專利名稱：用6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(pgl)來增加異戊二烯及其他產(chǎn)物的產(chǎn)量的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及用于增加大腸桿菌(E. coli)中生物化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)量的改良組合物和方法、以及用于增加大腸桿菌中異戊二烯產(chǎn)量的改良組合物和方法。
背景技術(shù)：
異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是廣泛應(yīng)用的重要有機化合物。例如，在合成 多種化學(xué)組合物和聚合物時，異戊二烯被用作中間材料或原料。異戊二烯還是通過許多植物和動物天然合成的重要生物材料。當(dāng)異戊二烯的立構(gòu)規(guī)整聚合在二十世紀(jì)六十年代早期進入市場時，異戊二烯成為用于合成順式-1，4-聚丁二烯的重要單體。通過這種立構(gòu)規(guī)整聚合所制備的順式-1，4-聚異戊二烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似于天然橡膠。盡管它與天然橡膠不完全相同，但它在許多應(yīng)用中可用作天然橡膠的替代品。例如，合成的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠被廣泛用于制備車輛輪胎和其他橡膠產(chǎn)品。對合成的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠的該需求消耗了大部分在世界市場上可獲得的異戊二烯。剩余的異戊二烯被用于制備其他合成橡膠、嵌段共聚物和其他化學(xué)產(chǎn)品。例如，異戊二烯被用于制備丁二烯-異戊二烯橡膠、苯乙烯-異戊二烯共聚物橡膠、苯乙烯-異戊二烯-丁二烯橡膠、苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物和苯乙烯-異戊二烯嵌段共聚物。在工業(yè)應(yīng)用中使用的異戊二烯通常作為石油或石腦油熱裂解的副產(chǎn)物而產(chǎn)生，或以其他方式從石化流體中提取。這是相對昂貴的能源密集型過程。世界范圍內(nèi)對基于石油化工的產(chǎn)品的需求持續(xù)增加，與此同時預(yù)計長期內(nèi)對異戊二烯的消耗將上升到高得多的水平，并且在任何情況下它的可獲得性受到限制。存在未來從基于石油化工來源的異戊二烯供應(yīng)將不足以滿足計劃的需求、且其價格將上升到前所未有的水平的擔(dān)憂。因此，存在從環(huán)境友好的、低成本、可再生資源中獲得異戊二烯來源的需求。本文所述的改良方法和組合物即提供異戊二烯的這種來源，其能夠以低成本從可再生資源中獲得。最近在由可再生來源產(chǎn)生異戊二烯方面取得了一些進展(參見例如國際專利申請公開No. WO 2009/076676A2)。這些產(chǎn)生異戊二烯的方法在速率、滴度和純度上可能足以符合對一個正常的商業(yè)方法的要求，然而需要改良方法以降低與源于生物來源的異戊二烯的生產(chǎn)相關(guān)的操作成本并增大異戊二烯的產(chǎn)量，例如用于增大異戊二烯和本文所提供的能夠具有生物活性的其他異源多肽的產(chǎn)量的改良組合物和方法。所有專利、專利申請、文檔、核苷酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫記錄號、以及本文中引用的文章均全文以引用方式并入本文中。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開用于增大異戊二烯產(chǎn)量的改良組合物和方法。本文還提供用于增大能夠具有生物活性的異源多肽產(chǎn)量的改良組合物和方法。本發(fā)明部分地基于觀察到將6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)染色體整合到缺乏編碼PGL多肽的核酸的大腸桿菌菌株內(nèi)會增大諸如異戊二烯或甲羥戊酸的不同種類產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，在一個方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞或其子代，該細(xì)胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞的滴度。在本文的任何方面，編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。在本文的任何方面，所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC。在本文的任何方面，編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整 合在所述大腸桿菌染色體中。在本文的任何方面，所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、gall^P galE。在本文的任何方面，編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝和編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。在本文的任何方面，(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自m0dF、m0dE、modA、modB和modC ;并且(C)所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面，編碼所述PGL多肽、半乳糖代謝多肽和鑰攝取多肽的核酸是如圖20所示的17，257堿基對片段的一部分。在本文的任何方面，所述重組細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的比產(chǎn)率高于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞。在本文的任何方面，所述重組細(xì)胞具有至少為15mg/0D/h的比產(chǎn)率。在本文的任何方面，編碼PGL多肽、鑰攝取多肽和/或半乳糖代謝多肽的核酸來自大腸桿菌菌株K12MG1655或所述大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在本文的任何方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在本文的任何方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在本文的任何方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。在本文的任何方面，所述重組大腸桿菌細(xì)胞還包含(C)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。在本文的任何方面，所述重組大腸桿菌細(xì)胞還包含(d)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。在本文的任何方面，所述MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在本文的任何方面，所述MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)；(iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在本文的任何方面，(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面，所述異戍二烯合酶多肽來自銀白楊(Populus alba)。本發(fā)明還提供產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含本文所述任何重組細(xì)胞的組合物，以及(b)產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，所述方法還包括回收所述異戊二烯。在其他方面，所述重組細(xì)胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。本發(fā)明還提供產(chǎn)生甲羥戊酸的方法，所述方法包括(a)在適于產(chǎn)生甲羥戊酸的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求15所述重組細(xì)胞的組合物，以及(b)產(chǎn)生甲羥戊酸。在一些方面，所述方法還包括回收所述甲羥戊酸。本發(fā)明還提供制備本文所述任何重組細(xì)胞的方法，包括(a)將編碼PGL多肽的異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸；(b)使所述編碼PGL多肽的核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(c)將編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸引入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還提供包含本文所述任何重組細(xì)胞的組合物。
在其他方面，本文提供不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能夠具有生物活性的異源多肽的核酸，并且其中當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生能夠具有生物活性的異源多肽的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。在一些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用0.1% (w/v)或更少的酵母提取物以及I % (w/V)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬(Pseudomonas)。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產(chǎn)率高于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，所述萜類化合物選自半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高級的多萜。在一些方面，所述半萜是異戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-I-醇)、異戊二烯醇(即，3-甲基-3- 丁烯-I-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、或異戊酸。在一些方面，所述單萜是香葉基焦磷酸、桉葉油素、檸檬烯、或菔烯。在一些方面，所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或紅沒藥醇。在一些方面，所述二萜是香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醛、葉綠醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面，所述三萜是角鯊烯或羊毛留醇。在一些方面，所述四萜是番茄紅素或胡蘿卜素。在一些方面，所述類胡蘿卜素選自葉黃素和胡蘿卜素。在一些方面，所述葉黃素為葉黃質(zhì)或玉米黃質(zhì)。在一些方面，所述胡蘿卜素是α-胡蘿卜素、β_胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、β_隱黃質(zhì)或番茄紅素。
在另一方面，本文提供不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，并且其中當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途 徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自⑴乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；( ) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬(Enterococcus)。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. I %(w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用0.1% (w/v)或更少的酵母提取物以及1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，所述細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且所述細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且所述細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自山葛(Pueraria montana)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然存在的多肽。在一些方面，所述細(xì)胞包含(i)包含葡萄糖異構(gòu)酶啟動子、編碼來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的MVA途徑下游的整合核酸以及編碼甲輕戍酸激酶(MVK)的核酸；編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的核酸；編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)的核酸；以及編碼異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)的核酸；(ii)編碼銀白楊(P. alba)異戊二烯合酶的核酸；(iii)編碼馬氏甲烷球菌(M. mazei)甲羥戊酸激酶的核酸；以及(iv)編碼來自糞腸球菌的MVA途徑上游的核酸，所述核酸包括編碼乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸；編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽的核酸 ；以及編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的核酸。在另一方面，本文提供產(chǎn)生能夠具有生物活性的異源多肽的改良方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸；以及(b)產(chǎn)生能夠具有生物活性的異源多肽，其中當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，細(xì)胞產(chǎn)生異源多肽的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，本方法還包括回收能夠具有生物活性的異源多肽的步驟。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. I %(w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用0.1% (w/v)或更少的酵母提取物以及1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，具有PGL活性的異源多肽來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性的異源多肽來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產(chǎn)率高于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，所述萜類化合物選自半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高級的多萜。在一些方面，所述半萜是異戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-I-醇)、異戊二烯醇(即，3-甲基-3- 丁烯-I-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、或異戊酸。在一些方面，所述單萜是香葉基焦磷酸、桉葉油素、檸檬烯、或菔烯。在一些方面，所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或紅沒藥醇。在一些方面，所述二萜是香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醛、葉綠醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面，所述三萜是角鯊烯或羊毛留醇。在一些方面，所述四萜是番茄紅素或胡蘿卜素。在一些方面，所述類胡蘿卜素選自葉黃素和胡蘿卜素。在一些方面，所述葉黃素為葉黃質(zhì)或玉米黃質(zhì)。在另一方面，本文提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細(xì)胞,其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸；以及(b)產(chǎn)生異戊二烯，其中當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞具有的異戊二烯比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，所述改良方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自⑴乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；( ) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK)；( )磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ； (iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲燒八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲燒八疊球菌。在一些方 面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. I % (w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物以及1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，所述細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且其中所述細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且其中所述細(xì)胞具有大于約25mg/Lss/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細(xì)胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自山葛的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然存在的多肽。在一些方面，所述細(xì)胞包含(i)包含葡萄糖異構(gòu)酶啟動子、編碼來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的MVA途徑下游的整合核酸以及編碼甲輕戍酸激酶(MVK)的核酸；編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的核酸；編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)的核酸；以及編碼異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)的核酸；(ii)編碼銀白楊異戊二烯合酶的核酸；(iii)編碼馬氏甲烷球菌甲羥戊酸激酶的核酸；以及(iv)編碼來自糞腸球菌的MVA途徑上游的核酸，所述核酸包括編碼乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸；編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽的核酸；以及編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的核酸。


圖IA顯不異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier et al. , Progressin Lipid Res. 44 :357-429, 2005 (F. Bouvier 等人，《脂類研究進展》，第 44 卷第 357-429頁，2005年))。以下說明包括途徑中每種多肽的別名以及公開對所示多肽的活性進行測量的檢測分析法的參考文獻。甲羥戊酸途徑=AACT ;乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，MvaE, EC2. 3. I. 9。檢測分析法J. Bacteriol. 184 :2116-2122,2002(《細(xì)菌學(xué)雜志》，第 184 卷第2116-2122頁，2002年)；HMGS ;羥甲基戊二酰輔酶A合酶，MvaS，EC 2.3.3.10。檢測分析法J. Bacteriol. 184 :4065-4070,2002(《細(xì)菌學(xué)雜志》，第 184 卷第 4065-4070 頁，2002年)；HMGR ;3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，MvaE, EC I. I. I. 34。檢測分析法 J. Bacteriol. 184 :2116-2122,2002(《細(xì)菌學(xué)雜志》，第 184 卷第 2116-2122 頁，2002 年)；MVK ;甲羥戊酸激酶，ERG12，EC 2. 7. I. 36。檢測分析法Curr Genet 19 :9-14,1991(《當(dāng)代遺傳學(xué)》，第19卷第9-14頁，1991年)。PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC 2. 7. 4. 2，檢測分析法Mol Cell Biol. 11 :620_631，1991 (《分子細(xì)胞生物學(xué)報》，第11卷第620-631頁，1991年)；DPMDC ;二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVD1，EC 4. I. I. 33。檢測分析法=Biochemistry 33 13355-13362，1994(《生物化學(xué)雜志》，第33卷第13355-13362頁，1994年)；IDI ;異戊烯二磷酸 δ 異構(gòu)酶，IDI1，EC5. 3. 3. 2。檢測分析法J. Biol. Chem. 264 :19169-19175，1989 (《生物化學(xué)雜志》，第264卷第19169-19175頁，1989年)。DXP途徑DXS ；1-脫氧-5-磷酸木酮糖合酶，dxs, EC 2. 2. I. 7ο檢測分析法PNAS 94 :12857_62，1997 (《美國國家科學(xué)院院刊》，第94卷第12857-62頁，1997年)；DXR ;1_脫氧-D-木酮糖_5_磷酸還原異構(gòu)酶，dxr, EC 2. 2. I. 7。檢測分析法Eur. J. Biochem. 269 :4446-4457,2002(《歐洲生物化學(xué)雜志》，第269卷第4446-4457頁，2002年)；MCT ;4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶，IspD, EC 2.7.7.60。檢測分析法PNAS 97 :6451-6456,2000(《美國國家科學(xué)院院刊》，第97卷第6451-6456頁，2000年);CMK ；4~ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇激酶，IspE, EC
2.7. I. 148。檢測分析法PNAS97 :1062-1067，2000 (《美國國家科學(xué)院院刊》，第97卷第1062-1067 頁，2000 年)；MCS ；2C-甲基-D-赤蘚醇 2，4-環(huán)二磷酸合酶，IspF，EC4. 6· I. 12。檢測分析法=PNAS 96 :11758-11763，1999(《美國國家科學(xué)院院刊》，第96卷第11758-11763頁，1999 年);HDS;1-羥基-2-甲基 _2_ (E) - 丁烯基-4-二磷酸合酶，IspG，EC 1.17.4.3。檢測分析法J. Org. Chem. 70 :9168_9174，2005 (《有機化學(xué)雜志》，第70卷第9168-9174頁，2005 年);HDR ;1_ 羥基-2-甲基-2-(E)_ 丁烯基-4-二磷酸還原酶，IspH，ECl. 17. I. 2。檢測分析法JACS，126 :12847-12855，2004(《美國化學(xué)會志》，第126卷第12847-12855頁，2004 年)。圖IB示出經(jīng)典的和改進的MVA途徑。1，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(AACT) ;2，HMG輔酶A合酶(HMGS) ;3，HMG輔酶A還原酶(HMGR) ;4，甲羥戊酸激酶(MVK) ;5，磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ;6，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD或DPMDC) ;7，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI) ;8，磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC) ;9，異戊烯基磷酸激酶(IPK)。經(jīng)典的MVA途徑通過反應(yīng)5和6來從反應(yīng)I進行到反應(yīng)7，而改進的MVA途徑經(jīng)過反應(yīng)8和9。在結(jié)構(gòu)式中的P和PP分別是憐酸根和焦憐酸根。該圖取自 Koga 和 Morii 的 Microbiology and Mol. Biology Reviews71 :97-120, 2007 (《微生物學(xué)與分子生物學(xué)評論》，第71卷第97-120頁，2007年)。改進的MVA途徑存在于例如一些古細(xì)菌有機體(例如馬氏甲烷八疊球菌)中。圖2 是質(zhì)粒 ρΕΤ24Ρ· alba HGS 的圖譜。圖3A-B是質(zhì)粒ρΕΤ24Ρ· alba HGS的核苷酸序列(序列標(biāo)識號I)。圖4是顯示用于內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL230和介于BspHI和NcoI位點之間的相容粘性末端的限制性位點的示意圖。圖5是質(zhì)粒EWL230的圖譜。
