因植物。這些包括玉米中的CryIAb、CryIAc、CryIF和Cry3Bb、棉花中的CrylAc和Cry2Ab、和馬鈴薯中的Cry3A。
除了在2種蛋白質(zhì)的組合殺蟲(chóng)譜是期望的(例如，玉米中的CryIAb和Cry3Bb組合以分別提供對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)和根蟲(chóng)的抗性)或蛋白質(zhì)的獨(dú)立作用使它們可用作用于延遲易感昆蟲(chóng)群中抗性形成的工具(例如，棉花中的CrylAc和Cry2Ab組合以提供煙草蚜蟲(chóng)的抗性管理)的情況中外，表達(dá)這些蛋白質(zhì)的商業(yè)產(chǎn)品表達(dá)單一蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，已經(jīng)導(dǎo)致此技術(shù)的快速且普遍采用的昆蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因植物的一些質(zhì)量(quality)還引起如下的憂慮，即害蟲(chóng)(pest)群體會(huì)形成對(duì)由這些植物生成的殺蟲(chóng)蛋白的抗性。已經(jīng)提示了保留基于Bt的昆蟲(chóng)抗性性狀的效用的幾種策略，其包括與避難所(refuge)組合以及與不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高劑量的蛋白質(zhì)(McGaughey 等(1998)，“B. t. Resistance Management, ”NatureBiotechnol. 16:144-146)。為了在IRM疊加中使用而選定的蛋白質(zhì)需要獨(dú)立地施加其殺蟲(chóng)效果，使得對(duì)一種蛋白質(zhì)形成的抗性未賦予對(duì)第二種蛋白質(zhì)的抗性(即，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)的交叉抗性)。如果例如在對(duì)“蛋白質(zhì)A”的抗性方面選定的害蟲(chóng)群對(duì)“蛋白質(zhì)B”敏感，那么會(huì)推斷沒(méi)有交叉抗性，并且蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B的組合會(huì)有效延遲對(duì)單獨(dú)的蛋白質(zhì)A的抗性。在沒(méi)有抗性昆蟲(chóng)群的情況中，可以基于假設(shè)與作用機(jī)制和交叉抗性潛力相關(guān)的其它特征做出評(píng)估。已經(jīng)提示了受體介導(dǎo)的結(jié)合在鑒定有可能不展現(xiàn)出交叉抗性的殺蟲(chóng)蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的關(guān)鍵預(yù)測(cè)物(predictor)是殺蟲(chóng)蛋白在敏感的昆蟲(chóng)物種中不競(jìng)爭(zhēng)受體。在兩種Bt毒素競(jìng)爭(zhēng)相同受體的情況中，則若所述受體在所述昆蟲(chóng)中突變，使得毒素之一不再結(jié)合所述受體，并且如此針對(duì)昆蟲(chóng)不再是殺蟲(chóng)性的，則情況可能是昆蟲(chóng)也會(huì)對(duì)第二種毒素(其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同受體)有抗性。也就是說(shuō)，昆蟲(chóng)被說(shuō)成與這兩種Bt毒素有交叉抗性。然而，若兩種毒素結(jié)合兩種不同受體，則這可以是如下的指示，即昆蟲(chóng)不會(huì)對(duì)那兩種毒素同時(shí)有抗性。CrylFa可用于控制許多鱗翅目害蟲(chóng)物種，包括歐洲玉米螟(European cornborer) (ECB ;玉米螟(Ostrinia nubilalis) (Hiibner ))和秋粘蟲(chóng)(fall armyworm) (FAff ；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)),并且針對(duì)甘鹿螟(sugarcane borer) (SCB ;小鹿螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。CrylFa蛋白(如在含有事件TC1507的玉米植物中生成的)負(fù)責(zé)供FAW控制用的行業(yè)領(lǐng)先的昆蟲(chóng)抗性性狀。CrylFa在Herculex 、SmartStax 、和WideStrike 產(chǎn)品中進(jìn)一步部署。因?yàn)榭捎糜跇?biāo)記受體結(jié)合測(cè)定法中檢測(cè)的蛋白質(zhì)的最常見(jiàn)技術(shù)滅活CrylFa蛋白的殺蟲(chóng)活性，所以使用CrylFa蛋白進(jìn)行(競(jìng)爭(zhēng)性或同源性)受體結(jié)合研究的能力是有限的。其它Cry毒素列于官方B. t.命名委員會(huì)的站點(diǎn)(Crickmore等；lifesci. sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。見(jiàn)所附的附錄A。目前有幾乎60個(gè)“Cry”毒素大類(Cryl-Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。許多數(shù)字組各自具有大寫(xiě)字母亞組，而大寫(xiě)字母亞組具有小寫(xiě)字母亞-亞組。(例如，Cryl具有A-L,而CrylA具有a_i)。

發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即在對(duì)CrylFa蛋白的殺蟲(chóng)活性的抗性方面選擇的秋粘蟲(chóng)(草地夜蛾；FAW)群體對(duì)CrylDa蛋白的殺蟲(chóng)活性沒(méi)有抗性。憑借本公開(kāi)內(nèi)容的益處，如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，表達(dá)這兩種殺蟲(chóng)蛋白或其殺蟲(chóng)部分的植物會(huì)可用于延遲或阻止對(duì)單獨(dú)的這些殺蟲(chóng)蛋白之任一種的抗性的形成。本發(fā)明還得到如下的發(fā)現(xiàn)支持，即CrylFa和CrylDa彼此不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)自FAW的腸受體。本發(fā)明還部分涉及三種(或更多種)毒素的三重疊加或“金字塔(pyramid) ”，其中CrylFa和CrylDa毒素是基礎(chǔ)對(duì)(base pair)。一種優(yōu)選的金字塔提供至少兩種蛋白質(zhì)，其提供針對(duì)兩種害蟲(chóng)，即FAW和ECB (歐洲玉米螟；玉米螟)的非交叉抗性活性=CrylFa加CrylDa加一種或多種抗ECB毒素諸如CrylAb。在一些優(yōu)選的金字塔實(shí)施方案中，選定的毒素具有針對(duì)FAW的三種不同作用模式。這些優(yōu)選的“三種作用模式”金字塔組合是CrylFa加CrylD及選自下組的另一種毒素/基因Vip3Ab、CrylC、CrylBeJP CrylE。生成這三種毒素的植物(和種植有此類植物的土地面積(acreage))包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可以添加其它毒素/基因，但是依照本發(fā)明，這些特定的三重疊加會(huì)有利地且令人驚訝地提供針對(duì)FAW的三種作用模式。這可以幫助降低或消除避難土地面積的需要。一般地，本發(fā)明還涉及使用針對(duì)單一靶害蟲(chóng)彼此不競(jìng)爭(zhēng)的三種殺蟲(chóng)蛋白(在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中為Cry蛋白)。如此，CrylDa可以在3基因組合中用于玉米和其它植物(例如，棉花和大豆)。crylDa 基因可以組合入例如 CrylFa 產(chǎn)品諸如Herculex 、SmartStax 、和 WidesStrike 中。因而，CrylDa的使用可以顯著降低對(duì)其它商業(yè)化蛋白質(zhì)的選擇壓力。附圖
簡(jiǎn)述圖I :對(duì)被FAW(藍(lán)色棒)或rFAW(紫色棒)侵?jǐn)_的玉米葉節(jié)(leaf segment)的損害(均值％葉損害+SEM)。前面有數(shù)字“5163”的所有處理是來(lái)自用含有CrylDa的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的葉節(jié)。在圖的左邊遠(yuǎn)側(cè)分組未檢出CrylDa表達(dá)的植物。在圖的中間分組檢出CrylDa表達(dá)的植物。非轉(zhuǎn)基因(即，陰性)對(duì)照在圖的右邊遠(yuǎn)側(cè)，并且標(biāo)記為“B104”、“ΗΠΙ”、和“Isoline”。含有CrylFa的商業(yè)近交物(inbred)是右側(cè)的第一處理(標(biāo)記為"Herculex I”)，并且是與標(biāo)記為“Isoline”的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障嗤倪z傳背景。
圖2 CrylFa核心毒素、CrylDa核心毒素、和經(jīng)125I標(biāo)記的CrylDa核心毒素蛋白競(jìng)爭(zhēng)對(duì)草地夜蛾BBMV的結(jié)合。發(fā)明詳述如本文中報(bào)告的，轉(zhuǎn)基因玉米(和其它植物；例如棉花和大豆)中生成的CrylDa毒素在控制已經(jīng)形成對(duì)CrylFa活性的抗性的秋粘蟲(chóng)(FAW ;草地夜蛾)中是非常有效的。如此，本發(fā)明部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即對(duì)CrylFa有抗性的秋粘蟲(chóng)對(duì)CrylDa易感(即，沒(méi)有交叉抗性)。