圖6A-B是質(zhì)粒EWL230的核苷酸序列(序列標(biāo)識號2)。圖7是顯示用于內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL244和介于NsiI和PstI位點之間的相容粘性末端的限制性位點的示意圖。圖8是質(zhì)粒EWL244的圖譜。圖9A-B是質(zhì)粒EWL244的核苷酸序列(序列標(biāo)識號3)。圖10A是馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細(xì)菌的下游操縱子的圖譜。圖10B-C是馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細(xì)菌下游操縱子的核苷酸序列(序列標(biāo)識號4)。圖IlA是來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細(xì)菌pET200D下游的MCM376-MVK的圖譜。圖IlB-C是來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細(xì)菌PET200D下游的MCM376-MVK的核苷酸序列(序列標(biāo)識號5)。圖12 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的圖譜。 圖13A-B是質(zhì)粒pBBRCMPGII. 5-pgl的核苷酸序列(序列標(biāo)識號6)。圖14A-F是通過大腸桿菌菌株來產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖，該大腸桿菌菌株表達馬氏產(chǎn)甲烷球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶、以及Pgl (RHM111608-2)，并且在15L規(guī)模的分批補料培養(yǎng)物中生長。圖14A顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的光密度的時間進程。圖14B顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。滴度定義為每升發(fā)酵肉湯所產(chǎn)生的異戊二烯的量。計算異戊二烯的方法在59小時內(nèi)累積產(chǎn)生的異戊二烯，g/在59小時時刻的發(fā)酵罐體積，L[ = ]g/L肉湯。圖14C也顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。計算異戊二烯的方法/ (異戍二烯的瞬時產(chǎn)率，g/L/h)dt (從t = O至59小時)[=]g/L肉湯。圖14D顯示由使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進程。圖14E顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的體積產(chǎn)率。圖14F顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的二氧化碳釋放率(CER)、或代謝活性分布。圖15A-B是顯示對15L生物反應(yīng)器中的發(fā)酵尾氣進行分析的曲線圖。樣品A是在64. 8小時取樣的菌株RM111608-2。樣品B是在34. 5小時取樣的菌株EWL256，該菌株為大腸桿菌 BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gil. 2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK。測得兩個樣品的氫在基線(0. 95Χ1(Γ8乇)以上。圖16Α顯示示例性的異戊二烯回收裝置。
圖16B顯示示例性的異戊二烯解吸/冷凝設(shè)置。圖17顯示異戊二烯產(chǎn)物的GC/FID色譜圖。測得材料的純度為99. 7%。圖18A-C顯示在(A)之前以及在使用氧化鋁⑶或二氧化硅(C)處理后的異戊二烯樣品的GC/FID色譜圖。異戊二烯峰未顯示在這些色譜圖中。圖19A顯示質(zhì)粒pDW34的圖譜，該質(zhì)粒pDW34在PTrc啟動子和馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK的控制下編碼銀白楊異戊二烯合酶的截短形式(MEA變體)。圖19B-D顯示質(zhì)粒pDW34的完整核苷酸序列(序列標(biāo)識號7)。圖20顯示大腸桿菌K12菌株MG1655在pgl基因座周圍的染色體結(jié)構(gòu)(該圖從www. ecocyc. com導(dǎo)入)。在括號中顯示與大腸桿菌K12MG655相比在大腸桿菌BL21 (DE3)中刪掉的區(qū)域，并且該區(qū)域在菌株CMP215和CMP258中恢復(fù)。用圓圈標(biāo)記ybgS基因的預(yù)測開 放閱讀框。正向箭頭(一)指示galMF引物的退火位點(序列標(biāo)識號8)。反向箭頭(一)指示galMR引物的退火位點(序列標(biāo)識號9)。圖21顯示使用PGL+(CMP312)和PGL_(CMP323)培養(yǎng)物進行的微型發(fā)酵實驗的光密度(OD)曲線圖。沿著X軸的黑色三角形指示進行離線取樣的時刻。其他OD值為內(nèi)插值。圖22顯示使用PGL+(CMP312)和PGL_(CMP323)培養(yǎng)物進行的微型發(fā)酵實驗的異戊二烯比產(chǎn)率曲線圖。沿著X軸的黑色三角形指示進行離線取樣的時刻。其他OD值為內(nèi)插值。圖23顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的光密度的時間進程。圖24顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。將異戊二烯滴度定義為每升發(fā)酵肉湯所產(chǎn)生的異戊二烯的量。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戍二烯的瞬時產(chǎn)率，g/L/h) dt (從t = O至t小時)[=]g/L肉湯。圖25顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進程。圖26顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯比產(chǎn)率。計算比產(chǎn)率水平的公式為:(mg異戊二烯t-mg異戊二烯J/[(0D550t*L肉湯t_0D550t()*L肉湯t0)/(2. 70D*L/g 細(xì)胞)]/(t-t0) [ = ]mg 異戍二烯 /g 細(xì)胞 /h。圖27顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的光密度的時間進程。Pgl+樣品是菌株CMP312的培養(yǎng)物。pgl-樣品是菌株CMP323的培養(yǎng)物。圖28顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。將滴度定義為每升發(fā)酵肉湯所產(chǎn)生的異戊二烯的量。pgl+樣品是菌株CMP312的培養(yǎng)物。Pgl-樣品是菌株CMP323的培養(yǎng)物。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戊二烯的瞬時產(chǎn)率，g/L/h) dt (從 t = O 至 20 小時)[=]g/L 肉湯。圖29顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯比產(chǎn)率。Pgl+樣品是菌株CMP312的培養(yǎng)物。pgl-樣品是菌株CMP323的培養(yǎng)物。計算比產(chǎn)率水平的公式為(mg 異戊二烯 t_mg 異戊二烯 J / [ (0D550t*L 肉湯 t_0D550t()*L 肉湯 J / (2. 70D*L/g 細(xì)胞)]/(t-t0) [ = ]mg 異戍二烯 /g 細(xì)胞 /h圖30顯示使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌K12菌株MG1655的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的光密度的時間進程。圖31顯示使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌K-12菌株MG1655的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。將滴度定義為每升發(fā)酵肉湯所產(chǎn)生的異戊二烯的量。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戊二烯的瞬時產(chǎn)率，g/L/h) dt (從t = O至t小時)[=]g/L肉湯。圖32顯示由使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌K-12菌株MG1655的15L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進程。圖33顯示使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌菌株K12MG1655的15L生物反應(yīng)器中異戊二烯比產(chǎn)率的時間進程。計算比產(chǎn)率的公式為(mg異戊二烯t_mg異戊二烯t。)/[(0D550t*L 肉湯 t-0D550tQ*L 肉湯 t0)/(2. 70D*L/g 細(xì)胞)]/ (t_t。) [ = ]mg 異戊二烯/g 細(xì)胞/h。圖34A顯示表達來自糞腸球菌的MVA途徑上游的多肽mvaE和mvaS的質(zhì)粒pDW15的圖譜。圖34B-D顯示質(zhì)粒pDW15的完整核苷酸序列(序列標(biāo)識號10)。圖35顯示包含O. I %酵母提取物和I %葡萄糖的TM3基本培養(yǎng)基中細(xì)菌菌株的 甲羥戊酸比產(chǎn)率。對獨特的菌落進行三重平行實驗。菌株在表29中有更詳細(xì)的描述。BL21+pCL pTrcUpper =菌株 MCM870 ；BL21pgl+pCL pTrcUpper =菌株 MCM874 ；BL21+pBBRpTrcUpper =菌株 MCM871 ；BL21pgl+pBBR pTrcUpper =菌株 MCM875 ；BL21+pTrcUpper =MCM872 ；BL21pgl+pTrcUpper = MCM876。圖36顯示在包含O. 02%酵母提取物和I %葡萄糖的TM3基本培養(yǎng)基中大腸桿菌菌株MCM872和MCM876的生長。圖37顯示在包含O. 02%酵母提取物和I %葡萄糖的TM3基本培養(yǎng)基中大腸桿菌菌株 MCM872(BL2IpTrc-Upper)和 MCM876 (BL21pgl pTrc-Upper)的甲羥戊酸產(chǎn)生速率。圖38顯示在兩個不同的時間點從具有O. 02%酵母提取物的TM3基本培養(yǎng)基中取出的大腸桿菌菌株 MCM872 (BL2IpTrc-Upper)和 MCM876 (BL21pgl pTrc-Upper)中的 MvaS蛋白濃度/OD。圖39顯示在具有O. 02%酵母提取物的TM3基本培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌菌株MCM872 (BL2 IpTrc-Upper)和 MCM876 (BL21pgl pTrc-Upper)中的 MvaE 濃度 /OD。圖40A顯示來自大腸桿菌K12MG1655的6_磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)的氨基酸序列(序列標(biāo)識號11)。圖40B顯示來自銅綠假單胞菌的PGL的氨基酸序列(序列標(biāo)識號
12)。圖40C顯示來自釀酒酵母的PGL的氨基酸序列(序列標(biāo)識號13)。圖40D顯示大腸桿菌PGL和銅綠假單胞菌PGL的氨基酸序列比對。相同的氨基酸以灰色突出顯示。保守性氨基酸取代以黑色突出顯示。圖41A-B顯示BL21 (Novagen)和標(biāo)記為BL21pgl的菌株CMP258 (實例6)的生長速率。所述生長在包含O. 4% (w/v)葡萄糖的M9基本培養(yǎng)基(6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4,O. 5g/L NaCl、O. 5g/L NH4Cl、(λ ImMCaCl2,2mM MgSO4)中評估。所述生長在 0D600 處測量。圖41A顯示BL21和菌株CMP258 (標(biāo)記為BL21pgl)的生長。圖41B顯示具有和不具有pgl的BL21的比生長速率(μ )。在BL21中恢復(fù)包含17，257bp缺失的pgl導(dǎo)致菌株具有約15%的比生長速率增長。圖42A顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。將異戊二烯滴度定義為每升發(fā)酵肉湯所產(chǎn)生的異戊二烯的量。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戍二烯的瞬時產(chǎn)率，g/L/h)dt (從t = O至t小時)[=]g/L肉湯。圖42B顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應(yīng)器內(nèi)的異戊二烯比產(chǎn)率。計算比產(chǎn)率水平的公式為(mg異戊二烯 t-mg 異戊二烯 J / [ (0D550t*L 肉湯 rOD550t()*L 肉湯 J / (2. 70D*L/g 細(xì)胞)]/大腸桿菌BL21和BL21 (DE3)被廣泛用作產(chǎn)生重組蛋白的宿主。它們也能用于產(chǎn)生其他產(chǎn)物，例如異戊二烯。通過增大戊糖磷酸途徑(對細(xì)胞生長很重要的代謝途徑)的活性可改善此類大腸桿菌菌株中重組蛋白、生物化學(xué)物質(zhì)和其他產(chǎn)物的收率 。使用億明達公司的基因組分析儀II (Illumina Genome Analyzer II (GA II))測序體 系，對由CodonGenomics公司(位于密蘇里州圣路易斯市(St. Louis, MO))制備的大腸桿菌BL2 1的基因序列和大腸桿菌MG1655 (GenBank登錄號U00096)的基因序列的比較顯示大腸桿菌BL21基因組在編碼利用半乳糖時所涉及的基因以及如本文中較為詳細(xì)地描述的其他基因的區(qū)域中攜帶17，257bp的缺失。出乎意料地，該缺失還涵蓋編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)(戍糖磷酸途徑中的第二種酶)的 ybhE 基因(Thomason, L. , Court, D. , Datta, A. , Khanna,R. and Rosner, J. , “Identification of the Escherichia coli K_12ybhE gene as pgl,encoding 6-phosphogluconolactonase, ’’J.Bact· 186 :8248-8253 (2004) (Thomason, L.、Court, D.、Datta, A. > Khanna, R.和Rosner, J., “將編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶的大腸桿菌K-12ybhE基因識別為pgl”，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第186卷第8248-8253頁，2004年))。該缺失通過對大腸桿菌BL21的親本菌株進行紫外線輻照來制備并通過Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞(StudierF. , Daegelen, P. , Lenski, R. , Maslov, S. , Kim, J. F. , “Understanding the differencesbetween genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 andBL21 (DE3)and comparison of the E. coli B and K_12genomes,，，J. Mol. Biol, published aheadof print Sept. 15, 2009 (Studier F.、Daegelen, P.、Lenski, R.、Maslov, S.、Kim, J. F.,“理解大腸桿菌B菌株REL606和BL21 (DE3)的基因組序列之間的差異并比較大腸桿菌B和K-12基因組”，《分子生物學(xué)雜志》，在2009年9月15日早于印刷版出版))。因此，大腸桿菌BL21和BL21 (DE3)不僅缺乏PGL活性，還缺乏利用半乳糖作為碳源的能力。(Aonet al. , “Suppressing posttranslational gluconoylation of heterologous proteinsby metabolic engineering of Escherichia coli,，，Appl. Environ. Microbiol. 74 :950-958(2008) (Aon等人，“通過大腸桿菌的代謝工程抑制異種蛋白的翻譯后葡萄糖酸化”，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》，第74卷第950-958頁，2008年))。此外，所述缺失還包含高親和力鑰酸鹽轉(zhuǎn)運所需的基因。盡管體內(nèi)僅需要痕量的鑰，但鑰在所有生物體的數(shù)種代謝途徑中扮演重要角色。鑰酸鹽在通過細(xì)菌進行的許多氧化/還原反應(yīng)中用作酶的輔因子、在氮代謝中起著關(guān)鍵作用，并且特別是在厭氧呼吸的情況下有助于產(chǎn)生能量。(參見例如Self et al.，Res Microbiol. 152 :311-321 (2001)(Self等人，《微生物學(xué)研究》,第152卷第311-321頁,2001年)；Grunden & Shanmugam,ArchMicrobiol. 168 :345-354 (1997) (Grunden 和 Shanmugam,《微生物學(xué)文獻集》，第 168 卷第 345-354 頁，1997 年))。在生長期間使用戊糖磷酸途徑(PPP)提供NADPH和戊糖(五碳糖)(Neidhart，F(xiàn). , Ingraham, J. , and Schaechter, Μ. , 1990, Physiology of the bacterial cell a molecular approach(Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA) (Neidhart, F.、Ingraham, J.和Schaechter,M. , 1990年,《細(xì)菌細(xì)胞生理學(xué)分子途徑》，由位于馬薩諸塞州桑德蘭的Sinauer Associates有限公司出版))。PPP具有兩個不同的階段(I)氧化階段，其中生成了 NADPH ;以及(2)非氧化階段，其中合成五碳糖。PPP是糖酵解的替代方式，并且雖然PPP不涉及葡萄糖的氧化，但其主要作用是合成代謝而非分解代謝。該途徑的主要結(jié)果是(1)生成在細(xì)胞內(nèi)的還原性生物合成反應(yīng)(諸如脂肪酸合成反應(yīng))中使用的NADPH形式的還原等價物；(2)產(chǎn)生在核苷酸和核酸的合成中使用的5-磷酸核糖(R5P);以及(3)產(chǎn)生在芳香族氨基酸的合成中使用的4-磷酸赤蘚糖(E4P)。芳香族氨基酸繼而是許多生物合成途徑的前體。源自核酸消化的膳食戊糖可通過戊糖磷酸途徑代謝，并且膳食碳水化合物的碳骨架可轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒饣蛱钱惿闹虚g體 。在哺乳動物體內(nèi)，PPP只在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，并且是身體產(chǎn)生具有還原力的分子的三種主要方式之一，人體中大約60%的NADPH通過其產(chǎn)生。在大腸桿菌BL21和BL21(DE3)菌株中修復(fù)PGL基因及其相關(guān)的表達控制序列傳達了可觀的生長收益，這是因為戊糖磷酸途徑提供了在細(xì)胞內(nèi)的還原性生物合成反應(yīng)(諸如脂肪酸合成反應(yīng))中使用的還原當(dāng)量、在核苷酸和核酸的合成中使用的5-磷酸核糖(R5P)、以及(3)在芳香族氨基酸的合成中使用的4-磷酸赤蘚糖(E4P)。此外，具有能夠利用半乳糖的同源菌株(如，大腸桿菌BL21或BL21(DE3)菌株)，從而可用碳源的范圍，這對于工業(yè)目的而言將是有用的。另外，編碼高親和力鑰酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的恢復(fù)基因?qū)⑻峁╊~外的生長收益，這是因為細(xì)胞將能夠在需要鑰作為輔因子的那些代謝反應(yīng)中更有效地利用鑰酸鹽。本發(fā)明涵蓋表達編碼整合到細(xì)菌染色體內(nèi)的PGL多肽的異源核酸的重組細(xì)菌細(xì)胞的改良方法和組合物。單獨的PGL整合或聯(lián)合編碼用于半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運的多肽的一種或多種其他異源核酸的PGL整合可改善重組細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的能力。因此，在一個方面，本發(fā)明涵蓋能夠產(chǎn)生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含(a)編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞的滴度。在一些情況下，重組大腸桿菌細(xì)胞能使用其自身的內(nèi)源性啟動子和/或其他調(diào)節(jié)體系來調(diào)節(jié)整合的PGL核酸的轉(zhuǎn)錄和隨后的表達。在這種情況下，異源核酸的表達(如，PGL或異戊二烯)不是被質(zhì)?；蛸|(zhì)粒上的因子驅(qū)動的組成型表達。在其他情況下，重組大腸桿菌細(xì)胞能使用已引入大腸桿菌細(xì)胞的啟動子和/或其他調(diào)節(jié)體系來調(diào)節(jié)整合的PGL核酸的轉(zhuǎn)錄和隨后的表達。本發(fā)明還涵蓋不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸。在一個方面，PGL多肽不通過質(zhì)粒上的核酸編碼。在一些方面，當(dāng)將所述大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生能具有生物活性的多肽的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。本文還提供產(chǎn)生能具有生物活性的異源多肽的改良方法，包括在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)不編碼PGL多肽的大腸桿菌細(xì)胞和產(chǎn)生異源多肽的步驟，其中所述細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸。在一些方面，當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異源多肽的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在另一方面，本文提供不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽、MVA途徑下游的多肽和/或異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，當(dāng)將所述大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞具有的異戊二烯比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的異戊二烯比產(chǎn)率。本發(fā)明還提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，包括在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)不編碼PGL多肽的大腸桿菌細(xì)胞和產(chǎn)生異戊二烯的步驟，其中所述細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽、MVA途徑下游的多肽或異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞具有的異戊二烯比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多 個拷貝的相同細(xì)胞的異戊二烯比產(chǎn)率。誦用摶術(shù)除非另外指明，否則對本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻中有完整解釋“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，secondedition(Sambrook et al. , 1989)(《分子克隆實驗手冊》第二版，Sambrook 等人，1989年)^iOligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed.，1984)(《寡核苷酸合成》，M. J. Gait編輯，1984 年);“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney，ed.，1987)(《動物細(xì)胞培養(yǎng)》，R. I. Freshney 編輯，1987 年);“Methods in Enzymology”(Academic Press, Inc.)(《酶學(xué)方法》，美國學(xué)術(shù)出版社)；uCurrent Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubelet al.，eds. , 1987, and periodic updates)(《分子生物學(xué)實驗室指南》，F(xiàn). M. Ausubel 等人編輯，1987年,周期性更新);“PCR :The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis et al.,eds. , 1994)(《聚合酶鏈反應(yīng)》，Mullis 等人編輯，1994 年)。Singleton et al. ,Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology 2nded. , J. ffiley&Sons(New York, N. Y. 1994)(Singleton等人，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》第二版，約翰·威利父子公司，紐約州
Organic Chemistry Reactions, Mechanisms andStructure 4th ed.，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992) (March,《高等有機化學(xué)反應(yīng)、機理和結(jié)構(gòu)》第4版，約翰 威利父子公司，紐約州紐約市，1992年)向本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供對本申請中使用的許多術(shù)語的一般性指導(dǎo)。定義術(shù)語“異戍_■稀”是指2-甲基-1，3_ 丁_■稀(CAS號78-79-5)。其可以是由3,3-二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)消除焦磷酸酯所得的直接和最終揮發(fā)性C5碳?xì)浠衔锂a(chǎn)物。其可不涉及將IPP分子鍵合或聚合至DMAPP分子。除非本文中另外指明，否則術(shù)語“異戊二烯”通常不旨在受其產(chǎn)生方法的限制。
如本文所用，術(shù)語“6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯”是指6-磷酸-D-葡萄糖酸-I，5-內(nèi)酯(CAS號2641-81-8)。如本文所用，術(shù)語“6-磷酸葡萄糖酸”是指6-磷酸-D-葡萄糖酸(CAS號 921-62-0)。如本文所用，術(shù)語“多肽”包括多肽、蛋白質(zhì)、肽、多肽的片段和融合多肽。如本文所用，“分離的多肽”不是多肽庫(諸如2種、5種、10種、20種、50種或更多種不同多肽的庫)的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼多肽的重組核酸的表達來獲得。分離的多肽可以為非天然存在的多肽。所謂“異源多肽”，是指通過源自與宿主細(xì)胞不同的有機體、菌種或菌株的核酸序列編碼的多肽。在一些方面，異源多肽不同于存在于自然界中的相同宿主細(xì)胞內(nèi)的野生型多肽。如本文所使用，“核酸”是指以單股或雙股形式共價連接在一起的兩個或更多個脫 氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。所謂“重組核酸”，是指目標(biāo)核酸由其而來的有機體的天然存在的基因組中目標(biāo)核酸的側(cè)面沒有一個或多個核酸(如，基因)的目標(biāo)核酸。因此，該術(shù)語包括(例如)整合到載體中、整合到自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《局小⒒蛘系皆松锘蛘婧松锏幕蚪MDNA中、或者獨立于其他序列作為單獨的分子(例如，cDNA、基因組DNA片段、或通過PCR或限制性內(nèi)切酶消化制備的cDNA片段)存在的重組DNA。在一些方面，重組核酸是編碼非天然存在的多肽的核酸。所謂“異源核酸”，是指源自與宿主細(xì)胞不同的有機體、菌種或菌株的核酸序列。在一些方面，異源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主細(xì)胞內(nèi)的野生型核酸。例如，從大腸桿菌K12菌株MG1655或其衍生物分離、通過Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)整合到大腸桿菌BL21 (DE3)的染色體內(nèi)并在細(xì)胞中表達的編碼PGL多肽的核酸為異源核酸。在一個方面，“異源核酸”可意味著將核酸引入不具有該核酸的宿主細(xì)胞中。在一些情況下，異源核酸可以為異源基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會知道不同之處，并因此還能夠使用所述教導(dǎo)的上下文。如本文所用，“表達控制序列”是指指導(dǎo)目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達控制序列可以為啟動子(例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子)或增強子。表達控制序列可以為“天然的”或異源的。天然表達控制序列源自與當(dāng)前表達的基因相同的有機體、菌種或菌株。異源表達控制序列源自與當(dāng)前表達的基因不同的有機體、菌種或菌株。“誘導(dǎo)型啟動子”是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動子。表達控制序列可操作地連接至待轉(zhuǎn)錄的核酸片段。如本文所用，術(shù)語“基本培養(yǎng)基”是指包含對細(xì)胞生長可能的最少營養(yǎng)物質(zhì)的生長培養(yǎng)基，其通常不存在氨基酸?；九囵B(yǎng)基通常包含(I)用于細(xì)菌生長的碳源；(2)各種鹽，其可根據(jù)細(xì)菌種類和生長條件而變化；以及(3)水。碳源可能有很大的差異，從簡單的糖類(諸如葡萄糖)到其他生物質(zhì)(諸如酵母提取物)的較為復(fù)雜的水解產(chǎn)物均可，如下文更為詳細(xì)的討論。鹽通常提供必需元素，例如鎂、氮、磷和硫，以使得細(xì)胞可合成蛋白質(zhì)和核酸。基本培養(yǎng)基還可補充以諸如抗生素等選擇性試劑，用于有選擇地維持某些質(zhì)粒等。例如，如果微生物對某種抗生素(例如氨芐青霉素或四環(huán)素)具有抗性，則可將該抗生素加入培養(yǎng)基以避免細(xì)胞在生長過程中缺乏抗性。如選擇期望的生理或生化特性所必需的，培養(yǎng)基可補充以其他化合物，例如特定的氨基酸等。
如本文所用，術(shù)語“萜類化合物”或“類異戊二烯”是指類似于萜烯的一大類各種各樣的天然存在的有機化學(xué)物質(zhì)。萜類化合物源自以多種方式組裝和修飾的五碳異戊二烯單元，并且以組成員中使用的異戊二烯單元的數(shù)目為基礎(chǔ)進行分類。半萜具有一個異戊二烯單元。單萜具有兩個異戊二烯單元。倍半萜具有三個異戊二烯單元。二萜具有四個異戊二烯單元。二倍半萜具有五個異戊二烯單元。三萜具有六個異戊二烯單元。四萜具有八個異戊二烯單元。多萜具有多于八個異戊二烯單元。如本文所用，術(shù)語“類胡蘿卜素”是指在植物、一些其他光合生物體(諸如藻類)的葉綠體和成色素細(xì)胞中、在一些類型的真菌中、以及在一些細(xì)菌中產(chǎn)生的一組天然存在的有機色素。類胡蘿卜素包括含氧的葉黃素和不含氧的胡蘿卜素。除非本文另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)“一個”、“一種”和“該”包括復(fù) 數(shù)含義。在本說明書通篇中給出的每一個上限值旨在包括每一個下限值，仿佛此類下限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個下限值將包括每一個上限值，仿佛此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數(shù)值范圍將包括落入此類較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一個較窄數(shù)值范圍，仿佛此類較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。修復(fù)至大腸桿菌B121或BL21(DE3)的編碼多肽的基因在大腸桿菌BL21和BL21(DE3)基因組中的17，257bp缺失包括yghE基因(PGL)、編碼利用半乳糖作為碳源時所涉及的蛋白質(zhì)的基因、編碼鑰轉(zhuǎn)運時所涉及的蛋白質(zhì)的基因，以及功能未知的幾種其他基因。參見(例如)圖20。利用半乳糖時所涉及的基因是編碼半乳糖-I-差向異構(gòu)酶的galM、編碼半乳糖激酶的galK、編碼半乳糖_1_磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的galT，以及編碼UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的galE。編碼鑰轉(zhuǎn)運時所涉及的蛋白質(zhì)的基因是編碼ABC超家族的融合鑰酸鹽轉(zhuǎn)運子亞基的modF、編碼用于鑰轉(zhuǎn)運的modABC操縱子的阻遏蛋白的modE,以及各自編碼鑰酸鹽轉(zhuǎn)運子亞基蛋白質(zhì)的modA、modB和modC。因此，可將細(xì)菌(如，大腸桿菌)細(xì)胞設(shè)計為在大腸桿菌染色體中整合編碼PGL多肽的核酸。引入編碼異戊二烯合酶(如，銀白楊異戊二烯合酶)的異源核酸可增大異戊二烯產(chǎn)生過程的總滴度和/或比活性。此外，除PGL整合之外，還可以將編碼利用半乳糖作為碳源時所涉及的蛋白質(zhì)或鑰轉(zhuǎn)運時所涉及的蛋白質(zhì)的一種或多種基因引入大腸桿菌細(xì)胞以增大重組細(xì)胞的綜合適應(yīng)度，這繼而可導(dǎo)致異戊二烯產(chǎn)量增大。可以設(shè)想的是，單獨整合的PGL或者與編碼利用半乳糖作為碳源時所涉及的蛋白質(zhì)或鑰轉(zhuǎn)運時所涉及的蛋白質(zhì)的一種或多種基因相結(jié)合而整合PGL的各種選擇均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和galM。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL和galK。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和galT。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和galE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM和galK。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM和galT。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM和galE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGUgalK和galT。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK和galE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT和galE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和galT。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和galE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT和galE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGUmodF和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、modF、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、modE、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL> modF、modE、modA、modB 和 modC。
在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGUgalM和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGUgalK和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galK和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21 或 BL21 (DE3)基因組的基因是 PGL、galE、modA、modB 和 modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galT和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galT和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galT、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galE和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galE和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galE、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galE和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galE和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是 PGL、galK、galE、modA、modB 和 modC。在一些方面，修復(fù)至 BL21 或 BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galT和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galT和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL> galE、galT、modA、modB 和 modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galT和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galT和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galT、modA、modB和mod C。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galE和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galE和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galE、modA、modB和modC。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galK、galT和modF。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galK、galT和modE。在一些方面，修復(fù)至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galK、galT、modA、modB 和 modC。在一些方面，將在17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝(除PGL外)修復(fù)至質(zhì)粒上的大腸桿菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面，將在17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝修復(fù)至組成型表達質(zhì)粒上的大腸桿菌BL21或BL21 (DE3)。在一些方面，將在17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝修復(fù)至誘導(dǎo)型質(zhì)粒上的大腸桿菌BL21或BL21 (DE3)。在一些方面，整個17，257bp基因組片段是被轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BL21或BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒。在一些方面，通過染色體整合將在所述17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝修復(fù)(如圖20中所示)至大腸桿菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面，通過染色體整合將整個17，257bp基因組片段修復(fù)至大腸桿菌BL21或BL21 (DE3)。示例件PGL多肽和核酸6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)將6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為6_磷酸葡萄糖酸。示例性PGL多肽包括具有PGL多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性PGL多肽和核酸包括具有PGL多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。突變型PGL多肽包括其中一種或多種氨基酸殘基經(jīng)氨基酸取代但仍保留PGL活性(SP，將6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸的能力)的那些。氨基酸取代可以為保守性或非保守性的，并且此類取代的氨基酸殘基可以被或可以不被遺傳密碼編碼。已經(jīng)基于氨基酸側(cè)鏈的相似性將標(biāo)準(zhǔn)的二十種氨基酸“字母表”劃分為各個化學(xué)家族。那些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支化側(cè)鏈的氨基酸(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?！氨Ｊ匦园被崛〈笔瞧渲邪被釟埢惶鎿Q為具有化學(xué)上相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，使用具有堿性側(cè)鏈的另一種氨基酸替換具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)的一種取代。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被替換為具有化學(xué)上不同的側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，使用具有芳香側(cè)鏈的另一種氨基酸替換具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)的一種取代。可在PGL多肽中引入氨基酸取代以改善分子的功能性。例如，可將增大PGL多肽對其基底的親和力、或改善其將6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸的能力的氨基酸取代引入到PGL多肽內(nèi)。在一些方面，突變型PGL多肽包含一種或多種保守性氨基酸取代。在一些方面，突變型PGL多肽包含一種或多種非保守性氨基酸取代?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法，諸如通過A. Sinha and P. K. Maitra, “ Induction of specificenzymes of the oxidative pentose phosphate pathway by glucono-delta—lactonein Saccharomyces cerevisiae,，，J. Gen. Microbiol. 138 :1865-1873 (1992) (A. Sinha 和p. K. Maitra，“通過釀酒酵母中的葡萄糖酸-δ -內(nèi)酯誘導(dǎo)特定酶的氧化戊糖磷酸途徑”，《普通微生物學(xué)雜志》，第138卷第1865-1873頁，1992年)所述的那些，通過測定多肽將NADP+還原至NADPH的能力來確定多肽是否具有PGL活性。在示例性檢測分析中，PGL活性通過如下方式測定預(yù)先溫育包含50 μ M葡萄糖-6-磷酸、O. 5mM NADP+、和溶于50mM MES緩沖液(pH = 6. 5)中的O. 5單位葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、25mM KClUOmM MgCl2的反應(yīng)混合物，直至反應(yīng)完成。隨后加入I單位的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，其導(dǎo)致熒光緩慢增加，這是因 為在較早的反應(yīng)中形成的內(nèi)酯自發(fā)地水解。接著，加入無細(xì)胞提取物，從而通過由PGL催化的內(nèi)酯酶反應(yīng)導(dǎo)致NADP+還原為NADPH的速率增大。通過從該最終速率中減去之前的空白速率來計算實際的內(nèi)酯酶速率。作為另外一種選擇，可通過核磁共振(NMR)光譜監(jiān)測6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯向6_ 憐酸葡萄糖酸的轉(zhuǎn)化。參見例如 E. Miclet et al. , “NMR Spectroscopic Analysis ofthe First Two Steps of the Pentose-Phosphate Pathway Elucidates the Role of6-Phosphogluconolactonase, ” J. Biol. Chem. 276 (37) :34840-34846 (2001) (Miclet 等人，“對戊糖磷酸途徑的前兩個步驟的核磁共振光譜分析闡明6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶的作用”，《生物化學(xué)雜志》，第276卷第37期第34840-34846頁，2001年)。示例性PGL核酸包括編碼具有PGL多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性PGL核酸包括(例如)從大腸桿菌K12MG1655或其衍生物(EcoGene登錄號EG13231 ；其為參考GenBank登錄號U0096的大腸桿菌K12MG1655基因序列的一部分；還可參見UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P52697 (PGL多肽))中分離的PGL (參見圖40A和序列標(biāo)識號11);從銅綠假單胞菌菌株P(guān)A01L(GenBank登錄號AE004091的基因座標(biāo)簽PA3182 ；還可參見GenBank登錄號AAG06570. I (PGL多肽))中分離的PGL(參見圖40B和序列標(biāo)識號12);以及從釀酒酵母(GenBank登錄號NC_001140的基因座標(biāo)簽YHR163W ;還可參見UNIProtKB/Swiss-Prot登錄號P38858 (PGL多肽))中分離的PGL (參見圖40C和序列標(biāo)識號
13)。其他示例性PGL核酸可從腸桿菌(Enterobacteriaceae)科的任何屬中分離,包括例如Alishewanella、交替球菌屬(Alterococcus)、Aquamonas、朽1 樣酸桿菌屬(Citrobacter)、克羅諾桿菌屬(Cronobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(如，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、泛菌屬(Pantoea)(如,朽1檬泛菌(Pantoea citroea))、變形桿菌屬(Proteus)(如,普通變形桿菌(Proteus vulgaris))、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)(如,粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens))、志賀氏菌屬(Shigella)、以及耶爾森菌屬(Yersinia)(如,鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis))。示例性半乳糖代謝多肽和核酸半乳糖-I-差向異構(gòu)酶(galM)催化β-D-半乳糖向a-D-半乳糖的轉(zhuǎn)化。示例性的半乳糖-I-差向異構(gòu)酶多肽包括具有半乳糖-I-差向異構(gòu)酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖-I-差向異構(gòu)酶多肽和核酸包括具有半乳糖-I-差向異構(gòu)酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。半乳糖激酶(galK)催化D-半乳糖向D-半乳糖_1_磷酸的磷酸化。示例性半乳糖激酶多肽包括具有半乳糖激酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖激酶多肽和核酸包括具有半乳糖激酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型 多肽和核酸。半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(galT)催化通過將UDP-葡萄糖和半乳糖_1_磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-I-磷酸和UDP-半乳糖的半乳糖代謝的Leloir途徑的第二步。示例性半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶多肽包括具有半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶多肽和核酸包括具有半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶(galE)催化UDP-半乳糖向UDP-葡萄糖的可逆轉(zhuǎn)化。示例性UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶多肽包括具有UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶多肽和核酸包括具有UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性半乳糖代謝核酸包括編碼具有半乳糖代謝多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性半乳糖代謝核酸包括(例如)從大腸桿菌K12MG1655或其衍生物中分離的半乳糖代謝基因；從銅綠假單胞菌菌株P(guān)AOl中分離的半乳糖代謝基因；以及從釀酒酵母中分離的半乳糖代謝基因。其他示例性的半乳糖代謝核酸可從腸桿菌科的任何屬中分離，包括例如Alishewanella、交替球菌屬、Aquamonas、朽1檬酸桿菌屬、克羅諾桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬(如，肺炎克雷伯氏菌)、泛菌屬(如，檸檬泛菌)、變形桿菌屬(如，普通變形桿菌)、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬(如，粘質(zhì)沙雷氏菌)、志賀氏菌屬、以及耶爾森菌屬(如，鼠疫耶爾森菌)。示例件鉬轉(zhuǎn)運子多肽和核酸由modF基因編碼的多肽是ABC超家族的融合鑰酸鹽轉(zhuǎn)運子亞基的非特征性成員。示例性的由modF編碼的多肽包括具有由modF編碼的多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modF編碼的多肽和核酸包括具有由modF編碼的多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。鑰轉(zhuǎn)運(modE)多肽的modABC操縱子的阻遏蛋白是調(diào)節(jié)蛋白，據(jù)信在存在鑰酸鹽的情況下，該調(diào)節(jié)蛋白反饋性抑制modABC操縱子的轉(zhuǎn)錄。示例性的由modE編碼的多肽包括具有由modE編碼的多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modE編碼的多肽和核酸包括具有由modE編碼的多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。通過modA、modB和modC編碼的高親和力三聚體鑰轉(zhuǎn)運子蛋白是用于將鑰攝取進入細(xì)胞的膜相關(guān)ABC型轉(zhuǎn)運子體系。當(dāng)modABC基因中的任何一者發(fā)生突變或缺失時，鑰酸鹽轉(zhuǎn)運通過ABC型硫酸鹽轉(zhuǎn)運體系或通過非特異性陰離子轉(zhuǎn)運子來完成，但效率低約100倍。(Self et al.，2001，Res. Microbiol. 152 :311-321 (Self 等人，2001 年，《微生物學(xué)研究》，第152卷第311-321頁))。示例性的由modABC編碼的多肽包括具有由modABC編碼的多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modABC編碼的多肽和核酸包括具有由modABC編碼的多肽的其中之一的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。