本發(fā)明還部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylDa毒素有效保護(hù)植物(諸如玉米植物)免于CrylFa抗性秋粘蟲(chóng)的損害。關(guān)于此害蟲(chóng)的討論，見(jiàn)例如Tabashnik，PNAS (2008)，第 105 卷 No. 49，19029-19030。本發(fā)明包括CrylDa毒素保護(hù)玉米和其它經(jīng)濟(jì)上重要的植物物種免于由秋粘蟲(chóng)進(jìn)食(feeding)引起的損害和產(chǎn)量損失或?qū)τ谝呀?jīng)形成對(duì)CrylFa的抗性的秋粘蟲(chóng)群的用途。如此，本發(fā)明教導(dǎo)了阻止或減輕秋粘蟲(chóng)對(duì)CrylFa和/或CrylDa的抗性形成的IRM置加。本發(fā)明提供了用于控制鱗翅目害蟲(chóng)的組合物，其包含生成含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)和含有CrylDa核心毒素的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)化為生成含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)和含有CrylDa核心毒素的蛋白質(zhì)兩者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞。優(yōu)選地，主題crylFa多核苷酸和主題crylDa多核苷酸在遺傳構(gòu)建體中在(可操作連接/包含)非蘇云金芽孢桿菌啟動(dòng)子的控制下。主題多核苷酸可以包含在植物中表達(dá)增強(qiáng)的密碼子選擇。另外，意圖本發(fā)明提供一種控制鱗翅目害蟲(chóng)的方法，包括使所述害蟲(chóng)或所述害蟲(chóng)的環(huán)境與有效量的組合物接觸，所述組合物含有含CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)，并且進(jìn)一步含有含CrylDa核心毒素的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括玉米植物及此類植物的種子，所述玉米植物包含編碼含有CrylDa核心毒素的蛋白質(zhì)的植物可表達(dá)基因和編碼含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)的植物可表達(dá)基因。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案包括玉米植物及此類植物的種子，其中已經(jīng)將編碼含有CrylDa核心毒素的蛋白質(zhì)的植物可表達(dá)基因和編碼含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)的植物可表達(dá)基因漸滲入所述玉米植物中。昆蟲(chóng)受體。如實(shí)施例中所描述的，使用放射性標(biāo)記的CrylDa核心毒素蛋白的競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合研究顯示了 CrylFa核心毒素蛋白不競(jìng)爭(zhēng)FAW昆蟲(chóng)組織中存在的CrylDa結(jié)合的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果指示，CrylFa和CrylDa蛋白的組合是一種減輕FAW群中對(duì)CrylFa的抗性形成(及同樣地，對(duì)CrylDa的抗性形成)的有效手段，并且會(huì)有可能提高表達(dá)這兩種蛋白質(zhì)的玉米植物中對(duì)此害蟲(chóng)的抗性的水平。如此，部分基于上文及本文中別處描述的數(shù)據(jù)，認(rèn)為可以使用CrylDa和CrylFa蛋白的共生成(疊加)來(lái)生成針對(duì)FAW的高劑量IRM疊加?？梢詫?duì)此組合添加其它蛋白質(zhì)以擴(kuò)充昆蟲(chóng)控制譜。例如，在玉米中，CrylAb的添加會(huì)創(chuàng)建用于控制歐洲玉米螟的IRM金字+
+R ο 另一個(gè)部署選項(xiàng)會(huì)是與另一種第三毒素/基因組合使用CrylFa和CrylDa蛋白，以及使用此三重疊加來(lái)減輕FAW中對(duì)這些毒素之任一種的抗性的形成。如此，本發(fā)明的另一個(gè)部署選項(xiàng)會(huì)是在FAW可以形成抗性群體的作物生長(zhǎng)區(qū)中使用這些蛋白質(zhì)中的一種、兩種、或三種(或更多種)。因而，本發(fā)明還部分涉及三種(或更多種)毒素的三重疊加或“金字塔”，其中CrylFa和CrylDa毒素是基礎(chǔ)對(duì)。一種優(yōu)選的金字塔提供至少兩種蛋白質(zhì)，其提供針對(duì)兩種害蟲(chóng)，即FAW和ECB (歐洲玉米螟；玉米螟)的非交叉抗性活性=CrylFa及CrylDa及一種或多種ECB毒素諸如CrylAb (見(jiàn)US 20080311096)，因?yàn)镃rylF針對(duì)這兩種昆蟲(chóng)都有活性。