示例性的鑰轉(zhuǎn)運核酸包括編碼具有鑰轉(zhuǎn)運多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的鑰轉(zhuǎn)運核酸包括例如從大腸桿菌K12MG1655或其衍生物中分離的鑰轉(zhuǎn)運基因；從銅綠假單胞菌菌株P(guān)AOl中分離的鑰轉(zhuǎn)運基因；以及從釀酒酵母中分離的半乳糖代謝基因。其他示例性的鑰轉(zhuǎn)運核酸可從腸桿菌科的任何屬中分離，包括例如Alishewanella、交替球菌屬、Aquamonas、朽1檬酸桿菌屬、克羅諾桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬(如，肺炎克雷伯氏菌)、泛菌屬(如，檸檬泛菌)、變形桿菌屬(如，普通變形桿菌)、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬(如，粘質(zhì)沙雷氏菌)、志賀氏菌屬、以及耶爾森菌屬(如，鼠疫耶爾森菌)。示例件宿主細(xì)胞可使用大腸桿菌宿主細(xì)胞來表達本文所述方法中的異戊二烯合酶、PGL多肽、DXP途徑多肽、IDI和MVA途徑多肽。在一個方面，宿主細(xì)胞是能夠產(chǎn)生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞或其子代，所述細(xì)胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞的滴度。在一些方面，宿主細(xì)胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)胞還包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸。在一些方面，當(dāng)將所述細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異源多肽的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產(chǎn)率高于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，所述方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。在一些方面，宿主細(xì)胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)胞還包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，當(dāng)將所述細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，該細(xì)胞還包含MVA途徑多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)； (iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在一些方面，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細(xì)菌菌株屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面,所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。示例性細(xì)胞培養(yǎng)基如本文所用，術(shù)語“基本培養(yǎng)基”是指包含對細(xì)胞可能生長的最少營養(yǎng)物質(zhì)的生長培養(yǎng)基，其通常(但并非總是)不存在一種或多種氨基酸(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種氨基酸)?；九囵B(yǎng)基通常包含(I)用于細(xì)菌生長的碳源；(2)各種鹽，其可根據(jù)細(xì)菌種類和生長條件而變化；以及⑶/K。碳源可能有很大的差異，從簡單的糖類(諸如葡萄糖)到其他生物質(zhì)(諸如酵母提取物)的較為復(fù)雜的水解產(chǎn)物均可，如下文更為詳細(xì)的討論。鹽通常提供必需元素，例如鎂、氮、磷和硫，以使得細(xì)胞可合成蛋白質(zhì)和核酸?；九囵B(yǎng)基還可補充以諸如抗生素等選擇性試劑，用于有選擇地維持某些質(zhì)粒等。例如，如果微生物對某種抗生素(例如氨芐青霉素或四環(huán)素)具有抗性，則可將該抗生素加入培養(yǎng)基以避免細(xì)胞在生長過程中缺乏抗性。如選擇期望的生理或生化特性所必需的，培養(yǎng)基可補充以其他化合物，例如特定的氨基酸等?？墒褂萌魏位九囵B(yǎng)基配方來培養(yǎng)宿主細(xì)胞。示例性的基本培養(yǎng)基配方包括(例如)M9基本培養(yǎng)基和TM3基本培養(yǎng)基。每升的M9基本培養(yǎng)基包含(I) 200ml無菌M9鹽(每升有 64g Na2HP04-7H20、15g KH2PO4'2. 5g NaCl 和 5. Og NH4Cl) ； (2) 2ml 的 IM MgSO4 (無菌)；(3) 20ml的20% (w/v)葡萄糖(或其他碳源)；以及(4) 100 μ I的IM CaCl2 (無菌)。每升的 ΤΜ3 基本培養(yǎng)基包含(I) 13. 6g K2HPO4 ； (2) 13. 6g KH2PO4 ； (3) 2gMgS04*7H20 ； (4) 2g一水檸檬酸;(5)0. 3g檸檬酸鐵銨；(6) 3. 2g(NH4)2SO4 ； (7)0. 2g酵母提取物；以及(8) Iml的1000X痕量元素溶液；將pH調(diào)節(jié)到約6. 8，隨后將溶液過濾滅菌。每1000升中微量元素包含(l)40g—水檸檬酸；(2)30g MnSO4^H2O ； (3) IOg NaCl ; (4) Ig FeS04*7H20 ; (4) IgCoC12*6H20 ； (5) Ig ZnS04*7H20 ； (6) IOOmg CuS04*5H20 ； (7) IOOmg H3BO3 ；以及(8) IOOmgNaMo04*2H20 ;將 pH 調(diào)節(jié)至約 3· 0。任何碳源都可用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。術(shù)語“碳源”是指能夠被宿主細(xì)胞或生物體代謝的一種或多種含碳化合物。例如，用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基可包含任何適于維持生存能力或使宿主細(xì)胞生長的碳源。在一些方面，碳源是碳水化合物(例如單糖、二糖、低聚糖或多糖)、或轉(zhuǎn)化糖(如，通過酶促方法處理的蔗糖糖漿)。示例性的單糖包括葡萄糖和果糖；示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖，并且示例性的多糖包括淀粉和纖維素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(如，木糖或阿拉伯糖)。示例性細(xì)胞培養(yǎng)條件適于本發(fā)明的重組細(xì)胞的維持和生長的材料和方法在下文(如，在實例部分)中有所描述。適于細(xì)菌培養(yǎng)物的維持和生長的其他材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。示例性 的技術(shù)可在國際專利公開No. W02009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220、美國專利公開 2010/0003716、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtet al. , eds, American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994)(〈〈普通細(xì)菌學(xué)方法手冊》，Gerhardt等人編輯，美國微生物學(xué)會出版，華盛頓哥倫比亞特區(qū)，1994年)或 Brock 的 Biotechnology A Textbook of Industrial Microbiology, SecondEdition (1989) Sinauer Associates, Inc.，Sunderland, MA (工業(yè)微生物學(xué)教材《生物技術(shù)》，第二版(1989年)，由位于馬薩諸塞州桑德蘭的Sinauer Associates有限公司出版)中找到。在一些方面，所述細(xì)胞在容許通過插入宿主細(xì)胞的核酸編碼的一種或多種異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑多肽或MVA途徑多肽表達的條件下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件來培養(yǎng)細(xì)胞(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。在一些方面，細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟?、氣體混合物和PH下(例如在約20°C至約37°C、在約6%至約84%的CO2以及在介于約5至約9的pH下)生長并保持在所述條件下。在一些方面，細(xì)胞在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中于35°C下生長。在一些方面，發(fā)酵的pH范圍介于約pH 5. O至約pH 9. O之間(例如，約pH 6. O至約pH 8. O、或約pH 6. 5至約7. 0)。根據(jù)宿主細(xì)胞的需求，所述反應(yīng)可在有氧、缺氧或無氧條件下進行?？梢允褂玫臉?biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件和發(fā)酵方式(諸如分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵)在國際專利公開No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335,071 (美國專利公開No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、WO 2009/132220、美國專利公開No. 2010/0003716中有所描述。分批發(fā)酵和分批補料發(fā)酵是常見的，并且為本領(lǐng)域所熟知，其實例可在Brock的Biotechnology :ATextbook of IndustrialMicrobiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.(工業(yè)微生物學(xué)教材《生物技術(shù)》，第二版(1989年)，Sinauer Associates有限公司)中找到。在一些方面，細(xì)胞在葡萄糖受限制的條件下培養(yǎng)。所謂“葡萄糖受限制的條件”，是指加入的葡萄糖的量小于或為約105% (例如約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、
或10% )被細(xì)胞消耗的葡萄糖的量。在特定的方面，加入培養(yǎng)基的葡萄糖的量與在特定的時間內(nèi)細(xì)胞所消耗的葡萄糖的量大致相同。在一些方面，通過限制加入的葡萄糖的量來控制細(xì)胞生長的速率，使得細(xì)胞以能夠被細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖的量所支持的速率生長。在一些方面，葡萄糖沒有在培養(yǎng)細(xì)胞的時間內(nèi)積累。在各種方面，細(xì)胞在葡萄糖受限制的條件下培養(yǎng)超過或約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小時。在各種方面，細(xì)胞在葡萄糖受限制的條件下培養(yǎng)超過或約5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95或100%的細(xì)胞培養(yǎng)總時間長度。盡管無意于受任何具體理論的限制，但據(jù)信葡萄糖受限制的條件可更有利于對細(xì)胞進行管理。在一些方面，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一種或多種組分。在一些方面，酵母提取物的濃度是 O. I % (w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)酵母提取物。在一些方面，碳源不僅包括酵母提取物(或其一種或多種組分)，還包括另外的碳源(諸如葡萄糖)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在分批培養(yǎng)物中生長。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在分批補料培養(yǎng)物中生長。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)物中生長。在一些方面，大腸 桿菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基或TM3培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基。在一些方面,基本培養(yǎng)基是TM3培養(yǎng)基。在一些方面,使用1.0% (w/v)或更少的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面,使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2%(w/v)或0. 1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在某些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用O. 1% (w/v), O. 09% (w/v), O. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)、或0. 01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及0.1% (w/v)或更少來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2%(w/v)或 0. 1% (w/v)的葡萄糖和 0.1% (w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v)、0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。本發(fā)明涵蓋能夠產(chǎn)生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞，所述細(xì)胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在整合之前，大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞的該滴度。在一些方面，宿主細(xì)胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)胞還包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，宿主細(xì)胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽、由半乳糖代謝基因轉(zhuǎn)錄的多肽(例如，galM、galK、galT和galE)或由鑰酸鹽轉(zhuǎn)運基因轉(zhuǎn)錄的多肽(例如，modF、modE、modA、modB和modC)的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)胞還包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的一個或多個拷貝的異源核酸，以及編碼一種或多種鑰酸鹽轉(zhuǎn)運子多肽的一個或多個拷貝的異源核酸。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰酸鹽轉(zhuǎn)運多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面,所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大 腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細(xì)菌菌株屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用I. 0%(w/v)或更少的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面,使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或0. 1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在某些方面，使用0. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用O. 1% (w/v), O. 09% (w/v), O. 08% (w/v) ,0. 07%(w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05 % (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02 % (w/v)、或 0. 01 %(w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及O. I % (w/v)或更少來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或0. I % (w/v)的葡萄糖和 0.1% (w/v) >0. 09 % (w/v) >0. 08 % (w/v) >0. 07 % (w/v) >0. 06 %(w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基或TM3培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是TM3培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是TM3培養(yǎng)基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，該細(xì)胞還包含MVA途徑多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)；(iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。當(dāng)將本文所述的重組細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些情況下，編碼PGL多肽的異源基因是整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)的編碼PGL多肽的異源核酸。在一些方面，當(dāng)將所述細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰酸鹽轉(zhuǎn)運多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約5、6、7、8、9、10、11、12、13或14mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約20mg/Lsa/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞 具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在其他方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有約25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、或5mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率的上限。在其他方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有約 5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、*25mg/0D/h
的異戊二烯比產(chǎn)率的下限。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，多種質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些情況下，異戊二烯合酶多肽可以是內(nèi)源異戊二烯合酶的一個或多個拷貝。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自山葛的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然存在的多肽。可用于實踐本發(fā)明的其他異戊二烯合酶多肽或異戊二烯合酶變體包括但不限于如在WO 2009/132220或WO 2010/124146中所述的異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體(所述專利的內(nèi)容全文以引用方式 并入，特別是與異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體相關(guān)的內(nèi)容)。