其它ECB毒素包括CrylBe (見(jiàn)USSN61/284，290;2009年12月16日提交)、CrylI (見(jiàn) USSN 61/284, 278 ;2009 年 12 月 16 日提交)，Cry2Aa (見(jiàn) USSN 61/284, 278 ；2009年12月16日提交)和DIG-3(見(jiàn)US 201000269223)。在一些優(yōu)選的金字塔實(shí)施方案中，選定的毒素具有針對(duì)FAW的三種不同作用模式。這些優(yōu)選的“三種作用模式”金字塔組合是CrylFa及CrylD及選自下組的另一種毒素/基因Vip3Ab、CrylC (見(jiàn)USSN61/284，281 ；2009 年 I2 月 I6 日提交)、CrylBeJP CrylE (見(jiàn) USSN 61/284, 278 ；2009 年 I2 月 I6 日提交)。生成這三種毒素的植物(和種植有此類植物的土地面積)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可以添加其它毒素/基因，但是依照本發(fā)明，這些特定的三重疊加會(huì)有利地且令人驚訝 地提供針對(duì)FAW的三種作用模式。這可以幫助降低或消除避難土地面積的需要。如此，超過(guò)10英畝如此種植的田地包括在本發(fā)明內(nèi)。如此，CrylDa可以在3基因組合中用于目前處于新性狀開(kāi)發(fā)過(guò)程的開(kāi)發(fā)I的玉米。CrylFa 在HerCU丨ex 、SmartStax 、和 WidesStrike 產(chǎn)品中。因而,CrylDa 的使用可以顯著降低對(duì)其它商業(yè)化蛋白質(zhì)的選擇壓力。例如，其它Vip3毒素列于所附附錄A中。也可以使用那些GENBANK號(hào)來(lái)獲得本文中公開(kāi)的或提及的任何基因和蛋白質(zhì)的序列。美國(guó)專利No. 5，188，960和美國(guó)專利No. 5，827，514描述了適用于用于實(shí)施本發(fā)明的含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)。美國(guó)專利No. 6，218，188描述了編碼適合于用于本發(fā)明的含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)的經(jīng)植物優(yōu)化的DNA序列?？梢允褂帽景l(fā)明中描述的毒素組合來(lái)控制鱗翅目害蟲(chóng)。成年鱗翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜為食，并且是傳粉的重要實(shí)現(xiàn)物(effector)。幾乎所有鱗翅目幼蟲(chóng)，即毛蟲(chóng)以植物為食，并且許多是嚴(yán)重的害蟲(chóng)。毛蟲(chóng)在葉上或內(nèi)部進(jìn)食或者以植物的根或莖為食，對(duì)植物剝奪營(yíng)養(yǎng)物，而且經(jīng)常破壞植物的物理支持結(jié)構(gòu)。另外，毛蟲(chóng)以果實(shí)、織物、和貯存的谷物和面粉為食，毀壞出售的這些產(chǎn)品或者嚴(yán)重降低其價(jià)值。如本文中所使用的，提及鱗翅目害蟲(chóng)指害蟲(chóng)的各個(gè)生命階段，包括幼蟲(chóng)階段。本發(fā)明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某個(gè)點(diǎn)處，蛋白質(zhì)具有向異源原毒素(protoxin)序列的過(guò)渡。Bt毒素的N端殺蟲(chóng)活性的毒素部分稱為“核心”毒素。自核心毒素區(qū)段至異源原毒素區(qū)段的過(guò)渡可以大致在毒素/原毒素連接處發(fā)生或者，在備選中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游發(fā)生向異源原毒素部分的過(guò)渡。舉例而言，本發(fā)明的一個(gè)嵌合毒素是CrylFa的完整核心毒素部分(氨基酸I至601)和異源原毒素(C端的氨基酸602)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。作為第二個(gè)實(shí)施例,本發(fā)明的第二嵌合毒素具有CrylDa的完整核心毒素部分(氨基酸I至619)和異源原毒素(C端的氨基酸620)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，Bt毒素(即使在某個(gè)種類諸如CrylF內(nèi))在長(zhǎng)度和核心毒素部分向原毒素部分過(guò)渡的精確位置上會(huì)以一定程度有所變化。通常，CrylDa和CrylFa毒素的長(zhǎng)度是約1150至約1200個(gè)氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的過(guò)渡通常會(huì)在全長(zhǎng)毒素的約50%-約60%發(fā)生。