_3] 增大異戊二烯產(chǎn)暈的方法生物反應(yīng)器中的遺傳工程細(xì)胞培養(yǎng)物更有效地產(chǎn)生異戊二烯，所述異戊二烯的量更大、純度更高和/或具有獨特的雜質(zhì)分布，由可再生資源產(chǎn)生商業(yè)用途量的異戊二烯的方法在例如國際專利申請公開No. W02009/076676A2、美國專利申請公開No. US2009/0203102A1, US2010/0003716A1, US2010/0048964A1, US2010/0086978A1,US2010/0167370A1、US2010/0113846A1、US2010/0184178A1、US2010/016737IAUUS2010/0196977A1、US2010/0196977A1、以及美國臨時專利申請 No. 61/187，930、61/187，941和61/187，959中進行描述和例證。本文還提供用于產(chǎn)生異戊二烯的改良方法。在一些方面，產(chǎn)生異戊二烯的改良方法包括(a)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生異戊二烯的包含大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞或其子代的組合物，所述細(xì)胞包含(i)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(ii)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(i)和(ii)的相同細(xì)胞的該滴度，以及(b)產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，產(chǎn)生異戊二烯的改良方法包括以下步驟(a)在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸；以及(b)產(chǎn)生異戊二烯，其中將所述大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞具有的異戊二烯比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，產(chǎn)生異戊二烯的改良方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面,產(chǎn)生異戍二烯的改良方法包括在適于產(chǎn)生異戍二烯的條件下培養(yǎng)本文所述的重組細(xì)胞以及使所述重組細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的步驟。在一些方面，產(chǎn)生異戊二烯的改良方法還包括回收異戊二烯的步驟。不受理論的約束，具有編碼PGL多肽的染色體整合的異源核酸的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度和比產(chǎn)率高于異源PGL核酸位于質(zhì)粒上的細(xì)胞的該滴度和比產(chǎn)率。出人意料地，包含染色體整合的PGL多肽的一個或多個拷貝、以及任選地具有通過染色體整合的半乳糖代謝基因(例如，galM、galK、galT和galE)編碼的一種或多種多肽的一個或多個拷貝、和/或通過染色體整合的鑰轉(zhuǎn)運基因(例如,1110(^、1]10(^、1]10(^、1]10(113和modC)編碼的一種或多種多肽的一個或多個拷貝的重組細(xì)胞傳達了可觀的細(xì)胞生長收益相比質(zhì)粒上包含異源PGL核酸的細(xì)胞，其產(chǎn)生滴度更高的異戊二烯、和/或比產(chǎn)量更高的異戊二烯。因此，在一個方面，產(chǎn)生異戊二烯的改良方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽、通過用于半乳糖代謝的基因(例如，galM、galK、galT和galE)編碼的一種或多種多肽和/或通過用于鑰轉(zhuǎn)運的基因n^l^n,modF、modE、modA、modB和modC)編碼的一種或多種多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述大腸桿菌細(xì)胞包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的染色體整合的異源基因的一個或多 個拷貝、編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運多肽的染色體整合的異源核酸的一個或多個拷貝；以及(b)產(chǎn)生異戊二烯，其中所述大腸桿菌細(xì)胞較之其中編碼PGL的異源基因位于質(zhì)粒上的相同細(xì)胞，具有更高的比生長速率、異戊二烯比產(chǎn)率、和/或產(chǎn)生的異戊二烯的滴度。在一些方面，該細(xì)胞還包含MVA途徑多肽。在這種情況下，本發(fā)明還設(shè)想了制備甲羥戊酸的組合物和方法。使用染色體整合的PGL宿主細(xì)胞體系來產(chǎn)生甲羥戊酸的方法可任選地包括回收甲羥戊酸。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自⑴乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；( ) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽是乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)。在一些方面，MVA途徑上游的多肽是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自細(xì)菌。在一些方面，細(xì)菌來自腸球菌屬。在一些方面，細(xì)菌來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK。在一些方面，所述MVK來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述甲烷八疊球菌是馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是PMK、MVD或IDI。在一些方面，PMK、MVD或IDI來自酵母屬(Saccharomyces)。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是PMK。在一些方面，PMK來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVD。在一些方面，MVD來自酵母屬。在一些方面,所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是IDI。在一些方面，MVA途徑下游的多肽來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，異戊二烯合酶多肽來自植物。在一些方面，該植物是野葛(kudzu)。在一些方面，該植物是楊樹(poplar)(銀白楊X歐洲山楊(tremula) CAC35696)。在一些方面，該植物是白楊(aspen)(美洲山楊(Populus tremuloides))。在一些方面，該植物是英國橡樹(歐洲櫟(Quercus robur))。在一個方面,該植物是銀白楊?？捎糜趯嵺`本發(fā)明的其他異戊二烯合酶多肽或異戊二烯合酶變體包括但不限于如在W02009/132220或WO2010/124146中所述的異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體(所述專利的內(nèi)容全文以引用方式并入，特別是與異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體相關(guān)的內(nèi)容)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的一個或多個拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，多種質(zhì)粒編 碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽為序列標(biāo)識號11。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標(biāo)識號11相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標(biāo)識號11相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽為序列標(biāo)識號12。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽與序列標(biāo)識號12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標(biāo)識號12相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽為序列標(biāo)識號13。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽與序列標(biāo)識號13相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株 MG1655 多肽與序列標(biāo)識號 13 相比具有 99 % ,98 % ,97 % ,96 % ,95 % ,95 % ,93 % ,92 %,91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面,所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株 BL21(DE3)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株B的大腸桿菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21的大腸桿菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21 (DE3)的大腸桿菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v)、0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2% (w/v)或0.1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在某些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用O. 1%(w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v),0. 03% (w/v),0. 02% (w/v)、或0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及O. 1% (w/v)或更少來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9 % (w/v) >0. 8 % (w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v)、0. 4% (w/v)、0. 3% (w/v)、0. 2% (w/v)或 0. I % (w/v)的葡萄糖和 0. I % (w/v)、0· 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v)、0. 02% (w/v)或0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基或TM3培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是TM3培養(yǎng)基。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約15mg/Lw/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，所述大腸桿菌細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約25mg/0D/h至約100mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細(xì)胞具有大于約15mg/0D/h至約100mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。本發(fā)明還提供已被工程化以產(chǎn)生異戊二烯的具有PGL整合的重組大腸桿菌細(xì)胞，由于它們具有提高的綜合適應(yīng)度，故也具有較佳的生長。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識到，生長速率增大可導(dǎo)致異戊二烯產(chǎn)量提高，例如更高的比活性、在一段時間內(nèi)產(chǎn)生更多的異戊 二烯、或更高的異戊二烯滴度。在一個方面，已被工程化以產(chǎn)生異戊二烯的具有PGL整合的重組大腸桿菌細(xì)胞同不具有PGL整合和/或如本文所述修復(fù)的17，257堿基對片段(參見例如圖20)的那些細(xì)胞相比具有至少10%增加的生長。在其他方面，已被工程化以產(chǎn)生異戊二烯的具有PGL整合的重組大腸桿菌細(xì)胞同不具有PGL整合和/或如本文所述修復(fù)的17，257堿基對片段的那些細(xì)胞相比具有至少約11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%^； 25%的生長。增大能夠具有生物活性的其他異源多肽產(chǎn)暈的方法本文還提供用于產(chǎn)生能夠具有生物活性的其他異源多肽或其他產(chǎn)物的改良方法。產(chǎn)物的一個非限制性例子是甲羥戊酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過以下步驟制備甲羥戊酸(a)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生異戊二烯的包含大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞或其子代的組合物，所述細(xì)胞包含(i)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；(ii)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；以及(iii) (c)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細(xì)胞在適于產(chǎn)生甲羥戊酸的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(i)和(ii)的相同細(xì)胞的該滴度，以及(b)產(chǎn)生甲羥戊酸。在一些方面，產(chǎn)生能具有生物活性的異源多肽的改良方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)胞，該細(xì)胞還包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸；以及(b)產(chǎn)生異源多肽，其中當(dāng)將所述大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生異源多肽的比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在一些方面，產(chǎn)生能夠具有生物活性的異源多肽的改良方法還包括回收多肽的步驟。在一些方面，不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面,所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株 BL21(DE3)。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽為序列標(biāo)識號11。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標(biāo)識號11相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標(biāo)識號11相比具有99%,98%,97%,96%,95%,95%,93%,92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽為序列標(biāo)識號12。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽與序列標(biāo)識號12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽與序列標(biāo)識號12相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽為序列標(biāo)識號13。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽與序列標(biāo)識號13相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株 MG1655 多肽與序列標(biāo)識號 13 相比具有 99 % ,98 % ,97 % ,96 % ,95 % ,95 % ,93 % ,92 %,91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株B的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21(DE3)的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或
0.1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在某些方面，使用0. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用O. 1% (w/v), O. 09% (w/v), O. 08% (w/v) ,0. 07%(w/v) >0. 06 % (w/v) >0. 05 % (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03 % (w/v) >0. 02% (w/v)、或 0. 01 %(w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及
O.I % (w/v)或更少來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或
0.I % (w/v)的葡萄糖和 0.1% (w/v) >0. 09 % (w/v) >0. 08 % (w/v) >0. 07 % (w/v) >0. 06 %(w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基或TM3培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是TM3培養(yǎng)基。本文還提供產(chǎn)生能夠具有生物活性的其他異源多肽的改良方法。在一些方面，產(chǎn)生能具有生物活性的異源多肽的改良方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的基因(例如，galM、galK、gall^PgalE)和/或編碼一種或多種鑰轉(zhuǎn)運子多肽的基因n^l^n,modF、modE、modA、modE^[ImodC)的大腸桿菌菌株的細(xì)胞，該細(xì)胞還包含使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能夠具有生物活性的異源多肽的核酸、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰轉(zhuǎn)運多肽的異源基因的一個或多個拷貝；以及(b)產(chǎn)生異源多肽，其中當(dāng)將所述大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞具有的異源多肽比產(chǎn)率大于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰轉(zhuǎn)運多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽 的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個 拷貝、和/或編碼一種或多種鑰轉(zhuǎn)運子多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在一些方面，產(chǎn)生能夠具有生物活性的異源多肽的改良方法還包括回收多肽的步驟。在一些方面，不編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝基因、和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運基因的大腸桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝基因、和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運基因的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝基因、和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運基因的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉(zhuǎn)運活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與天然的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉(zhuǎn)運活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與天然的大腸桿菌K12 菌株 MG1655 多肽相比具有 99%,98%,97%,96%,95%,95%,93%,92%,91%,90%,89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝多肽、和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉(zhuǎn)運活性的銅綠假單胞菌多肽與天然的銅綠假單胞菌多肽相比包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉(zhuǎn)運活性的銅綠假單胞菌多肽與天然的銅綠假單胞菌多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝多肽、和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運多肽的異源基因來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉(zhuǎn)運活性的釀酒酵母多肽與天然的釀酒酵母相比包含I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽與天然的釀酒酵母多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，不編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(PGL)多肽、一種或多種半乳糖代謝多肽、和/或一種或多種鑰轉(zhuǎn)運多肽的大腸桿菌菌株的 細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株B的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21(DE3)的細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2% (w/v)或 0.1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養(yǎng)基。在某些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用 0.1% (w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05%(w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)、或 0. 01 % (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及O. 1% (w/v)或更少來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2% (w/v)或 0.1% (w/v)的葡萄糖和 0.1%(w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v),0. 03% (w/v),0. 02% (w/v)或0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基或TM3培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基。在一些方面，基本培養(yǎng)基是TM3培養(yǎng)基。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當(dāng)將所述細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中時，所述細(xì)胞產(chǎn)生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產(chǎn)率高于缺乏使用一種或多種相關(guān)的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。在一些方面，所述方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。如本文所用，術(shù)語“萜類化合物”或“類異戊二烯”是指類似于萜烯的一大類各種各樣的天然存在的有機化學(xué)物質(zhì)。萜類化合物源自以多種方式組裝和修飾的五碳異戊二烯單元，并且以組成員中使用的異戊二烯單元的數(shù)目為基礎(chǔ)進行分類。半萜具有一個異戊二烯單元。單萜具有兩個異戊二烯單元。倍半萜具有三個異戊二烯單元。二萜具有四個異戊二烯單元。二倍半萜具有五個異戊二烯單元。三萜具有六個異戊二烯單元。四萜具有八個異戊二烯單元。多萜具有多于八個異戊二烯單元。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能識別能夠具有生物活性(如，能夠通過組裝適當(dāng)數(shù)量的異戊二烯單元并根據(jù)情況對它們進行修飾而制備各種類型的萜類化合物)的異源多肽。如本文所用，術(shù)語“類胡蘿卜素”是指在植物、一些其他光合生物體(諸如藻類)的葉綠體和成色素細(xì)胞中、在一些類型的真菌中、以及在一些細(xì)菌中產(chǎn)生的一組天然存在的有機色素。類胡蘿卜素包括含氧的葉黃素和不含氧的胡蘿卜素。