本發(fā)明的嵌合毒素會(huì)包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此,嵌合毒素會(huì)包含CrylFaBt毒素蛋白的全長(zhǎng)的至少約50%或CrylDaBt毒素蛋白的全長(zhǎng)的至少約50%。這通常會(huì)是至少約590個(gè)氨基酸。關(guān)于原毒素部分，整段的CrylAb原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端?；蚝投舅?。依照本發(fā)明有用的基因和毒素不僅包括公開(kāi)的全長(zhǎng)序列，而且還包括保留本文中明確例示的毒素的特征性殺蟲(chóng)(pesticidal)活性的這些序列、變體、突變體、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)基因的“變體”或“變異”指編碼相同毒素 或編碼具有殺蟲(chóng)活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“等同毒素”指與要求保護(hù)的毒素具有相同或基本上相同的針對(duì)靶害蟲(chóng)的生物學(xué)活性的毒素。如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, ^N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum 和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998)第 62 卷:807-813,邊界代表約 95% (CrylFa 和 IDa)、78%(CrylF和CrylD)、和45%(Cryl)序列同一性。這些截留也可以僅僅應(yīng)用于核心毒素(對(duì)于CrylF和CrylD毒素)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見(jiàn)的是，可以經(jīng)由幾種手段鑒定并獲得編碼活性毒素的基因?？梢宰员２赜谂囵B(yǎng)物保藏所的分離物獲得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通過(guò)使用基因合成儀以合成方式構(gòu)建這些基因或其部分或變體?？梢允褂糜糜谏牲c(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)容易地構(gòu)建基因的變異。還有，可以使用商品化的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶依照標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)程來(lái)生成這些基因的片段。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變自這些基因的末端系統(tǒng)性剪斷核苷酸。也可以使用多種限制酶來(lái)獲得編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌竵?lái)直接獲得這些蛋白質(zhì)毒素的活性片段。保留例示的毒素的殺蟲(chóng)活性的片段和等同物會(huì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還有，由于遺傳密碼的冗余，多種不同DNA序列可以編碼本文中公開(kāi)的氨基酸序列。完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)內(nèi)的是創(chuàng)建編碼相同的，或基本上相同的毒素的這些備選DNA序列。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響殺蟲(chóng)活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。編碼保留殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的基因的片段也包括在此定義中。用于鑒定依照本發(fā)明有用的編碼毒素的基因和基因部分的又一種方法是經(jīng)由使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測(cè)的核苷酸序列。這些序列憑借合適的標(biāo)記物可以是可檢出的或者可以以固有熒光生成，如記載于國(guó)際申請(qǐng)NO.W093/16094的。如本領(lǐng)域中公知的，若探針?lè)肿雍秃怂針悠吠ㄟ^(guò)形成兩種分子間強(qiáng)烈的鍵來(lái)雜交，則可以合理地假設(shè)探針和樣品具有實(shí)質(zhì)的同源性。優(yōu)選地，通過(guò)本領(lǐng)域中公知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，如記載于例如 Kel ler, G. H.，Μ. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y.,第169-170頁(yè)的。鹽濃度和溫度組合的一些例子如下(以嚴(yán)格性升高的次序)2X SSPE或SSC于室溫；IX SSPE 或 SSC 于 42° C ;(λ IX SSPE 或 SSC 于 42° C ;(λ IX SSPE 或 SSC 于 65° C。探針的檢測(cè)提供了一種用于以已知的方式測(cè)定雜交是否已經(jīng)發(fā)生的手段。此類探針?lè)治鎏峁┮环N用于鑒定本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。可以使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)程來(lái)合成依照本發(fā)明作為探針使用的核苷酸區(qū)段。也可以使用這些核苷酸序列作為PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。變體毒素。已經(jīng)在本文中明確例示本發(fā)明的某些毒素。因?yàn)檫@些毒素僅是本發(fā)明的毒素例示性的，所以應(yīng)當(dāng)容易顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明包括具有例示毒素的相同或相似殺蟲(chóng)活性的變體或等同毒素(和編碼等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素與例示的毒素會(huì)具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常會(huì)大于75%,優(yōu)選大于90%,且最優(yōu)選大于95%。氨基酸同源性在毒素中負(fù)責(zé)生物學(xué)活性或者牽涉決定最終負(fù)責(zé)生物學(xué)活性的三維構(gòu)型的至關(guān)重要的區(qū)域中會(huì)是最高的。在這點(diǎn)上，某些氨基酸取·代是可接受的，并且若這些取代在對(duì)于活性不是至關(guān)重要的區(qū)域中或者是不影響分子的三維構(gòu)型的保守氨基酸取代，則可以是預(yù)期的。例如，氨基酸可以放入以下種類非極性、不帶電荷的極性、堿性、和酸性。其中的一類氨基酸用相同類型的另一種氨基酸替換的保守取代落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要取代不實(shí)質(zhì)性改變化合物的生物學(xué)活性。下文是屬于每類的氨基酸的例子的列表。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含編碼CrylD殺蟲(chóng)蛋白的DNA和編碼CrylF殺蟲(chóng)蛋白的DNA。
2.權(quán)利要求I的植物的種子。
3.權(quán)利要求I的植物，其中編碼CrylD殺蟲(chóng)蛋白的DNA和編碼CrylF殺蟲(chóng)蛋白的DNA已經(jīng)漸滲入所述植物中。
4.權(quán)利要求3的植物的種子。
5.包含非Bt避難所植物和權(quán)利要求I的多個(gè)植物的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40%。
6.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30%。
7.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20%。
8.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10%。
9.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5% ο
10.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物在區(qū)組或條中(inblocksorstrips)。
11.種子混合物，其包含來(lái)自非Bt避難所植物的避難所種子和權(quán)利要求4的多個(gè)種子，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于40%。
12.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于 30%ο
13.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于 20%ο
14.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于 10% O
15.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于5% ο
16.—種管理昆蟲(chóng)形成對(duì)Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求5的植物田地。
17.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步包含編碼含有CrylAb核心毒素的蛋白質(zhì)的DNA。