在一些方面,所述職類化合物選自半職、單職、倍半職、二職、二倍半職、三職、四職和更高級的多萜。在一些方面，所述半萜是異戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-I-醇)、異戊二烯醇(即，3-甲基-3- 丁烯-I-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、或異戊酸。在一些方面，所述單萜是香葉基焦磷酸、桉葉油素、檸檬烯、或菔烯。在一些方面，所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或紅沒藥醇。在一些方面，所述二萜是香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醛、葉綠醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面，所述三萜是角鯊烯或羊毛留醇。在一些方面，所述四萜是番茄紅素或胡蘿卜素。在一些方面，所述類胡蘿卜素選自葉黃素和胡蘿卜素。在一些方面，所述葉黃素為葉黃質(zhì)或玉米黃質(zhì)。在一些方面，所述胡蘿卜素是α-胡蘿卜素、β_胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、β_隱黃質(zhì)或番茄紅素。在一些方面，能具有生物活性的異源多肽的來源生物體是真菌。在一些方面，真菌是諸如米曲霉(A. oryzae)和黑曲霉(A. niger)的曲霉屬菌種、諸如釀酒酵母的酵母屬菌種、諸如裂殖酵母(S. pombe)的裂殖酵母屬菌種、或諸如瑞氏木霉(T. reesei)的木霉屬菌種。在一些方面，能具有生物活性的異源多肽的來源生物體是絲狀真菌細(xì)胞。在一些方面，所述絲狀真菌細(xì)胞來自長枝木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、綠色木霉(T. viride)、康氏木霉(T. koningii)、哈茨木霉(T. harzianum)、海泥青霉(Penicillium sp·)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(H. Ianuginose)、灰腐質(zhì)霉(H. grisea)、金孢 霉(Chrysosporium sp.)、C. lucknowense、粘帚霉(Gliocladium sp·),曲霉屬諸如米曲霉、黑曲霉、醬油曲霉(A. sojae)、日本曲霉(A. japonicus)、構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)或泡盛曲霉(A. awamori),鐮孢菌屬(Fusarium sp.)諸如粉紅鐮刀菌(F. roseum)、禾谷鐮刀菌(F. graminum)、F. cerealis、大豆根腐病菌(F. oxysporuim)或腐皮鐮刀菌(F. venenatum),鏈孢霉菌屬(Neurospora sp.)諸如粗糙鏈孢霉(N. crassa)、肉座菌屬(Hypocrea sp.)、毛霉屬(Mucor sp.)諸如米黑毛霉(M. miehei)、根霉屬菌(Rhizopus sp.)或泡波曲霉屬(Emericella sp.)。在一些方面，真菌是構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A. aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、瑞氏木霉、綠色木霉、尖鐮孢霉(F. oxysporum)或腐皮鐮孢霉(F. solani)。在一些方面,來源生物體是酵母,例如酵母屬(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces sp.)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)或假絲酵母屬(Candidasp.)。在一些方面，所述酵母屬是釀酒酵母。在一些方面，能具有生物活性的異源多肽的來源生物體是細(xì)菌。在一些方面，細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),諸如地衣芽孢桿菌(B. Iichenformis)或枯草芽孢桿菌(B. subtilis);泛菌屬，諸如朽1檬假交替單胞菌(P. citrea);假單胞菌屬，諸如產(chǎn)堿假單胞菌(P. alcaligenes)、惡臭假單胞菌(P. putida)或螢光假單胞菌(P. fluorescens);鏈霉菌屬(Streptomyces),諸如變鉛青鏈霉菌(S. Iividans)、天藍色鏈霉菌(S. coelicolor)、灰色鏈霉菌(S. griseus)或銹赤鏈霉菌(S. rubiginosus);棒狀桿菌屬(Corynebacterium),諸如谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum);紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas),諸如沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；或埃希氏菌屬(Escherichia),諸如大腸桿菌。在一些方面，細(xì)菌選自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)、嗜喊芽抱桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(B. amyIoIiquefaciens)、克勞氏芽抱桿菌(B. clausii)、耐喊芽抱桿菌(B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽抱桿菌(B. Iautus)和蘇云金芽抱桿菌(B. thuringiensis)。在一些方面，來源生物體是植物，例如來自豆科(Fabaceae)(諸如蝶形花亞科(Faboideae))的植物。在一些方面，來源生物體是野葛、楊樹(例如銀白楊或銀白楊x歐洲山楊CAC35696)、白楊(例如美洲山楊)或歐洲櫟。在一些方面，來源生物體是藻類，例如綠藻(green algae)、紅藻(red algae)、灰藻(glaucophytes)、chlorarachniophytes、眼蟲藻(euglenids)、假菌界(chromista)或溝鞭藻類(dinoflagellates)。在一些方面,來源生物體是藍細(xì)菌(cyanobacterium),例如基于形態(tài)歸類到以下任意組的藍細(xì)菌綠球藻目(Chlorococcales)、寬球藻目(Pleurocapsales)、_藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或多列藻目(Stigonematales)。由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯組合物由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯組合物有別于石油-異戊二烯組合物，這是因為 由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯是與其他生物副產(chǎn)物(源自生物來源和/或與伴隨異戊二烯一起獲得的生物過程相關(guān)的化合物)一起產(chǎn)生的，所述生物副產(chǎn)物諸如醇、醛、酮等在石油-異戊二烯組合物中不存在或以低得多的含量存在。所述生物副產(chǎn)物可包括但不限于乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯酮、2-甲基-2-乙烯基噁丙環(huán)、順式和反式3-甲基-1，3-戊二烯、C5異戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-I-醇或3-甲基_2_ 丁烯-I-醇)、2_庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、二乙酰、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、3-甲基-3- 丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2- 丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、檸檬烯、香葉醇(反式_3，7-二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E)_3，7_ 二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、或線性異戊二烯聚合物(例如源自多個異戊二烯單元的聚合反應(yīng)的線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體)。衍生自由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯的產(chǎn)物包含生物副產(chǎn)物或由任意所述副產(chǎn)物衍生的化合物中的一種或多種。此外，衍生自由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯的產(chǎn)物可包含在隨后的化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中由這些副產(chǎn)物所形成的化合物。此類化合物的例子包括衍生自親二烯體至異戊二烯的Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)、或異戊二烯的氧化的那些化合物。由可再生資源產(chǎn)生的、包含特定副產(chǎn)物或雜質(zhì)的異戊二烯組合物在美國臨時專利申請No. 61/187，959和WO 2010/14825中有更詳細(xì)地描述。通過將編碼異戊二烯合酶多肽(如，植物異戊二烯合酶多肽)、DXS多肽、其他DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸引入到細(xì)胞內(nèi)能大大地增加由細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的量，例如，如國際專利申請公開No. W02009/076676A2、美國專利申請No. 12/335，071、美國專利申請 No. 12/429，143、12/496，573、12/560，390、12/560，317、12/560，370、12/560，305 和 12/560，366，美國臨時專利申請 No. 61/187，930,61/187, 941,61/187, 959，以及美國專利公開No. 2010/0196977和WO 2010/078457中所述。示例性的異戊二烯合酶多肽(如，植物異戊二烯合酶多肽)、DXS、DXP途徑或MVA途徑多肽和核酸包括來自本文所述任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科，例如蝶形花亞科。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是來自以下植物的多肽或核酸山葛(野葛)(Sharkey et al. , Plant Physiology137 :700-712, 2005 (Sharkey 等人，《植物生理學(xué)》，第 137 卷第 700-712 頁，2005 年))、葛根(Pueraria Iobata)、楊樹(例如銀白楊、黑楊(Populus nigra)、毛果楊(Populustrichocarpa)、或銀白楊 X 歐洲山楊(CAC35696) (Miller et al. , Planta 213:483-487,2001 (Miller等人，《植物學(xué)》，第213卷第483-487頁，2001年))、白楊(例如美洲山楊)(Silver et al.，JBC270 (22) : 13010-1316，1995 (Silver 等人，《生物化學(xué)雜志》，第 270卷第22期第13010-1316頁，1995年))、或者英國橡樹(歐洲櫟)(Zimmer等人，WO 98/02550)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是天然存在的異戊二烯合酶多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是非天然存在的異戊二烯合酶多肽或核酸。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸以及測量異戊二烯合酶活性的方法在國際專利公開No. W02009/076676、 美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964,W02009/132220以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細(xì)地描述。示例件DXS多狀和核酸示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法(例如本文所述的那些)通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測量DXS活性的方法在國際專利公開 No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細(xì)地描述。示例件DXP涂徑多肽和核酸示例性DXP途徑多肽包括但不限于下列多肽中的任何一種DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽以及具有DXP途徑多肽的一種、兩種、或多種活性的多肽(如，融合多肽)。具體地講，DXP途徑多肽包括具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性DXP途徑核酸包括編碼具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途徑多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法(例如本文所述的那些)通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測量DXS活性的方法在國際專利公開 No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細(xì)地描述。具體地講，DXS多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1_脫氧-d_木酮糖-5-磷酸(DXP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。DXR多肽將I-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化DXP的能力來確定多肽是否具有DXR多肽活性。MCT多肽將2-C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)轉(zhuǎn)化為4_(胞苷_5 ' - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化MEP的能力來確定多肽是否具有MCT多肽活性。CMK多肽將4-(胞苷-5丨-二磷酸)-2_C_甲基-D-赤蘚醇(OTP-ME)轉(zhuǎn)化為2_ 二 磷酸4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(⑶P-MEP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化CDP-ME的能力來確定多肽是否具有CMK多肽活性。MCS多肽將2-磷酸-4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2_C_甲基-D-赤蘚醇(CDP-MEP)轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸(ME-CPP或cMEPP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化CDP-MEP的能力來確定多肽是否具有MCS多肽活性。HDS多肽將2-C-甲基_D_赤蘚醇_2，4_環(huán)二磷酸轉(zhuǎn)化為(E)_4_羥基_3_甲基丁 -2-烯-I-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化ME-CPP的能力來確定多肽是否具有HDS多肽活性。HDR多妝將(E) _4_輕基-3-甲基丁 -2-稀_1_基二憐酸轉(zhuǎn)化為異戍稀基二憐酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化HMBPP的能力來確定多肽是否具有HDR多肽活性。IDI多肽將異戊烯基二磷酸轉(zhuǎn)化為二甲基烯丙基二磷酸。可使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測定多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化異戊烯基二磷酸的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例件IDI多肽和核酸異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶多肽(異戊烯基二磷酸-δ -異構(gòu)酶或IDI)促成異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的互變(如，將IPP轉(zhuǎn)化為DMAPP和/或?qū)MAPP轉(zhuǎn)化為IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法(例如本文所述的那些)通過測量多肽在體外、細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)使IPP和DMAPP互變的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI多肽和核酸以及測量IDI活性的方法在國際專利公開No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964、W02009/132220以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細(xì)地描述。示例件MVA涂徑多肽和核酸示例性MVA途徑多肽包括乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC)多肽、異戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽，以及具有兩種或更多種MVA途徑多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具體地講，MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途徑多肽和核酸以及測量IDI活性的方法在國際專利公開 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細(xì)地描述。 在一些方面,所述細(xì)胞包含MVA途徑上游,所述MVA途徑上游包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶以及HMG-CoA還原酶核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含MVA途徑下游，所述MVA途徑下游包含MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含整個MVA途徑，所述整個MVA途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含整個MVA途徑，所述整個MVA途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA 還原酶、MVK、PMDC, IPK 和 IDI 核酸。本文所述的大腸桿菌細(xì)胞也可用于產(chǎn)生異戊二烯和副產(chǎn)物(諸如氫氣、乙醇、或丙二醇(如，1，2_丙二醇或1，3_丙二醇))的改良方法。示例性氫化酶多肽和核酸、與產(chǎn)生發(fā)酵副產(chǎn)物有關(guān)的基因的多肽和核酸、以及與氫氣再攝取相關(guān)的基因的多肽和核酸也可與本文所述的組合物和方法一起使用。這些多肽和核酸在美國專利公開No. 2010/0196977和W02010/078457中有所描述。公離核酸的示例性方法使用標(biāo)準(zhǔn)方法可分離異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸。從所關(guān)注的來源生物體(例如細(xì)菌基因組)中獲得期望的核酸的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域常見和眾所周知的(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括已知序列的PCR擴增、核酸的合成、基因組文庫的篩選、粘粒文庫的篩選，在國際專利公開No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公開 No. 2010/0003716 中有所描述。示例性的啟動子和載體本文所述的異戊二烯合酶、DXS、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸中的任一者能包含在一種或多種載體內(nèi)。因此，具有編碼本文所述的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子多肽、半乳糖代謝多肽和/或鑰轉(zhuǎn)運多肽中的任一者的一種或多種核酸的載體也描述在本文中。在一些方面，載體包含受表達控制序列控制的核酸。在一些方面，表達控制序列是天然的表達控制序列。在一些方面，表達控制序列是非天然的表達控制序列。在一些方面，載體包含選擇性標(biāo)記或可選擇標(biāo)記。在一些方面，異戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸整合到不具有可選擇標(biāo)記的細(xì)胞的染色體內(nèi)。在一些方面，異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、半乳糖代謝、和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸整合到具有可選擇標(biāo)記的細(xì)胞的染色體內(nèi)。
合適的載體是與所采用的宿主細(xì)胞相容的那些。合適的載體可源自例如細(xì)菌、病毒(例如源自噬菌體的抗菌素T7或M-13)、粘粒、酵母或植物。合適的載體可在宿主細(xì)胞中維持低、中或高拷貝數(shù)。獲得和使用這些載體的方案為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知(參見例如 Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold SpringHarbor, 1989 (Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》第2版，冷泉港實驗室出版社，1989年))。與本文所述的細(xì)胞和方法相容的合適的載體在國際專利公開No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964、W02009/132220以及美國專利公開No. 2010/0003716中有所描述。
啟動子為本領(lǐng)域所熟知。在宿主細(xì)胞中起作用的任何啟動子能用于表達宿主細(xì)胞中的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸。有多種用于驅(qū)動各種宿主細(xì)胞中的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸表達的初始控制區(qū)域或啟動子，并且這些為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。實際上，可使用能夠驅(qū)動這些核酸的任何啟動子，包括葡萄糖異構(gòu)酶啟動子(參見例如美國專利No. 7，132，527和其中所引用的參考文獻)。與本文所述的細(xì)胞和方法相容的合適的啟動子在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開No. US2009/0203102A1中有所描述。在一些方面，表達載體還包括終止序列。終止控制區(qū)域還可源自宿主細(xì)胞中天然存在的各種基因。在一些方面，終止序列和啟動子序列源自相同的源。與本文所述的細(xì)胞和方法相容的合適的終止序列在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開 No. US2009/0203102A1 中有所描述。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可將異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰核酸整合到載體(諸如表達載體)內(nèi)(Sambrooket al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1982(Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》，冷泉港實驗室出版社，1982年))。與本文所述的細(xì)胞和方法相容的合適的技術(shù)在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開No. US2009/0203102A1 中有所描述。在一些方面，以遠高于目前在天然存在的細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的水平過表達異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸可能是有利的。在一些方面，以遠低于目前在天然存在的細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的水平以受限方式表達(如，突變、失活、或缺失)異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子多肽、半乳糖代謝多肽和/或編碼鑰轉(zhuǎn)運多肽的核酸可能是有利的。與本文所述的細(xì)胞和方法相容的過表達或受限表達異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸的合適的方法在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開No. US2009/0203102A1中有所描述。示例件來源牛物體異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸(以及它們所編碼的多肽)能從天然包含異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸的任何生物體中獲得。如上所述，異戊二烯由多種生物體(例如細(xì)菌、酵母、植物和動物)天然地形成。生物體包含MVA途徑、DXP途徑、或MVA和DXP途徑兩者來產(chǎn)生異戊二烯(圖IA和1B)。因此，DXP途徑核酸能從例如包含DXP途徑或包含MVA和DXP途徑兩者的任何生物體中獲得。IDI和異戊二烯合酶核酸能從例如包含MVA途徑、DXP途徑、或MVA和DXP途徑兩者的任何生物體中獲得。MVA途徑核酸能從例如包含MVA途徑或包含MVA和DXP途徑兩者的任何生物體中獲得。氫化酶核酸能從例如使氫氧化或使氫離子還原的任何生物體中獲得。發(fā)酵副產(chǎn)物基因能從例如經(jīng)歷氧受限或厭氧呼吸(例如糖酵解)的任何生物體中獲得或識別。異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸的核酸序列能從細(xì)菌、真菌、植物、藻類或藍細(xì)菌中分離。示例性來源生物體包括例如酵母，例如酵母屬(如，釀酒酵母)；細(xì)菌，例如埃希氏菌屬(如，大腸桿菌)、或甲烷八疊球菌屬(如，馬氏甲烷八疊球菌)；植物，例如野葛或楊樹(如，銀白楊或銀白楊X歐洲山楊CAC35696)或白楊(如，美洲山楊)。示例性的宿主生物體在國際專利公開 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、 W02010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716 中有所描述。示例性轉(zhuǎn)化方法可使用用于將DNA構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如轉(zhuǎn)化、電穿孔、細(xì)胞核顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染(如，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染或DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、或者使用重組噬菌體病毒的轉(zhuǎn)染)、使用磷酸鈣-DNA沉淀進行孵育、使用包覆DNA的微粒進行高速轟擊、以及原生質(zhì)體融合，來將異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉(zhuǎn)錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉(zhuǎn)運核酸或含有它們的載體插入宿主細(xì)胞(如，本文所述的植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞)內(nèi)。常規(guī)的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如 Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds)Chapter 9,1987(《分子生物學(xué)實驗室指南》，F(xiàn). Μ· Ausubel等人編輯，第9章，1987年)；Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold SpringHarbor, 1989 (Sambrook等人,《分子克隆實驗指南》第2版,冷泉港實驗室出版社，1989年)；以及 Campbell et al.，Curr. Genet. 16 :53-56,1989 (Campbell 等人，《當(dāng)代遺傳學(xué)》，第 16卷第53-56頁，1989年))。引入的核酸可整合到染色體DNA內(nèi)，或維持為染色體外復(fù)制序列。轉(zhuǎn)化株可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法選擇。選擇轉(zhuǎn)化株的合適的方法在國際專利公開 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716 中有所描述。示例件純化方法在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收產(chǎn)生的化合物的步驟。在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面，通過吸收與汽提法來回收異戊二烯(參見例如美國臨時申請No. 61/288，142或美國專利申請No. 12/969,440)。在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收異源多肽的步驟。在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。合適的純化方法在美國專利申請公開US2010/0196977A1和美國臨時專利申請No. 61/187，959中有更詳細(xì)地描述。其他技術(shù)產(chǎn)生和回收異戊二烯與副產(chǎn)物(諸如氫氣)的有效方法的另外的實例在美國專利申請公開No. US2010/0196977中有所描述?？膳c本文所述的細(xì)胞和方法一起使用的其他技術(shù)的實例(如，從細(xì)胞生長培養(yǎng)物中分離產(chǎn)生的異戊二烯、在安全操作范圍內(nèi)產(chǎn)生異戊二烯的方法、在高異戊二烯滴度下的細(xì)胞活性、用于產(chǎn)生和回收異戊二烯和副產(chǎn)物(如，氫氣、乙醇或1，3_丙二醇)的有效方法)在國際專利公布No. W02009/076676A2，美國專利申請公開No. US2010/0048964A1、 US2010/0086978A1、US2010/0113846A1、US2010/0184178A1 和 US2010/0167371A1、US2010/0196977A1，美國臨時專利申請 No. 61/187，930,61/187, 959 和 61/187，941 以及國際專利申請公開No. W02004/033646A2以及WO 1996/035796A2中有所描述。通過參照以下實例能進一步理解本發(fā)明，這些實例以舉例說明的方式提供而非旨在進行限制。實M實例I :構(gòu)建表達釀酒酵母gil.2KKDyI操縱子、銀白楊異戊二烯合酶、馬氏產(chǎn)甲烷球菌甲羥戊酸激酶、PCL上游MVA(糞腸球菌mvaE和mvaS)以及ybhE (prI)的大腸桿菌菌株( )構(gòu)律菌株 EWL201 (BL21, Cm-GIl. 2~ΚΚΡνΙ)大腸桿菌BL21 (Novagen品牌，來自EMD生命科學(xué)有限公司(EMD Biosciences,Inc.))是受體菌株，使用MCM331P1溶菌產(chǎn)物(根據(jù)Ausubel等人在Current Protocolsin Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.(《分子生物學(xué)實驗室指南》，約翰·威利父子出版公司)中所述的方法制備的溶菌產(chǎn)物)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MCM331細(xì)胞包含編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、以及IPP異構(gòu)酶的染色體構(gòu)建體gil. 2KKDyI( S卩，來自釀酒酵母的gil. 2-KKDyI操縱子；其構(gòu)建在國際專利公開No. WO 2009/076676A2的實例10和美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開No. 2009/0203102)中有所描述)。將細(xì)胞鋪展到L瓊脂和20 μ g/ μ I氯霉素上，對轉(zhuǎn)導(dǎo)子進行選擇。將平板在30°C下溫育過夜。對轉(zhuǎn)導(dǎo)子的分析顯示在對照平板(用于回復(fù)突變的水+細(xì)胞對照平板，以及用于溶菌產(chǎn)物污染的水+Pl溶菌產(chǎn)物對照平板)上沒有菌落。挑選四種轉(zhuǎn)導(dǎo)子并用于接種5ml L-肉湯和20 μ g/μ I氯霉素。在30°C和200rpm的振蕩下使培養(yǎng)物生長過夜。對I. 5mL的過夜細(xì)胞培養(yǎng)物進行離心，以獲得用于PCR分析的各種轉(zhuǎn)導(dǎo)子的基因組DNA制備物。將細(xì)胞沉淀置于400 μ I重懸緩沖液(20mMTrisUmM EDTA、50mM NaCl, pH7. 5)中重新懸浮，并加入不含DNase (脫氧核糖核酸酶)的4μ1 RNase(核糖核酸酶)(來自羅氏公司(Roche))。將管在37°C下溫育30分鐘，隨后加入4μ1 10% SDS和4μ I 10mg/ml的蛋白酶K儲備液(來自西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))。將管在37°C下溫育I小時。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至2ml Phase LockLight Gel管(來自艾本德公司(Eppendorf))中，隨后分別加入200 μ I的pH 7. 9飽和酚(來自Ambion有限公司)和氯仿。將各管充分混勻并微量離心5分鐘。使用400 μ I氯仿進行第二次萃取，并將水層轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中。通過加入Iml的100%乙醇并離心5分鐘來使基因組DNA沉淀。使用Iml 70%乙醇來洗滌基因組DNA沉淀。移除乙醇，然后使基因組DNA沉淀短暫風(fēng)干。使用200 μ I TE將基因組DNA沉淀重新懸浮。使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(來自Stratagene公司)和200ng/ μ I的基因組DNA作為模板，根據(jù)制造商的方案制備兩組不同的PCR反應(yīng)管。對于第I組，使用引物MCMl30和GB Cm-Rev (表I)確保轉(zhuǎn)導(dǎo)子被成功整合進attTn7基因座。第I組的PCR參數(shù)為95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))、95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下25秒(重復(fù)步驟2到4，循環(huán)28次)、72°C下I分鐘。對于第2組，使用引物MVD For和MVD Rev (表I)確保gil. 2-KKDyI操縱子被恰當(dāng)?shù)卣?。?組的PCR參數(shù)為95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))、95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下10秒(重復(fù)步驟2到4，循環(huán)28次)、72°C下I分鐘。對I. 2% E-凝膠(來自英杰公司(Invitrogen Corp.))上的PCR擴增子的分析顯示全部4種轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆均是恰當(dāng)?shù)?。挑選一個菌落并命名為菌株EWL201。(ii)構(gòu)律菌株 EWL204(BL21,環(huán)Hi GIl. 2~ΚΚΡνΙ)
使用質(zhì)粒pCP20將氯霉素標(biāo)記從菌株EWL201中環(huán)出，如Datsenko和Wanner (2000年)(Datsenko et al. , Proc Natl. Acad. Sci USA 97 :6640-6645, 2000 (Datsenko 等人，《美國國家科學(xué)院院刊》，第97卷第6640-6645頁，2000年))所述。使EWL201細(xì)胞在L-肉湯中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50μ I細(xì)胞懸液的等分試樣與
Iμ I的pCP20混合，然后將細(xì)胞懸液混合物置于2mm比色皿(來自英杰公司)中使用GenePulser電穿孔儀(來自伯樂有限公司(Bio-Rad Inc.))在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管(來自莎斯特公司(Sarstedt))中。通過使細(xì)胞在30°C下生長I小時而使其恢復(fù)。在L瓊脂和20 μ g/μ I氯霉素以及50 μ g/ μ I羧芐青霉素上挑選轉(zhuǎn)化株，并且在30°C下溫育過夜。次日，使單克隆在IOml L-肉湯和50 μ g/ μ I羧芐青霉素中于30°C下生長直至對數(shù)早期。然后使生長的培養(yǎng)物的溫度變?yōu)?2°C并維持2小時。進行連續(xù)稀釋，然后將細(xì)胞鋪展到LA平板上(無抗生素選擇性)，并在30°C下溫育過夜。次日，挑選20個菌落，并影印到L瓊脂(無抗生素)和LA與20 μ g/μ I氯霉素平板上。然后將平板在30°C下溫育過夜。能夠在LA平板而非LA與20 μ g/μ I氯霉素平板上生長的細(xì)胞被認(rèn)為其氯霉素標(biāo)記被環(huán)出(挑出一個并命名為菌株 EWL204)。(iii)構(gòu)建質(zhì)粒 pEWL230 (pTrc P. alba)將編碼銀白楊異戊二烯合酶(P. alba HGS)的合成基因的生成外包給位于加利福尼亞州門洛帕克市(Menlo Park, CA)的DNA2. O公司，因為該公司擁有大腸桿菌表達的密碼子優(yōu)化方法。將所述合成基因定制克隆為質(zhì)粒pET24a (Novagen品牌，來自EMD生命科學(xué)有限公司)，并以凍干形式遞送(圖2、3A-B ;序列標(biāo)識號I)。根據(jù)制造商的方案使用pET24P. alba HGS作為模板、引物MCM182和MCM192、以及Herculase II融合型DNA聚合酶(來自Stratagene公司)來進行PCR反應(yīng),從而擴增銀白楊異戊二烯合酶(P. alba HGS)基因。PCR條件如下95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))、95°C下25秒、55°C下20秒、72°C下I分鐘，重復(fù)這樣的循環(huán)25次，最后在72°C下延伸3分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(來自凱杰公司(Qiagen Inc.))對銀白楊異戍二烯合酶PCR產(chǎn)物進行純化。
銀白楊異戊二烯合酶PCR產(chǎn)物然后在包含1μ I BspHI核酸內(nèi)切酶(來自紐英倫生物技術(shù)公司(New England Biolabs))和2μ I IOXNEB緩沖液4的20 μ I反應(yīng)物中進行消化。將該反應(yīng)物在37°C下溫育2小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在包含Iyl PstI核酸內(nèi)切酶(來自羅氏公司)和2μ I IOX緩沖液H的20 μ I反應(yīng)物中進行第二次限制酶切消化。將該反應(yīng)在37°C下溫育2小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。質(zhì)粒pTrcHis2B (來自英杰公司)在包含Iyl NcoI核酸內(nèi)切酶(來自羅氏公司)、1 μ I PstI核酸內(nèi)切酶和2μ IlOX緩沖液H的20 μ I反應(yīng)物中進行消化。將反應(yīng)在37°C下溫育2小時。已消化的pTrcHis2B載體使用I. 2% E-凝膠(來自英杰公司)來凝膠純化，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒(來自凱杰公司)進行提取(圖4)。使用BspHI和NcoI位點的相容粘性末端，制備包含5 μ I銀白楊異戍二烯合酶插入子、2 μ I 1'1^載體、]^1 T4DNA連接酶(來自紐英倫生物技術(shù)公司)、
2μ I IOX連接酶緩沖液和10 μ I ddH20的20 μ I連接反應(yīng)物。將連接混合物在室溫下溫育40分鐘。通過在ddH20的有蓋培養(yǎng)皿中懸浮O. 025 μ m硝化纖維膜過濾膜(來自密理博公司(Millipore))并在室溫下將連接混合物輕輕地施加到硝化纖維膜過濾膜之上30分鐘 來對連接混合物進行脫鹽。使MCM446細(xì)胞在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細(xì)胞懸液的等分試樣與5 μ I的脫鹽pTrc P. alba HGS連接混合物混合。將細(xì)胞懸液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管(來自莎斯特公司)中。通過使細(xì)胞在30°C下生長2小時而使其恢復(fù)。在L瓊脂和SOyg/yl羧芐青霉素以及IOmM甲羥戊酸上挑選轉(zhuǎn)化株，并在30°C下溫育。次日，挑選6個轉(zhuǎn)化株，并使其在5ml L-肉湯和50 μ g/μ I羧芐青霉素的管中于30°C下生長過夜。使用QIAquickSpin Minipr印試劑盒(來自凱杰公司)對過夜的培養(yǎng)物進行質(zhì)粒提取。由于使用了 BL21細(xì)胞來繁殖質(zhì)粒，所以將使用PB緩沖液5X和PE緩沖液3X來洗滌吸附柱的修改形式并入標(biāo)準(zhǔn)制造商方案以便得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。使用在20 μ I反應(yīng)物中的PstI來消化質(zhì)粒以確保線性片段的尺寸正確。全部6種質(zhì)粒均為正確的尺寸，將其裝運至位于加里福利亞州伯克利市的昆塔納生物科學(xué)公司(Quintara Biosciences (Berkeley, CA)),以便使用弓丨物MCM65、MCM66、EL1000 (表I)進行測序。DNA測序結(jié)果顯示全部6種質(zhì)粒均是正確的。挑出一種質(zhì)粒并命名為質(zhì)粒EWL230(圖5、6A-B ;序列標(biāo)識號2)。iv)構(gòu)建質(zhì)粒 pEWL244 (pTrc P. alba~mMVK)根據(jù)制造商的方案使用MCM376作為模板、引物MCM165和MCM177(參見表I)以及Pfu Ultra II融合型DNA聚合酶(來自Stratagene公司)來進行PCR反應(yīng),從而擴增馬氏甲烷八疊球菌(M.mazei)MVK基因。PCR條件如下95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))、95 0C下25秒、55 °C下25秒、72 °C下18秒，重復(fù)28次循環(huán)，最后在72 °C下延伸I分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(來自凱杰公司)來純化馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK PCR產(chǎn)物。馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK PCR產(chǎn)物然后在包含8μ I PCR產(chǎn)物、2 μ I PmeI核酸內(nèi)切酶(來自紐英倫生物技術(shù)公司)、4 μ I 10ΧΝΕΒ緩沖液4、4 μ 110 XNEB BSA以及22 μ I ddH20的40 μ I反應(yīng)物中進行消化。將該反應(yīng)物在37°C下溫育3小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在包含2μ1 NsiI核酸內(nèi)切酶(來自羅氏公司)、4. 7μ I IOX緩沖液H以及40 μ I經(jīng)PmeI消化的馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK片段的47 μ I反應(yīng)物中進行第二次限制酶切消化。將該反應(yīng)物在37°C下溫育3小時。已消化的PCR片段然后使用I. 2% E-凝膠來凝膠純化，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行提取。質(zhì)粒EWL230在包含 ΙΟμΙ 質(zhì)粒、2μ1 PmeI 核酸內(nèi)切酶、4μ I 10 XNEB 緩沖液 4、4 μ I 10ΧΝΕΒ BSA 和 20μ1ddH20的40μ I反應(yīng)物中進行消化。將該反應(yīng)在37°C下溫育3小時。然后使用QIAquickPCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在包含2μ I PstI核酸內(nèi)切酶、4. 7μ I IOX緩沖液H以及40 μ I經(jīng)PmeI消化的EWL230線性片段的47 μ I反應(yīng)物中進行第二次限制酶切消化。將反應(yīng)在37°C下溫育3小時。已消化的PCR片段然后使用I. 2% E-凝膠來凝膠純化，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行提取(圖7)。使用NsiI和PstI位點的相容粘性末端，制備包含8μ I馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK插入子、3 μ I EWL230 質(zhì)粒、lμl T4DNA連接酶、 2μ I IOX連接酶緩沖液和6 μ I ddH20的20 μ I連接反應(yīng)物。將連接混合物在16°C下溫育過夜。次日，通過在ddH20的有蓋培養(yǎng)皿中懸浮O. 025 μ m硝化纖維膜過濾膜并在室溫下將連接混合物輕輕地施加到硝化纖維膜過濾膜之上30分鐘來對連接混合物進行脫鹽。使MCM446細(xì)胞在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細(xì)胞懸液的等分試樣與5 μ I的脫鹽pTrc P. alba_mMVK連接混合物混合。將細(xì)胞懸液混合物置于2_比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細(xì)胞，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細(xì)胞在30°C下生長2小時而使其恢復(fù)。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及5mM甲羥戊酸平板上選擇轉(zhuǎn)化株，并在30°C下溫育。次日，挑選6個轉(zhuǎn)化株，并使其在5ml LB和50 μ g/ μ I羧芐青霉素的管中于30°C下生長過夜。使用QIAquick Spin Miniprep試劑盒對過夜的培養(yǎng)物進行質(zhì)粒提取。由于使用了 BL21細(xì)胞來繁殖質(zhì)粒，所以將使用PB緩沖液5 X和PE緩沖液3 X來洗滌吸附柱的修改形式并入標(biāo)準(zhǔn)制造商方案以便得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。使用在20 μ I反應(yīng)物中的PstI來消化質(zhì)粒以確保線性片段的尺寸正確。6種質(zhì)粒中的3種為正確的尺寸，將其裝運至昆塔納生物科學(xué)公司以便使用弓I物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003和EL1006 (表I)進行測序。DNA測序結(jié)果顯示全部3種質(zhì)粒均是正確的。挑選一種并命名為質(zhì)粒EWL244(圖8和9A-B ;序列標(biāo)識號3)。V)構(gòu)津來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細(xì)菌PET200D下游的質(zhì)粒MCM376-MVK。使用英杰公司的Platinum HiFi PCR混合物、使用引物MCM161和MCM162 (表I)對來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細(xì)菌下游操縱子(圖10A-C ;序列標(biāo)識號4)的MVK ORF進行PCR擴增。將45 μ L的PCR混合物與I μ L模板、I μ L引物(每種引物的濃度分別為10 μ Μ)以及2μ L水合并。對反應(yīng)進行如下循環(huán)在94°C下2:00分鐘；在941下0:30分鐘、在55°C下0:30分鐘，并且在68°C下1:15分鐘，循環(huán)30次；然后72°C下7:00分鐘，并且在4°C下直至冷卻。根據(jù)制造商的方案將3 μ L的該PCR反應(yīng)物連接至英杰公司的PET200D質(zhì)粒。將
3μ L的該連接體引入英杰公司的Τ0Ρ10細(xì)胞，并且在LA/kan50上選擇轉(zhuǎn)化株。分離來自轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒，并對插入子測序，得到MCM376 (圖11A-C)。vi)構(gòu)津菌株 EWL251(BL21(DE3)、Cm-GIl. 2-KKDyI、pTrc P. alba~mMVK)使MCM331細(xì)胞(其包含編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶和IPP異構(gòu)酶的染色體構(gòu)建體gil. 2KKDyI)在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I的細(xì)胞懸液與I μ I的質(zhì)粒EWL244混合。將細(xì)胞懸液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細(xì)胞，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細(xì)胞在30°C下生長2小時而使其恢復(fù)。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及5mM甲羥戊酸的平板上選擇轉(zhuǎn)化株，并在37°C下溫育。選擇一個菌落并命名為菌株EWL251。vii)構(gòu)津菌株 EWL256 (BL21 (DE3) .Cm-GIl. 2~KKDvKpTrc P. alba-mMVK.pCL 卜游MVA)。使EWL251細(xì)胞在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。使50 μ I的細(xì)胞懸液與I μ I的質(zhì)粒MCM82 (包含pCL Ptrc上游途徑(也稱為“pCL上游MVA”)，編碼糞腸球菌mvaE和mvaS)混合。如國際專利公開No. WO 2009/076676A2的實例8和美國專利申請No. 12/335, 071 (美國專利公開No. 2009/0203102)中所述構(gòu)建質(zhì)粒pCL Ptrc上游途徑。將細(xì)胞懸液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25yFd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細(xì)胞中。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細(xì)胞在30°C下生長2小時而使其恢復(fù)。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及50 μ g/μ I大觀霉素的平板上選擇轉(zhuǎn)化株，并在37°C下溫育。挑選一個菌落并命名為菌株EWL256。 表I :引物序列
引福名稱 I弓丨物序列.............................................................................................................................................................................................—
IiCMBO P^C^TTGCACCCGGCAGA (序列標(biāo)~ —
.....GB'Cmlw^TAAA^GCATGCTCCAOAcT^ 列標(biāo)瓦號15)
MVDFor GACTGGCCT(^ATGAAAGcTfW#i0x^- 16)..........................................................................................................—^
MVDRev CAAACATGTGGCATGGAAAG (序列標(biāo)識號 17)~
MCMl 82 GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTCTGCAGTTAGCGTTCAAAC GGCAGAA (序列標(biāo)識號18)
MCMl92 CGCATGCATGTCATGAGATGTAGCGTGTCCACCGAAAA (序列標(biāo)
__識號 19)___
MCM65 ACAATTTCACACAGGAAACAGC (序列標(biāo)識號 20)""
MCM66 CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG (序列標(biāo)識號 21)^
EL1000 GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC (序列標(biāo)識號 22)^
MCM165 GCGAACGATGCATAAAGGAGGTAAAAAAACATGGTATCCTGTTC TGCGCCGGG
__TAAGATTTACCTG (序列標(biāo)識號 23 ) __
MCM177^— GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTT__GC (序列標(biāo)識號24)___
ELlOOl GATAGTAAeGGCTGCGCTGCTACC i 序列標(biāo)識夸'
EL1006^^GACAGCTTATCATCGACTGCACG (序列標(biāo)識號 26)— ^
MCM161 CACCATGGTATCCTGTTCTGCG (序列標(biāo)識號 27 )_
MCM162 TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (序列標(biāo)識號 28 )
viii)構(gòu)律菌株 RM111608-2(Cm-GIl. 2-KKDvI, DTrc P. alba~mMVK, pCL h游 MVA、pBBRCMPGIl. 5~pgl)使用復(fù)制質(zhì)粒pBBRlMCS5 (慶大霉素)(由路易斯安那州立大學(xué)的K. Peterson博士獲得)時的ybhE基因(編碼大腸桿菌6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶)的組成型表達來構(gòu)建產(chǎn)生異戊二烯的大腸桿菌BL21菌株(EWL256)。從德國的基因橋股份有限公司(Gene Bridges GmbH)獲得基于FRT的重組表達盒、用于Red/ET介導(dǎo)的整合及抗生素標(biāo)記環(huán)出的質(zhì)粒。根據(jù)基因橋公司的方案使用這些材料來執(zhí)行工序。根據(jù)制造商的方案使用Stratagene Herculase II融合試劑盒將引物Pgl-F (序列標(biāo)識號29)和PglGIl. 5-R (序列標(biāo)識號30)用于擴增得自FRT-gb2-Cm_FRT模板的抗性表達盒。PCR反應(yīng)(50 μ L的最終體積)包含5 μ L緩沖液、I μ L模板DNA (得自基因橋公司的FRT-gb2-Cm-F)、10皮摩爾的每種引物，以及I. 5 μ L 25mM dNTP混合物，使用dH20將體積增至50yL。對反應(yīng)進行如下循環(huán)1X2分鐘，95°C，然后進行(在95°C下30秒、在63°C下30秒、在72°C下3分鐘)的30次循環(huán)。