18.包含非Bt避難所植物和權(quán)利要求17的多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的植物田地，其中所述避難所植物占(comprise)所述田地中的所有作物植物的小于約20%。
19.包含權(quán)利要求17的多個(gè)植物的植物田地，其中所述田地包含小于約10%避難所植物。
20.一種管理昆蟲(chóng)形成對(duì)Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求19的植物田地。
21.一種用于控制鱗翅目害蟲(chóng)的組合物，其包含表達(dá)有效量的含有CrylF核心毒素的蛋白質(zhì)和含有CrylD核心毒素的蛋白質(zhì)兩者的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的組合物，其包含經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)含有CrylF核心毒素的蛋白質(zhì)和含有CrylD核心毒素的蛋白質(zhì)兩者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞。
23.—種控制鱗翅目害蟲(chóng)的方法，包括對(duì)所述害蟲(chóng)或?qū)λ龊οx(chóng)的環(huán)境給予有效量的權(quán)利要求21的組合物。
24.一種轉(zhuǎn)基因植物，其生成對(duì)于相同靶昆蟲(chóng)而言殺蟲(chóng)性的三種殺蟲(chóng)性Cry蛋白，所述昆蟲(chóng)具有形成對(duì)任一種所述Cry蛋白的抗性的潛力，且其中每種所述Cry蛋白結(jié)合所述靶昆蟲(chóng)中的不同腸受體。
25.權(quán)利要求24的植物，其中所述昆蟲(chóng)是秋粘蟲(chóng)。
26.—種轉(zhuǎn)基因植物,其生成CrylFa蛋白加CrylDa蛋白加(plus)選自下組的第三種蛋白質(zhì)Vip3A、CrylC、CrylBeJP CrylE 蛋白。
27.—種管理昆蟲(chóng)形成對(duì)Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求26的植物田地。
28.包含非Bt避難所植物和權(quán)利要求26的多個(gè)植物的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于約10%。
29.權(quán)利要求28的田地，其中所述田地包含小于約5%避難所植物。
30.一種管理昆蟲(chóng)形成對(duì)Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求28或29的植物田地。
31.種子混合物，其包含來(lái)自非Bt避難所植物的避難所種子和來(lái)自權(quán)利要求26的植物的多個(gè)種子，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于10%。
32.權(quán)利要求5、18和28中任一項(xiàng)的田地，其中所述植物占據(jù)超過(guò)10英畝。
33.權(quán)利要求1、2、17、24、和26中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物選自下組玉米、大豆、和棉花。
34.權(quán)利要求1、2、17、24、和26中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物是玉米植物。
35.權(quán)利要求I、2、17、24、26、33、和34中任一項(xiàng)的植物的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞包含編碼所述CrylD殺蟲(chóng)蛋白的所述DNA和編碼所述CrylF殺蟲(chóng)蛋白的所述DNA,其中所述CrylF殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID NO: I是至少99%同一的，且所述CrylD殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID NO: 2是至少99%同一的。
36.權(quán)利要求1、2、17、24、26、33、和34中任一項(xiàng)的植物，其中所述CrylF殺蟲(chóng)蛋白包含SEQ ID NO: 1，且所述CrylD殺蟲(chóng)蛋白包含SEQ ID NO: 2。
全文摘要
本發(fā)明包括用于控制鱗翅目昆蟲(chóng)的方法和植物，所述植物包含組合的含有Cry1Fa和Cry1Da核心毒素的蛋白質(zhì)以延遲或預(yù)防昆蟲(chóng)抗性的形成。
文檔編號(hào)A01H1/00GK102843903SQ201080064010
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者T.米德, K.納瓦, N.P.斯托爾, J.J.希茨, A.T.伍斯利, S.L.伯頓 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司