所得的PCR產(chǎn)物使用QlAquicf PCR純化試劑盒(來自凱杰公司)來純化，并通過電穿孔進入如下具有包含pRed-ET重組酶的質(zhì)粒的電感受態(tài)MG1655細(xì)胞內(nèi)。如下制備細(xì)胞使其在5ml L-肉湯中于30°C下生長至0D600為約O. 6。通過加入4%阿拉伯糖來誘導(dǎo)細(xì)胞進行重組酶表達，并使細(xì)胞在30°C下生長30分鐘，隨后在37°C下生長30分鐘。將I. 5ml細(xì)胞的等分試樣在冰冷的dH20中洗滌3至4次。將最終的細(xì)胞沉淀重新懸浮在40 μ L的冰冷dH20中，并加入2至5 μ L的PCR產(chǎn)物。在Imm間隙的比色皿中，使用Gene Pulser電穿孔儀(來自伯樂有限公司)在I. 3kV下進行電穿孔。將細(xì)胞在30°C下恢復(fù)I至2小時，然后使其平鋪在含有氯霉素(5μ g/mL)的L瓊脂上。通過PCR來分析五個轉(zhuǎn)化株，并使用與整合位點側(cè)面相接的引物來測序(2個引物組pgl和49rev以及3' EcoRV-pglstop ;底部Pgb2和頂部GB’ s CMP(946))。選擇正確的轉(zhuǎn)化株，并將該菌株命名為MG1655GI1. 5_pgl: :CMP。使用MG1655GI1. 5-pgl: :CMP的染色體DNA作為模板以產(chǎn)生包含F(xiàn)RT-CMP-FRT-GI1. 5-ybhE構(gòu)建體的PCR片段。將該構(gòu)建體如下克隆到pBBRlMCS5 (慶大霉素)中。使用5'弓丨物Pglconfirm-F(序列標(biāo)識號31)和3'引物3' EcoRV-pglstop (序列標(biāo)識號32)將在此稱為CMP-GI1. 5-pgl的片段擴增。按照制造商的建議，使用英杰公司的TOPO-Blunt克隆試劑盒將所得的片段克隆到質(zhì)粒載體pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0中。將包含CMP-GI1. 5-pgl片段的NsiI片段克隆到pBBRlMCS5(慶大霉素)的PstI位點中。制備包含5μ I CMP-GI1. 5-pgl插入片段、2 μ I pBBRlMCS5 (慶大霉素)載體、I μ I T4DNA連接酶(來自紐英倫生物技術(shù)公司)、2 μ I 10Χ連接酶緩沖液以及10 μ I (1(1!120的2(^1連接反應(yīng)物。將連接混合物在室溫下溫育40分鐘，然后使用以上公開的參數(shù)通過電穿孔使2至4μ L所述連接混合物進入電感受態(tài)ToplO細(xì)胞(來自英杰公司)內(nèi)。在含有10μ g/ml氯霉素和5ug/ml慶大霉素的L瓊脂上挑選轉(zhuǎn)化株。使用許多以上所述的引物以及由位于加利福尼亞州的Sequetech公司(Sequetech,CA)提供的內(nèi)部引物T3和反向引物來確定所選克隆的序列。將該質(zhì)粒命名為pBBRCMPGIl. 5-pgl (圖12、13A-B，序列標(biāo)識號6)。如本文所述將質(zhì)粒pBBRCMPGIl. 5-pgl電穿孔到EWL256內(nèi)，并且將轉(zhuǎn)化株平鋪在含有氯霉素( ο μ g/mL)、慶大霉素(5 μ g/mL)、大觀霉素(50 μ g/mL)和羧芐青霉素(50 μ g/mL)的L瓊脂上。選擇一個轉(zhuǎn)化株并命名為菌株RMl11608-2。
引物:Pgl-F5， -ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(序列標(biāo)識號29)PglGIL 5-R5，-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(序列標(biāo)識號 30)3' EcoRV-pglstop
5’ -CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC (序列標(biāo)識號 31)pgl+49rev CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG (序列標(biāo)識號 32)Bottom Pgb2 :GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC (序列標(biāo)識號 33)Top GB，s CMP(946) :ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(序列標(biāo)識號 34)Pglconfirm-F5’ -ACCGCCAAAAGCGACTAAITTTAGCT-3’ (序列標(biāo)識號 35)實例2 :通過來自大腸桿菌的質(zhì)粒的ybhE (pgl)的組成型表達來改進異戊二烯的
牛產(chǎn)此實例顯示與以野生型水平表達ybhE的對照菌株(即EWL256)相比在組成型表達大腸桿菌ybhE(pgl)的菌株中異戍二烯的生成?；騳bhE(pgl)編碼抑制異源表達的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯后葡糖?；拇竽c桿菌6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶并改進產(chǎn)物的溶解度和收率，同時還提高通過磷酸戍糖途徑的生物質(zhì)收率和流量(Aon et al. , Applied andEnvironmental Micrrobiology74 (4) :950-958, 2008 (Aon 等人，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》第74卷第4期第950-958頁，2008年))。I)小規(guī)模分析培養(yǎng)基配方(每升發(fā)酵培養(yǎng)基):Κ2ΗΡ0413·6g、KH2PO413. 6g、MgS04*7H20 2g、一水檸檬酸2g、檸檬酸鐵銨0. 3g、(NH4) 2S043. 2g、酵母提取物lg、1000X痕量金屬溶液1ml。將所有組分一起加入并溶解在去離子水中。使用氫氧化銨(30% )將pH調(diào)節(jié)至6. 8，然后定容。使用0. 22微米過濾膜對培養(yǎng)基進行過濾滅菌。在滅菌和調(diào)節(jié)pH后加入葡萄糖5. Og和抗生素。1000X痕量金屬溶液(每升發(fā)酵培養(yǎng)基)一水檸檬酸40g、MnS04*H20 30g、NaCl 10g、FeS04*7H20 lg、CoC12*6H20 lg、ZnS04*7H20 lg、CuS04*5H20 IOOmg、H3BO3 100mg、NaMo04*2H20100mg。以每次溶解一種組分的方式將各組分溶解在去離子水中。使用HCl/NaOH來將pH調(diào)節(jié)至3. 0，然后將溶液定容，并使用0. 22微米過濾膜來過濾滅菌。(a)實驗稈序通過使菌株在得自MicroReactor Technologies有限公司的Cellerator 中生長來分析異戊二烯的生成。24孔的每一個中的工作容積為4. 5mL。將溫度維持在30°C下，pH設(shè)定值為7. 0，氧氣流量設(shè)定值為20SCCm并且攪拌速率為800rpm。將從冷凍小瓶中取出的大腸桿菌菌株的接種物劃線接種到LB肉湯瓊脂平板(具有抗生素)上，然后在30°C下溫育。將單個菌落接種到具有抗生素的培養(yǎng)基中，并使其生長過夜。將細(xì)菌稀釋到具有抗生素的4. 5mL培養(yǎng)基中，達到在550nm處測得的O. 05光密度。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(來自安捷倫公司(Agilent))頂空分析法來進行異戊二烯的尾氣分析。樣品的制備如下將100 μ L的全部肉湯放置于密封的GC小瓶中，并在30°C下溫育30分鐘的固定時間。在由70°C下溫育5分鐘組成的加熱殺菌步驟之后，將樣品加載到GC上。在運行過程中使用酶標(biāo)儀(Spectramax)獲得550nm波長處的光密度(OD)。通過將異戊二烯濃度(μ g/L)除以O(shè)D讀數(shù)和時間(小時)來獲得比產(chǎn)率。在200和400 μ M IPTG誘導(dǎo)水平下評估兩種菌株EWL256和RMl 1608-2。在誘導(dǎo)后
1、2. 5、4. 75和8小時分析樣品的異戊二烯產(chǎn)量和細(xì)胞生長(0D550)。制備雙份試樣。 (b)結(jié)果實驗表明，與對照菌株相比，在2種不同濃度的IPTG下，表達ybhE (pgl)的菌株的異戊二烯比產(chǎn)率具有顯著的2到3倍的增長。ii)在15L規(guī)模下來自表達Cm-GI1.2-KKDyI、馬氏產(chǎn)甲烷球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶以及ybhE(pgl) (RMl11608-2)且分批補料的培養(yǎng)物中生長的大腸桿菌的
異戊二烯發(fā)酵。培養(yǎng)基配方(每升發(fā)酵培養(yǎng)基)Κ2ΗΡ047· 5g、MgS04*7H20 2g、一水朽1檬酸2g、朽1檬酸鐵銨O. 3g、酵母提取物O. 5g、1000X改進的痕量金屬溶液1ml。將所有組分一起加入并溶解在去離子水中。對該溶液進行高壓滅菌。使用氫氧化銨(30%)將pH調(diào)節(jié)至7.0，然后定容。在滅菌和調(diào)節(jié)PH之后加入葡萄糖10g、鹽酸硫胺素O. Ig和抗生素。1000 X改進的痕量金屬溶液一水檸檬酸40g、MnSO4^H2O 30g、NaCl 10g、FeS04*7H20 lg、CoCl2*6H20 lg、ZnS04*7H20 lg、CuS04*5H20 lOOmg、H3BO3 100mg、NaMo04*2H20IOOmgo以每次溶解一種組分的方式將各組分溶解在去離子水中，用HCl/NaOH將pH調(diào)節(jié)為3. 0，然后定容，并使用0. 22微米過濾膜來過濾滅菌。在具有BL21 (DE3)大腸桿菌細(xì)胞的15L生物反應(yīng)器中進行發(fā)酵，該BL21 (DE3)大腸桿菌細(xì)胞包含甲羥戊酸(MVA)途徑上游(pCL上游)、整合的MVA途徑下游(gil. 2KKDyI)、來自馬氏產(chǎn)甲燒球菌的甲輕戍酸激酶和來自銀白楊的異戍二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)的高效表達、以及大腸桿菌pgl(pBBR-pgl)的高效表達。進行該實驗以監(jiān)測在期望的發(fā)酵pH7. O和溫度34°C下從葡萄糖中形成的異戊二烯。將冷凍小瓶的大腸桿菌菌株解凍并接種至胰蛋白胨-酵母提取物培養(yǎng)基中。在種菌生長至OD為1.0(在550nm處測量)之后，將500mL用于在15L生物反應(yīng)器中接種，使初始體積為5L。以指數(shù)速率進料葡萄糖，直至細(xì)胞達到靜止期。在此之后，減少葡萄糖進料以滿足代謝需求。在40小時(59小時)的發(fā)酵期間遞送到生物反應(yīng)器的葡萄糖總量為3. Ikg(在59小時為4. 2kg)。通過加入IPTG來完成誘導(dǎo)。當(dāng)在550nm處的光密度(OD55tl)達到為4的值時，IPTG濃度變?yōu)?10 μ M。當(dāng)OD55tl達到150時，IPTG濃度升至192 μ Μ。在生物反應(yīng)器內(nèi)的OD55tl隨著時間推移的分布顯示在圖14Α中。使用Hiden質(zhì)譜儀測定來自生物反應(yīng)器的尾氣中的異戊二烯含量。在發(fā)酵過程中異戊二烯滴度在40小時處增加至33. 2g/L的最大值(在59小時處為48. 6g/L)(圖14B)。在發(fā)酵過程中異戊二烯滴度在40小時處增加至40. 0g/L的最大值(在59小時處為60. 5g/L)(圖14C)。在40小時(59小時)的發(fā)酵期間產(chǎn)生的異戊二烯的總量為281. 3g (在59小時為451. Og)，并且產(chǎn)量的時間進程顯示在圖14D中。體積產(chǎn)率的時間進程顯示在圖14E中，并且顯示在O至40小時之間維持I. Og/L/h的平均速率(在19和59小時之間為I. 4g/L/h)。如通過CER所測定的代謝活性分布顯示在圖14F中。在發(fā)酵期間參與產(chǎn)生異戊二烯所利用的碳的摩爾產(chǎn)率在40小時為19. 6%(在59小時為23.6% )。得自葡萄糖的異戊二烯重量百分比產(chǎn)率在40小時為8. 9% (在59小時為10. 7% )。實例3:由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯的回收由一組四個14L規(guī)模的發(fā)酵罐以兩步操作來回收異戊二烯，該兩步操作涉及通過吸附到活性炭來將異戊二烯從發(fā)酵尾氣流中脫除、隨后是離線水蒸汽解吸和冷凝從而得到液態(tài)異戊二烯(圖16A和16B)。由四個發(fā)酵罐產(chǎn)生的異戊二烯的總量為1150g(16. 9mol)，其中953g(14m0l，83%)被碳過濾器吸附。在蒸汽解吸/冷凝步驟之后，回收的液態(tài)異戊二烯的量為810g，對應(yīng)于70%的總回收率。分析回收的異戊二烯，確定是否存在雜質(zhì)。對異戊二烯液體的分析及其雜質(zhì)分布 通過GC/MS和氣相色譜法/火焰離子化檢測(GC/FID)來分析回收的異戊二烯液體，從而確定雜質(zhì)的性質(zhì)和含量。測得產(chǎn)物的純度> 99. 5%，并且除了多種微量組分之外，該產(chǎn)物包含幾種主要雜質(zhì)。GC/FID色譜圖在圖17中示出，并且雜質(zhì)的代表性含量在表19中示出。雜質(zhì)分布類似于以該規(guī)模產(chǎn)生的其他異戊二烯批次的分布。表2:在由可再生資源產(chǎn)生的幾批異戊二烯中觀察到的雜質(zhì)的性質(zhì)和含暈匯總
化厶物1........................................................................._一—.J濃度范s
■.…GC/MSGC/m
.....乙.蜂1.591 .89<50ppm
丙 同1.62412.673<1 OOppm
甲基丙烯酸·1.85115.369<200ppm
甲基乙烯酮1.92316.333<20pp_
乙酸乙釀2.03717.145100 至 800ppm
3-f# 2.2718.87550 至 SOOppm
I濃度范圍 I (K.7MS(；('/!■[[)
丙卻2.54819.931<100ppm ^
異戌二烯醇2,96221.583<500ppm
3-甲基-I-丁醇2.9921.783<50ppm
3-己烯-I-醇4.01924.819<\ (Kippm
異戌烯乙酸酯4.46625.733200至IOOOppm
3-己烯-I-基乙酸酯5.33927.223<400ppm
檸檬烯5.71527.971<500ppm
其他環(huán)狀化合物__5.50-6.5027.5-28.0<200ppm通過用吸附劑處理來純化由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯業(yè)內(nèi)廣泛地使用吸附劑來從烴原料中移除痕量雜質(zhì)。合適的吸附劑包括基于沸石、氧化鋁和二氧化硅的材料。通過在硅膠上經(jīng)過能將由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯基本上純化，并在較小程度上使用氧化鋁。圖18顯示在處理之前(A)以及在使用氧化鋁(B)或二氧化硅(C)處理后的異戊二烯樣品的GC/FID色譜圖。來自巴斯夫公司(BASF)的Selexsorb 吸附劑產(chǎn)品是用于從由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯中移除極性雜質(zhì)的優(yōu)選的吸附劑之一。具體地講，考慮到Selexsorb ⑶和⑶X產(chǎn)品具有經(jīng)證實的從異戊二烯和丁二烯原料中移除極性雜質(zhì)的效用，因此它們是優(yōu)選的。實例4 :構(gòu)律菌株MCM518-521和528-531 λ啟動子驅(qū)動糖合的mKKDvIPl轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠使至多IOOkb的DNA在細(xì)菌菌株之間移動(Thomason等人，2007年)。通過使用Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)將來自大腸桿菌K12MG1655的一片細(xì)菌染色體移動至大腸桿菌BL21 (DE3)來置換在大腸桿菌BL21 (DE3)中的17，257bp缺失(參見圖20)。 采用使用不同的可選擇標(biāo)記的兩種策略來鑒定包含重組的細(xì)菌染色體的菌落。首先，將抗生素標(biāo)記插入接近待轉(zhuǎn)移的17，257bp序列的基因中，該序列的缺失不會對菌株不利。包含該抗生素標(biāo)記的菌株將可能具有與所述標(biāo)記同時轉(zhuǎn)導(dǎo)的17，257bp的一片細(xì)菌染色體。在這種情況下，將編碼卡那霉素抗性(“kanK”)的基因插入編碼未知功能的126種氨基酸蛋白質(zhì)的ybgS基因內(nèi)。其次，因為已知的是在利用半乳糖的過程中涉及的若干基因靠近在待轉(zhuǎn)導(dǎo)至大腸桿菌BL21(DE3)的17，257bp碎片中的pgl，所以使用得自大腸桿菌K12MG1655 (其包含在大腸桿菌BL21 (DE3)中缺失的17，257bp序列)的Pl溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)且在包含 O. 4% (w/v)半乳糖的 M9 培養(yǎng)基(6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4、O. 5g/L NaCl、O. 5g/LNH4CUO. ImMCaCl2,2mM MgSO4)中分離的菌落將可能包含17，257bp的一片細(xì)菌染色體。根據(jù)制造商的方案使用Stratagene Herculase II融合試劑盒(得自位于加利福尼亞州拉荷亞市的安捷倫科技有限公司的Stratagene產(chǎn)品部(Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,California)),將引物MCM120(序列標(biāo)識號36)和MCM224(序列標(biāo)識號37)用于擴增來自基因橋公司FRT-gb2-Cm_FRT模板的氯霉素抗性(“CmK)表達盒。對四次50 μ L PCR反應(yīng)進行如下循環(huán)95°C /2分鐘、95°C /20秒、55°C /20秒、72°C/1分鐘，循環(huán)30次；并且72°C/3分鐘。然后將反應(yīng)物冷卻至4°C。根據(jù)制造商的方案將四種反應(yīng)物合并、加載到凱杰公司的PCR柱上，然后使用55°C下的60 μ L洗脫緩沖液(“ΕΒ”)洗脫。使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)①|(zhì)粒pRedET-羧芐青霉素R (來自位于德國海德堡的基因橋公司)電穿孔到大腸桿菌BL21(DE3)菌株MCM446(CmK，gil. 6mKKDyI A1-3)內(nèi)。通過在30°C的SOC培養(yǎng)基中振蕩一小時來使轉(zhuǎn)化株恢復(fù)，然后在LB+50 μ g/mL羧芐青霉素(“LB/carb50”)平板上于30°C下培養(yǎng)過夜，選擇出轉(zhuǎn)化株。將羧芐青霉素抗性菌落冷凍為菌株MCM508。使來自新劃線的菌株MCM508在30°C下的5mL LB/carb50中生長至OD6tltl為約0. 5。此時，加入40mM L-阿拉伯糖，然后將培養(yǎng)物在37°C下溫育I. 5小時。然后通過離心收集細(xì)胞、如上所述使3 μ L純化的擴增子通過電穿孔進入細(xì)胞，然后使細(xì)胞在37°C下的500 μ LSOC培養(yǎng)基中恢復(fù)I. 5至3小時。在37°C下的LB+ΙΟμ g/mL卡那霉素(LB/kanl0)平板上挑選轉(zhuǎn)化株。通過使用弓丨物GB-DW (序列標(biāo)識號38)和MCM208 (序列標(biāo)識號39)的PCR來確認(rèn)在目標(biāo)基因座處的擴增子重組。對所得的擴增子測序，以鑒定具有以下所列的序列的四種克隆。將四種對羧芐青霉素敏感的克隆冷凍為菌株MCM518-MCM521。將菌株MCM518-MCM521再次劃線接種至LB/kanl0上并在37°C下生長過夜。挑選菌株MCM518-MCM521的菌落,在37°C下的LB/kanlO中培養(yǎng)并使用質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化,所述質(zhì)粒編碼酵母Flp重組酶、氯霉素和氨芐青霉素抗性基因并賦予宿主細(xì)胞溫度敏感性復(fù)制體(Cherepanov, P. P. et al. , Gene 158(1) :9-14(1995) (Cherepanov, P. P.等人，《基因》，第158卷第I期第9-14頁，1995年))。通過使細(xì)胞在500 μ LSOC培養(yǎng)基中在30°C下振蕩I小時而使細(xì)胞恢復(fù)。通過在LB/carb50平板上于30°C下培養(yǎng)過夜而選擇出轉(zhuǎn)化株。次日早晨，使來自各個平板的菌落在30°C下的LB/carb50培養(yǎng)基中生長直至明顯渾濁。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至37°C并維持至少3小時。將細(xì)胞從該培養(yǎng)物劃線到LB平板上，并在37°C下生長過夜。次日，將菌落影印到LB、LB/carb50和LB/kanlO上。將對羧芐青霉素和卡那霉素均敏感(即，不會在carb50和kanlO上生長)的克隆培養(yǎng)在液體LB中，并冷凍為菌株MCM528-MCM531。表3 :大腸桿菌菌株
權(quán)利要求
1.一種能夠產(chǎn)生異戊二烯的大腸桿菌(E.coli)菌株的重組細(xì)胞或其子代，所述細(xì)胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在所述大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸； 其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且 其中所述所得的重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞的該滴度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB 和 modC。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、galT 和 galE。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝和編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代謝多肽選自 galM、galK、galT 和 galE。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中編碼所述PGL多肽、半乳糖代謝多肽和鑰攝取多肽的核酸是如圖20中所示17，257堿基對片段的一部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的比產(chǎn)率高于不包含(a)和(b)的相同細(xì)胞的該比產(chǎn)率。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述比產(chǎn)率為至少15mg/0D/h。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述編碼PGL多肽、鑰攝取多肽和/或半乳糖代謝多肽的核酸來自大腸桿菌菌株K12MG1655或為大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株B。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，還包含(c)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，還包含(d)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)；以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代謝多肽選自 galM、galK、galT 和 galE。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽來自銀白楊(Populus alba)。
21.—種產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括 (a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求I或7所述重組細(xì)胞的組合物，以及 (b)產(chǎn)生異戊二烯。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，還包括回收所述異戊二烯。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述重組細(xì)胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產(chǎn)率。
24.一種產(chǎn)生甲羥戊酸的方法，所述方法包括 (a)在適于產(chǎn)生甲羥戊酸的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求15所述重組細(xì)胞的組合物，以及 (b)產(chǎn)生甲羥戊酸。
25.一種制備根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組細(xì)胞的方法，包括 (a)將編碼PGL多肽的異源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細(xì)胞不包含編碼PGL多肽的核酸； (b)使所述編碼PGL多肽的核酸整合在所述大腸桿菌染色體中；以及 (c)將編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸引入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。
26.一種包含根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的重組細(xì)胞的組合物。
全文摘要
本文提供用于增大異戊二烯產(chǎn)量的改良組合物和方法。本文還提供用于增大能夠具有生物活性的異源多肽產(chǎn)量的改良組合物和方法。
文檔編號C12P7/00GK102906268SQ201080064358
公開日2013年1月30日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者Z·Q·貝克, M·A·塞爾溫, A·T·尼爾森, C·M·派瑞斯 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司